Name: 말라리아 단백질 바이오 마커 히스티딘 풍부한 단백질-II의 검출을위한 이리듐 (III) 발광 프로브 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: 학습하세요 말라리아 히스티딘 풍부한 단백질-II 바이오마커를 검출하는 이리듐(III) 발광 프로브 합성 및 검증 방법입니다. 이 기술은 빠른 결합 동역학과 광안정성으로 기존 진단법의 한계를 극복합니다.

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이 작업에 대한 지원은 Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care에서 제공했습니다. K.M.D.는 NSF 대학원 연구 펠로우십(2012095464)의 지원을 받았습니다.

1. 이리듐의 합성 (III) 단지 <ol><li> [2 -Cl IR (PPY)] 2, 53.6 mg의 (50 μmol)을 칭량하고 5 ml의 메틸렌 클로라이드에 녹인다. 교반 바가 장착 된 50 mL의 삼각 플라스크에 상기 용액을 추가한다. </li><li> 26.2 mg의 AgOTf (100 μmol)을 칭량하고, 메탄올 5 ㎖에 용해. </li><li> 용해에 AgOTf [IR (PPY) 2 -Cl]이 솔루션을 추가하고 1 시간 동안 교반. 참고 : 크림 컬러 슬러리 발생한다. </li><li> 1 시간 후, 25 X 95mm의 DRAM 바이알로 실리카 겔을 통해 슬러리를 필터링하고, 회전 증발기 (5-10 분)을 이용하여 잔류 용매를 증발시켰다. </li><li> 대부분의 용매가 제거되면, 황색 오일성 잔류 물을 유리 병에 남아 있는지 확인한다. 이 잔류 물에, 생성물을 재용 해하고 황색 고체 생성물을 수득 1-2일 동결 건조하는 1 ml의 메탄올을 추가한다. </li><li> &lt;H 의해 IR (PPY) 2 (H 2 O) 2 + 생성물 (IR1)을 특성화SUP&gt; 1 NMR, ESI 및 UV-비스 (CDCl3 중) 전술 한 바와 같이. (23) </li></ol> 각종 아미노산과 IR1 2. 상호 작용 <ol><li> 메탄올 IR1의 2 mM의 용액 (MW 537.10 g / 몰) 준비합니다. 소용돌이는 고체의 완전 용해를 보장합니다. </li><li> HEPES에 다음과 같은 아미노산 및 생체 분자의 100 μm의 솔루션은 그의, 일드는리스가 빼앗아가, 발을 시도 식염수 (HBS, 100 mM의 HEPES, 137 mM의 염화나트륨, pH를 7.4) 알라, ASP, 시스테인을, 버퍼 준비합니다. </li><li> 블랙 96- 웰 플레이트에 각 아미노산 100 ㎕ 피펫. 빈 역할을하는 판에 HBS 100 μl를 추가합니다. </li><li> 각 샘플에 2 mM의 IR1 솔루션의 2.5 μl를 추가하고 10 분 동안 접시 통에 접시를 흔들. </li><li> 10 분 후, 96- 웰 플레이트 판독기 (365 EX / EM 400-700)를 사용하여 시료의 발광 스펙트럼을 획득. <ol><li> 악기에 접시를 놓고 새로운 실험을 설정하는 플레이트 리더 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> 새로운 특급 설정eriment 365 나노 미터의 여기 파장 및 상부 위치에 광학 9 nm의 슬릿 폭과 형광 검사를 판독한다. </li><li> 5 nm의 스텝 크기 300-700 nm의에서 방출을 읽어보십시오. </li><li> 데이터 분석을위한 데이터를 내 보냅니다. </li></ol></li><li> 맑은 96 웰 플레이트 및 이미지 UV transilluminator가 발광을 이용한 샘플을 이동. </li></ol> BNT-II와 IR1 3. 적정 <ol><li> HBS에서 BNT-II (MW 8233.6 g / 몰)의 1 mM의 주식 솔루션뿐만 아니라 메탄올 IR1의 2 mM의 솔루션을 준비합니다. </li><li> 원액에서 HBS 100 μm의 BNT-II 1 ㎖를 준비합니다. 