의 침묵

본 절차의 전반적인 목표는 SIR A의 형질전환을 통해 B RCA two의 발현을 억제하는 것입니다. 이는 먼저 SIR a 형질전환 시약 복합체를 준비함으로써 수행됩니다. 다음으로, 80% 밀도(confluency)의 세포 단층에 복합체를 한 방울씩 첨가하여 1차 형질전환을 실시합니다. 그 후, 더 높은 SIR A 대 형질전환 시약 비율을 사용하여 2차 SIR a 형질전환을 수행합니다.

마지막으로, 세포 단층을 얼음처럼 차가운 PBS로 세척하고 계면활성제 기반의 용해 버퍼를 사용하여 4°C에서 세포를 용해합니다. 최종적으로, Western blotting 분석을 통해 단백질 수준에서 B RCA A two의 사이런싱을 확인합니다. 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 효율적인 유전자 사이런싱뿐만 아니라 종양 억제제 B RCA two와 같은 고분자량 단백질의 최적 탐지가 가능하다는 점입니다. 먼저, 습윤 챔버 내 37°C 및 5% CO2 조건에서 인간 상피세포 단층을 배양한 후, 성장 배지를 제거하고 상온의 PBS를 사용하여 세포를 세척하십시오.

플레이트에서 세포를 떼어내기 위해 0.25% trypsin 0.53 millimolar EDTA 용액 2 mL를 첨가하고, 세포 종류에 따라 3~5분 동안 배양합니다. 세포를 15 mL 튜브로 옮기기 전, 10% FBS가 포함된 완전 성장 배지 2 mL를 첨가하여 trypsin을 중화합니다. 튜브를 스윙 버킷 로터에 넣고 320~330 Gs, 4 °C에서 3분 동안 원심분리합니다.

Burker 챔버 또는 자동 세포 계수 시스템을 사용하여 세포 수를 측정하기 전, 5 mL의 항생제 없는 배지를 사용하여 펠렛을 재부유시킵니다. 그런 다음 6웰 플레이트의 각 웰에 항생제 없는 배지 2 mL에 희석된 약 0.5~1 × 10⁶개의 세포를 분주하고, 세포 밀도가 80%가 될 때까지 24시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 6 µL의 지질 기반 siRNA 특이적 transfection 시약을 130 µL의 저혈청 배지에 희석하여 1차 transfection을 진행합니다.

10 µM S irna 3 µL를 저혈청 배지 130 µL에 희석합니다. 희석된 irna를 희석된 transfection 시약과 혼합하고 실온에서 5~10분 동안 배양합니다. 배양하는 동안 세포에서 배지를 제거하고 항생제가 없는 신선한 배지 2 mL를 추가합니다.

37 °C에서 예열합니다. 다음으로, 6-웰 플레이트의 각 세포 웰에 siRNA transfection 시약 복합체 250 µL를 첨가합니다. 그런 다음 5% CO2가 포함된 37 °C의 습윤 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.

24시간 후, 10 µM siRNA 5 µL를 저혈청 배지 130 µL에 희석하고, 방금 시연한 것과 같이 두 번째 transfection 단계를 진행합니다. 두 번째 단계에서 sarna의 고농도를 유지하는 것은 B rca의 높은 silencing 효율을 얻는 데 필수적입니다.

면역 블롯팅 분석을 위한 세포 용해물을 준비하기 위해, 분석 전 세포를 37°C에서 1~2일 동안 배양합니다. 여기에 제시된 레시피에 따라 신선한 용해 버퍼를 준비합니다. 세포에서 배지를 제거하고, 세포를 세척하기 위해 웰당 2 mL의 얼음처럼 차가운 PBS를 첨가합니다.

그런 다음 플레이트에서 PBS를 완전히 제거하고, 각 웰에 얼음처럼 차가운 lysis buffer 200 µL를 추가합니다. 플레이트를 부드럽게 회전시켜 lysis buffer를 균일하게 분산시킨 후, rotator에서 4 °C로 15분 동안 배양합니다. 그 후 cell scraper를 사용하여.

세포 용해물을 마이크로 원심분리 튜브에 수집하여 얼음 위에서 17,900 Gs, 4 °C로 25분 동안 원심분리한 후, 면역 블로팅 분석을 수행하기 위해 상층액을 수집하십시오. 20 x tris acetate SDS 러닝 버퍼 50 mL를 증류수 950 mL로 희석하여 러닝 버퍼를 준비하십시오. 샘플을 다음과 같이 준비하십시오.

