동시 생체 기능 테스트로 생체 전위도 시스템

이 절차의 전반적인 목표는 시판되는 생체 내, 망막 전기도 또는 ERG 시스템을 생체 외 어댑터와 함께 사용하여 분리된 마우스 망막의 세포 기능을 평가하는 것입니다. 이것은 먼저 쥐의 양쪽 눈에서 망막을 해부하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 망막 광수용체 쪽을 위로 향하게 하여 표본 홀더에 장착하는 것입니다.

다음으로, 시편 홀더를 in vivo ERG 시스템의 가열판에 놓고 중력 제어 관류에 연결합니다. 마지막 단계는 표본 홀더의 전극을 증폭기에 연결하고 빛으로 망막을 자극하여 ERG 반응을 얻는 것입니다. 궁극적으로, ex vivo ERG는 약리학 및 특수 광 자극 프로토콜을 사용하여 간상 및 원뿔 매개 신호 경로를 해부할 수 있는 방법을 보여주는 데 사용됩니다.

in vivo, ERG 또는 단일 세포 기록과 같은 다른 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 더 높은 신호 대 잡음비, 더 길고 안정적인 기록을 제공할 뿐만 아니라 쉽고 정량적인 약리학적 조작을 가능하게 한다는 것입니다. 또한, 이 방법은 영장류 및 인간 기증자 망막의 망막 질환을 치료하도록 설계된 약물의 효능 및 안전성을 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다. 돔 가장자리를 따라 2액형 5분 에폭시를 사용하고 필요한 경우 해부 현미경을 사용하여 접착제가 마르면 여과지를 돔에 평평하게 누릅니다.

한 달 정도 녹음하는 데 좋습니다. 그런 다음 종이를 제거하고 70% 에탄올로 돔을 청소합니다. 이제 전극을 먼저 준비하기 위해 전극 용액으로 전극 채널을 채웁니다.

기포가 유입되지 않도록 하십시오. 그런 다음 펠릿 전극을 전극 채널에 나사로 고정합니다. 시편 홀더의 상단 및 하단 부분을 4개의 나사로 연결하고 관류 라인을 전극 용액으로 채웁니다.

다음으로, 전극 쌍의 리드 사이의 저항과 전압을 측정합니다. 저항은 100킬로옴 미만이어야 하고 전압은 10밀리볼트 미만이어야 합니다. 채널에 기포가 없고 전극의 상태가 양호한 경우 샘플 관류를 위해 400-700ml의 관류 매체를 유리병에 붓습니다.

또한 해부용으로 300ml를 붓고 냉장고에 보관합니다. 그런 다음 관류 튜브를 열교환기 블록에 넣고 예열된 블록을 가열판에 놓습니다. 이제 가스 주입구와 관류 튜브 주입구가 있는 캡으로 병을 둘러쌉니다.

가스 주입구는 에어스톤에 부착되어야 합니다. 예열된 병을 관류 매체가 섭씨 37도로 유지되는 곳에 놓습니다. 그런 다음 관류 매체로 채워 관류 라인을 프라이밍하여 ocus 과학 시스템에서 중력 구동 흐름을 시작합니다.

소음을 최소화하기 위해 병을 패러데이 케이지 내부에 놓고 표본 홀더의 긴 관류 출력 라인을 사용합니다. 표본 홀더와 관류 병 차폐 수준보다 훨씬 아래에 위치하여 이러한 출력 라인을 연결하고 패러데이 케이지를 통해 차폐를 증폭기의 접지에 연결합니다. 전자기 노이즈가 ERG 신호에 결합되는 것을 방지하려면 온도 프로브를 가열 스테이지에 부착하십시오.

이제 레귤레이터를 사용하여 용액 흐름을 분당 3-5밀리리터로 조정합니다. 마지막으로, 필요한 경우 자동차와 가스를 용액에 넣고 에어스톤에서 기포가 일정하게 흐르도록 조절기를 조정합니다. 표본 홀더의 바닥 부분 전체가 완전히 잠길 수 있도록 큰 페트리 접시에 약 200ml의 냉 관류 용액을 붓는 것으로 시작합니다.