시료가 혼합 보장하기 위해 microcentrifuge 관을 소용돌이. </li><li> 직렬 1.56 μM BNT-II의 최종 농도에서 절반으로 HBS 100 μM BNT-II 희석. </li><li> HBS는 96 웰 플레이트에, 빈 역할을 함께 중으로, 각 희석 100 μl를 추가합니다. 각 샘플에, 2 mM의 IR1의 2.5 μl를 추가합니다. </li><li> 쉬접시 통에 10 분 동안 판 아케. </li><li> 진탕 후, 96- 웰 플레이트 판독기를 사용하여 510 나노 미터 (365 nm에서 여기)에서 발광 강도를 판독. <ol><li> 악기에 접시를 놓고 새로운 실험을 설정하는 플레이트 리더 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> 510 내지 365 nm이고, 발광 파장의 여기 파장과 형광 엔드 포인트를 판독하는 새로운 실험을 설정한다. 상단 위치에 광학, 9nM이다에게 모두 파장의 슬릿 폭을 설정합니다. </li><li> 판을 읽고 분석을 위해 데이터를 내보낼 수 있습니다. </li></ol></li><li> 맑은 96 웰 플레이트 및 이미지의 UV transilluminator가을 이용하여 적정을 샘플을 옮긴다. </li></ol> Biolayer 간섭계를 사용하여 IR1 / BNT-II 시스템 4. 실시간 운동 분석 <ol><li> 운동 버퍼의 200 μl를 추가, 검은 96 웰 플레이트의 첫 번째 열에 8 우물 (KB 1X 인산 0.02 % 트윈 20 완충 식염수)와 플라스틱 센서에 플레이트를 삽입홀더. 조심 팁 버퍼 웰에 현탁되도록 플라스틱 홀더에 제 8 열에 니켈 (II) NTA 바이오 센서를 옮긴다. 간섭 악기의 왼쪽에있는 플라스틱 홀더를 배치합니다. </li><li> KB에서 BNT-II의 0.5 μm의 솔루션의 2 ml의를 준비합니다. </li><li> KB에서 IR1의 10 μm의 솔루션의 500 μl를 준비하고, 직렬 KB에서 0.156 μM까지 절반으로 희석. </li><li> 새로운 블랙 96 웰 플레이트, 피펫 열 및 C의 모든 8 우물에 KB의 200 μL로 </li><li> 같은 접시에, 열 B에있는 우물에 0.5 ㎛ BNT-II 솔루션의 피펫 200 μL </li><li> 피펫 잘 D1에서 빈으로 KB로 시작하는 열 D에 IR1의 각 희석, 200 μL. 우물은 열 아래 IR1 농도가 증가되도록 희석을 추가합니다. </li><li> 사전 - 적심을 포함하는 센서 판의 오른쪽 기기에서이 판을 놓는다. </li><li> biolayer 간섭 소프트웨어에서 기본 kinet을 설정판, 분석, 센서 팁을 정의하여 IC 실험. <ol><li> 판을 정의하려면, 화면에 열을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 우물에 대한 적절한 정의를 선택합니다. 열 D에 대한 열 B에 대한 열 A와 C는 &quot;버퍼&quot;, &quot;로드&quot;및 &quot;샘플&quot;을 선택 </li><li> ( &quot;추가&quot;를 클릭) 다음 단계를 추가하여 다음 탭에서 분석을 정의 평형 (사용자 정의), 60 초; 로드, 120 초; 베이스 라인, 60 초; 협회, 120 초; 해리, 300 초. 평형 단계를 선택하고 (B 열), 기준 (C 열), 협회 (D 열), 해리 (열 C)를 넣기 위해 열 A의 반복을 두 번 클릭합니다. 니켈 (II) NTA 센서를 선택합니다. </li><li> 다음 탭으로 이동하고 센서 플라스틱 센서 홀더 컬럼에 있는지 확인합니다. </li><li> , 파일 이름을 삽입, 실험이 제대로 설명되어 확인 &quot;지연 실험&quot;이 선택되어 있는지 확인하고 언론은 &quot;이동합니다.