15 µg의 총 세포 용해물을 첨가합니다. lithium ESAL sulfate pH 8.4가 포함된 4x 샘플 버퍼 5 µL, 0.5 M DTT 2 µL 및 용해 버퍼를 추가하여 총 부피를 20 µL로 맞춥니다. 샘플을 55 °C에서 10분 동안 변성시킵니다.

b RCA two 단백질은 열에 민감하므로 이 온도를 유지하는 것이 매우 중요합니다. 다음으로, 제조사의 지침에 따라 전기영동 챔버를 설정하십시오. 그런 다음 프리캐스트 젤에 10 µL의 고분자량 재염색 단백질 표준물질과 샘플을 로딩하고 120 V에서 약 2시간 동안 전기영동을 수행하십시오.

그동안 20 x 전사 버퍼 50 milliliters, 100% 메탄올 100 milliliters, 그리고 물 850 milliliters를 사용하여 전사 버퍼를 준비합니다. PVDF 막을 100% 메탄올에 5분 동안 담가 활성화합니다. 증류수로 헹군 후, 전사 버퍼에서 최소 5분 동안 평형화합니다.

전사 장치의 스펀지를 사용 전까지 4 °C에서 전사 버퍼에 담가 두십시오. 55 kDa 청색 마커가 프리캐스트 젤을 벗어나기 전에 전기영동을 중단하고, 전사 버퍼에 적신 스펀지 3장을 먼저 배치하여 샌드위치를 조립합니다. 그 다음 전사 버퍼로 포화시킨 3 mm 여과지 1장을 올립니다.

다음으로 젤을 넣고, 활성화된 PVDF membrane을 올린 후, 버퍼에 적신 3M grade paper 한 장과 적신 스펀지 세 장을 차례로 추가합니다. 이 적층물을 장치에 넣고 350 milliamps에서 4시간 동안 4 °C에서 단백질을 전이시키거나, 180 milliamps에서 4 °C로 하룻밤 동안 전이시킵니다. 전이가 완료되면 TBS를 사용하여 membrane을 세척하고, TBST와 5%non-fat dry milk로 1시간 동안 블로킹합니다.

그런 다음 버퍼를 30 µL의 anti BCA2 토끼 다클론 항체가 포함된 9 mL의 TBST milk 버퍼로 교체하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. TBST로 막을 10분씩 세 번 세척한 후, 10 mL의 TBST milk 버퍼에 희석한 1 µL의 horseradish peroxidase 결합 항-토끼 2차 항체와 함께 필터를 1시간 동안 배양합니다. 막을 세 번 세척한 후, 제조사의 지침에 따라 ECL 화학발광 면역 검출을 수행합니다.

고해상도 ECL 필름에서 밴드를 시각화하여 Brca2 사이런싱의 특이성을 확인합니다. 앞서 언급한 바와 같이, Brca2 siRNA와 병행하여 스크램블(scrambled) siRNA를 사용하였습니다. Brca2 사이런싱의 효율을 높이기 위해서는 높은 siRNA-to-transfection 비율로 두 번째 siRNA 트랜스펙션을 수행하는 것이 중요합니다.

여기 결과는 세포 유형에 따라 낮은 siRNA-트랜스펙션 비율과 높은 비율을 사용할 때의 넉다운 효율 차이를 보여줍니다. 최고 수준의 유전자 억제를 얻기 위한 최적의 최소 시간은 두 번째 siRNA 트랜스펙션 이후에 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 이 그림에서 보듯이 NTHY 갑상선 세포의 경우 24시간이면 충분하지만, PNT 1A 전립선 세포에서 효율적인 B RCA A two 넉다운을 위해서는 최대 48시간이 필요합니다. b RCA two 억제는 두 번째 트랜스펙션 후 7일까지 상당히 안정적으로 유지됩니다. 앞서 언급했듯이, 55 °C 이상의 온도에서 세포 용해물을 변성시키면 B RCA A two 단백질의 최대 50%가 손실됩니다.

본 실험에서는 B RCA A two가 억제된 PNT one A 세포를 PARP 억제제인 rucaparib으로 24시간 동안 처리한 후의 민감도를 조사하였습니다. 대조군과 비교하여 B RCA two가 결핍된 PNT one A 세포에서 세포 증식의 시간 의존적 감소가 관찰되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 BRC two 외에도 CRNA를 통해 긴 단백질 코딩 유전자를 억제하는 방법과 최적화된 면역 블로킹 절차를 통해 해당 단백질 생성물을 효율적으로 검출하는 방법에 대해 충분히 이해할 수 있을 것입니다.

이 방법은 다른 많은 까다로운 대형 단백질, 특히 세포 내에서 매우 낮은 수준으로 발현되는 단백질에 적용될 수 있습니다.