12, 12시간 동안 어두운 빛 주기에서 자란 동물을 안락사시킨 다음 녹음하기 전에 6-12시간 동안 어둡게 적응시킵니다. 다음 절차는 모두 희미한 빨간색 또는 적외선에서 수행해야 합니다. 각 눈을 분리한 후 눈 매체에 넣습니다.

그런 다음 한쪽 눈을 종이에 있는 작은 여과지로 옮깁니다. 핀셋으로 잡고 슬릿의 오라 세라타와 거의 같은 높이로 슬릿을 자릅니다. 오라 세라타를 따라 자르거나 적도에 더 가까운 곳을 잘라 각막과 수정체를 제거합니다.

그런 다음 각막과 수정체 끝을 제거하고 아이컵을 차가운 매체로 다시 옮깁니다. 다른 쪽 눈에도 동일한 절차를 반복합니다. 이제 아이컵을 사용하여 위에서 시신경을 향해 작게 절개합니다.

망막이 가능한 한 손상되지 않도록 망막과 공막 사이에 가위를 두십시오. 그런 다음 절개 부위 양쪽의 공막을 두 개의 핀셋으로 잡고 조직을 분리하여 망막을 분리합니다. 망막을 분리하려면 시신경을 절단하고 원위 표면에 최소한의 접촉으로 망막을 제거합니다.

이제 분리된 망막을 표본 홀더의 돔에 장착합니다. 먼저, 표본 홀더의 바닥 부분을 절개된 망막과 함께 페트리 접시에 담급니다. 다음 슬라이드.

망막 광수용체 또는 볼록한 면이 돔 위로 위쪽으로 향합니다. 그런 다음 표본 홀더를 부드럽게 들어 올려 망막이 여과지에 부착되도록 합니다. 그런 다음 다른 쪽 망막에 대해 절차를 반복합니다.

이제 누화 소음과 신호 션트를 방지하기 위해 홀더 플레이트를 조심스럽게 건조시킵니다. 홀더를 건조시킨 후 상단 부분을 나사로 고정하고 바늘을 사용하여 주사기의 관류 용액으로 관류 채널을 채웁니다. 열교환 블록 옆에 시편 홀더를 놓습니다.

그런 다음 입력 및 출력 관류 라인을 연결합니다. 전극을 ERG 증폭기에 연결하고 자극기 제어 장치를 표본 홀더에 연결하여 설정을 완료합니다. 어댑터 사용 크고 재사용 가능한 반응을 얻으려면 데이터를 수집하기 전에 망막을 조심스럽게 해부하고 장착하는 것이 중요할 뿐만 아니라 망막 위에 안정적이고 기포 없는 관류를 유지하는 것이 중요합니다.

10-20분 정도 기다렸다가 망막의 온도 및 기능 안정화 플래시 반응이 다른 표준 풍부 용액을 사용하여 어둡게 적응된 야생형 C형 57 검은색 6개의 망막에서 기록되었습니다. 응답 파형과 동역학은 ames 매체와 잠금 매체에서 유사하게 나타났습니다. 간상 광수용체의 민감도도 비슷했습니다.

반면에, 중탄산염 또는 탄수화물 반응이 없는 힙 완충 링거 용액에서는 진폭이 상당히 작았습니다. BWA 안정성은 또한 힙의 링거에서 종종 손상되었습니다. 40마이크로몰의 A PB를 추가하면 양의 B 파가 효율적으로 제거되었습니다.

이것은 Mueller 세포 활성에 기인하는 크고 느린 음파를 밝혀냈으며, 100 마이크로 몰의 바륨이 제거되었습니다. 이 성분은 생체 외 ERG 신호의 광수용체 반응을 나타냅니다. 이 방법은 약리학 및 유전학과 같은 다른 도구와 결합하여 인간 망막을 포함한 포유류의 망막 신호 전달 및 실명 질병의 분자 메커니즘에 대한 질문에 답할 수 있습니다.