&quot; NOTE는 : 운동 실험이 설명되면 프로그램으로 기기의 자동화 된 특성으로 인해, 단계가 발생합니다. </li></ol></li><li> 운동 실행이 완료되면, 제공된 프로세싱 소프트웨어에서 데이터를 처리한다. <ol><li> 왼쪽에있는 패널의 맨 아래 부분에 대한 관심의 파일 이름과 폴더를 더블 클릭합니다. 그런 다음, 패널의 상단 부분에 &quot;키​​네틱&quot;에 해당 폴더를 두 번 클릭합니다. 처리 탭으로 이동합니다. </li><li> 센서 선택 화면을 엽니 다 왼쪽에있는 빼기 상자를 선택합니다. 오른쪽 잘 A4 클릭하고 참조 음에 잘 유형을 변경합니다. </li><li> Y 축 정렬 옆의 확인란을 선택하고, 선택된 단계는베이스 라인되어 있는지 확인합니다. 베이스 라인의 마지막 5 초 (약 55 ~ 60 초)로 시간 범위를 지정합니다. </li><li> 간 단계의 보정에 대한 상자를 선택하고 해리에 정렬을 선택합니다. Savitzky - 골 레이 필터 상자를 선택하고 Enter를 누르 &quot;프로세스 데이터되어 있는지 확인하십시오! ̶1; </li><li> 분석 탭으로 이동합니다. &quot;협회와 해리는&quot;분석하는 단계 및 모델이 1이 선택되어 있는지 확인 : 1. 지역 전체 착용감을 선택하고 버튼을 누르 &quot;맞춤 곡선을!&quot; </li><li> 테이블의 모든 곡선을 선택하고 오른쪽으로 하나의 색상으로 모든 곡선을 설정합니다. 다음, 색상 및 Rmax가 센서에 의해 연결되지 않은별로 그룹화 글로벌 (전체) 맞춤을 선택합니다. 를 눌러 &quot;맞춤 곡선!&quot;글로벌 역학 데이터를 얻을 수있다. </li></ol></li></ol> 5. 비드 IR1와 BNT-II의 탐지 및 rcHRP-II <ol><li> 1 ml의에게 트윈와 HBS에서 BNT-II와 rcHRP-II의 1 μm의 솔루션을 각각 준비 (HBST을, HBS를 0.025 % 트윈 20). </li><li> 직렬 15.6 nm의 최종 농도 HBST에서 절반으로 각각의 단백질을 희석. </li><li> 피펫 높은 농도 아래 열에 가장 낮은에서 순서로 희석 흰색 96 웰 플레이트에 세중의 각 희석액 100 ㎕,,,. </li><li> 피펫 50 μm의 니켈의 10​​ μL (II물론 각각의 희석에) NTA 자기 아가로 오스 입자. <ol><li> 입자가 현탁되도록 유지하기 위해 각 피펫 후에 자성 입자를 함유하는 마이크로 원심 튜브 소용돌이. </li></ol></li><li> 15 분 입자 샘플을 배양하는 접시 통에 접시를 놓습니다. </li><li> 이 잠복기 후, 96 웰 플레이트 자석에있는 플레이트에 배치하고 입자가 용액으로부터 당겨 30 초를 기다립니다. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 원래의 샘플을 끌어와 폐기물로 폐기합니다. 자석에서 플레이트를 제거합니다. </li><li> 각 웰 멀티 채널 피펫을 사용하여 HBST 200 μl를 추가합니다. 자성 입자를 씻어 위아래로 수회 버퍼 펌프. </li><li> 다시 자석 위에 접시를 놓고 입자 용액으로부터 당겨 30 초를 기다립니다. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여, 버퍼의 200 μl를 해내과 폐기물로 폐기합니다. 자석에서 플레이트를 제거합니다. </li><li> 반복 5.8 단계를 통해 서H 5.10 두 번 입자의 세 가지 세척을 완료합니다. </li><li> 2 mM의 IR1의 2.5 μL 다음 각 웰에 포함 된 자성 입자에 HBST 100 μl를 추가합니다. </li><li> 1 시간 동안 접시 통에 IR1와 입자를 품어. </li><li> 1 시간 후, 96 웰 플레이트 판독기를 사용하여 510 나노 미터 (365 nm에서 여기)에서 발광 강도를 판독. <ol><li> 악기에 접시를 놓고 새로운 실험을 설정하는 플레이트 리더 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> 510 내지 365 nm이고, 발광 파장의 여기 파장과 형광 엔드 포인트를 판독하는 새로운 실험을 설정한다. 상단 위치에 광학, 9 nm의 두 파장의 슬릿 폭을 설정합니다. </li><li> 판을 읽고 분석을 위해 데이터를 내보낼 수 있습니다. </li></ol></li><li> 맑은 96 웰 플레이트 및 이미지 UV transilluminator가을 이용하여 적정을 샘플을 옮긴다. </li></ol>

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미립자 기반 진단 도구 현대 진단 기술의 선두에 올 때, 직접 입자의 표면에 표적 생체 분자의 검출은 큰 장점이다. 이러한 PCR ELISA와 같은 전통적인 분자 검출 방법, 즉 그들이 검출부 (25)의 매우 낮은 한도를 달성 할 수있는, 유리하다. 그러나 이러한 분석은 광범위한 시약 및 긴 프로토콜을 필요로한다. 이러한 분석은 시간 및 시약의 요구 (도 5)없이 ELISA 샌드위치 형 상호 작용을 모방하도록 디자인되었다. 일반적인 ELISA에 대한 항체의 비용은 샘플 당 $ 0.20-0.30 반면 또한, 샘플 당 IR1 프로브의 비용은, 페니 주위로 추정되었다. 위에서 설명한 방법은 말라리아 바이오 마커의 검출을위한 cyclometalated 이리듐 프로브에 의존하기 때문에,이 프로브는 다른 검출 방법에 공통 고장 모드 (예. 형광의 quenchi에 감염되지 않을 것NG 항체 / 효소 분해). 히스티딘은 금속 결합 특성에 고유합니다. 요약 일 금속 함유 착물 일반적인 ELISA 샌드위치 항체를 대체함으로써이 현상을 이용한다. 니켈 (II) NTA는 입자의 표면에 rcHRP-II를 캡처하고 IR1은 단백질의 존재를 신호. 분석에서 가장 중요한 단계는 자성 입자가 샘플과 프로브와 혼합 할 수 있도록되어있다. 96- 웰 플레이트 ELISA에서, 생체 분자 및 시약은 웰의 바닥의 2 차원 표면과 평형에 도달한다. 자기 입자 때문에 가능한 결합 부위를 줄일 자신의 조밀 한 철 산화물 코어에 솔루션에서 정착하는 경향이있다. 따라서, 입자는 최대 결합되도록하여 분석 시간 동안 혼합한다. 질병 진단 시약을 설계 할 때, 하나 염두에 환자 샘플의 형태뿐만 아니라, 바이오 마커의 생리 학적 농도를 유지한다. 용말라리아 환자의 혈액에서 PF HRP-II의 농도가 높은 나노 몰을 둘러 피코 몰에서 다를 수 있습니다. 이 분석법은 높은 수준의 감염에 대한 임상 적으로 중요한 반면, 검출 한계가 낮은 피코 몰 HRP-II PF 순환와 무증상 환자를 검출하기 위해 개선 될 필요가있다. 위에서 설명 된 방법에서, &quot;스위치 온&quot;IR1 의해 생성 된 신호는 히스티딘의 존재하에 일어난다. 말라리아 바이오 마커는 히스티딘 풍부하지만, 인간 혈청 알부민과 히스티딘 풍부 당 단백질과 같은 다른 혈청 단백질, 프로브 신호 반응을 유도한다. 이것은 차례로 위양성 진단으로 이어질 것입니다. 이것은 유익한 단계, 즉 관심 단백질이 급속하게 환자 시료로부터 추출 될 수있는 입자의 표면에 단백질을 포획한다. 또한 관능 검사를 설계 강력한 분자 인식 요소에 결합 히스티딘 풍부 펩티드 (즉. 앱 타머 그), 분석 특이성의 또 다른 레이어를 추가 할 수 있습니다. 펩타이드는 앱 타머에 연결하기 전에 이리듐로드 될 것이다. 앱 타머와 표적 특이성을 달성하면서 이러한 설계에서, 안정된 IR1 프로브는 여전히 이용 될 수있다. 이것은 복잡한 매트릭스 (즉. 혈장 또는 전혈) 네이티브 HRP-II 감지하고 비특이적 결합 효과를 줄이기 위해 프로브의 적용을 허용한다. 더욱 신속한 진단 테스트 신호를 향상시키기 위해, 분석은 PF HRP-II가 전기 (26), 판독 RDTs 검출 될 수 전기 화학 발광 (ECL) 시스템에 통합 될 수있다. 이 차세대 이리듐 프로브는 크게 질병 바이오 마커의 검출에 대한 우리의 온 - 비드 ELISA 분석을 향상시킬 것입니다.

비색과 형광 표지는 생화학 적 분자의 검출 및 추적을위한 중요한 방법이며 1, 2를 처리합니다. 가장 일반적인 형광 마커는 저 분자량 유기 염료 3,4- 있지만 이들 분자는 항상 이상적인 광학 특성이 없다. 형광 염료는 종종 작은 스톡스 시프트가 있고, 중첩 여기 및 발광 스펙트럼을 가질 수 photobleaching에 경향이있다. 비색 라벨은 종종 면역 정량에 유용한 5,6- 증폭 된 신호가 효소 라벨의 사용에 의해 달성된다. 이 효소는 또한 감광성, 반응 조건, 및 기판의 짧은 수명을 포함한 그들의 단점을 가지고있다. 이러한 속성은 값 비싼 시약을 사용하여 잘 통제 된 조건 하에서 수행되어야 면역 단백질 라벨링 방법을 필요로하는 경향이있다. 방사성 전이 금속 착물은 다른 표지 방법 FO으로 탐구되어왔다생화학 감지 r에. 특히, (III)은, 7-9 산소 10 감지 유기 발광 다이오드 (OLED)의 맥락에서 공부 (11)을 촉매, 및 단백질 / 세포가 12-14 염색 한 내용의 Ir을 cyclometalated. 높은 광 안정성 및 양자 효율은 프로브의이 클래스 생체 분자 검출 (15, 16)에 대한 좋은 후보를합니다. 그것은 이전의 형식, (Ⅲ) 착물의 Ir을 cyclometalated 것으로 나타났습니다 [적외선은 (C ^ N) 2 (SOLV) 2] +, 비가 역적 히스티딘을 결합하고 푸른 녹색 신호 응답 12,17을 유도. 이러한 착물은 solvento 상태 비방 출성이지만 히스티딘 용매 분자 변위와 금속 중심에 결합 될 때, 그들은 장파장 UV 조사 후의 강한 인광 신호를 방출. 이 신호는 단지 리간드 치환 한 후 발생하고, 금속 리간드 전하 이동의 활성화를 통해 기저 상태로 편안한 삼중 상태 전자의 결과 (3 ML이고CT) 및 리간드를 중심으로 전달 (3 LC)는 8,15을 진학. 이러한 복합체는 잠재적 히스티딘 - 풍부 단백질 검출 프로브로서 사용될 수있다. 히스티딘 풍부한 단백질과 규제 수준은 간경변, 암, 및 thrombic 장애를 포함, 많은 질병에 중요하다. 특히 18 말라리아 원충 히스티딘 풍부한 단백질 II (pfHRP-II)는 말라리아 기생충 감염이 잘 검증 된 바이오 마커입니다. 이 단백질은 주로 특성 AHHAHHAAD 반복 모티브 (19) 내에서 67 kDa의이며 34 % 히스티딘이 포함되어 있습니다. 이 히스티딘 반복 무료 금속 이온 (19)을 결합 할 수 있으며 헴 호스트 혈액에서 20 복합체. pfHRP-II는 일반적으로 면역 크로마토 그래피 빠른 진단 테스트 (RDTs)를 사용하여 낮은 리소스 설정에서 검출되지만, 이러한 테스트로 인해 샘플 조건, 낮은 바이오 마커의 농도, 가난한 제조 기준 및 항체 저하 (21)에 종종 부정확하다. 2 (H 2 O) 2] + (IR1)가 BNT-II, 22 탐구된다 pfHRP-II의 분지 펩티드 모방을 검출하도록. 이러한 상호 작용의 속도론은 biolayer 간섭계 기법을 사용하여 실시간으로 모니터링 하였다. 분석은 또한 나노 몰의 검출 한계가 성취에 비드 형 ELISA 포맷에 적응시켰다. 이 대신에 4-5 시간 및 일반적인 ELISA를 필요로 생물학적 시약, 항체없는 시약하에 2 시간에서 수행 될 수 있기 때문에 기존의 분석은 ELISA를 통해 장점을 보유하고있다.

<table><tbody><tr><td>디콜로르테트라키스(2-(2-피리디닐)페닐)디이리듐(III)&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>658383</td><td></td></tr><tr><td>은 트리플루오로메탄설포네이</td>트 <td>시그마-알드리치</td><td>176435</td><td></td></tr><tr><td>실리카겔</td><td>시그마-알드리치</td><td>6858</td><td></td></tr><tr><td>L-아미노산</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마-알드리치</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>BNT-II 펩타이드</td><td>집에서 합성</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>재조합 HRPII</td><td>면역학 컨설턴트 연구소 Inc.</td><td>AGPF-55</td><td></td></tr><tr><td>Costar 블랙 폴리프로필렌 96웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-567</td><td></td></tr><tr><td>Costar 화이트 폴리프로필렌 96웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-589</td><td></td></tr><tr><td>Grenier 블랙 폴리프로필렌 96웰 플레이트</td><td>VWR</td><td>89089-582</td><td></td></tr><tr><td>Ni(II)NTA 자기 아가로스 입자</td><td>Qiagen</td><td>36111</td><td></td></tr><tr><td>Ni(II)NTA 생물층 간섭계 센서</td><td>ForteBio</td><td>18-5101</td><td></td></tr><tr><td>Octet Red96 생물층 간섭계 Instrumet</td><td>ForteBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotek Synergy H4 마이크로플레이트 리더</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher Biotech Transilluminator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBDLT-88</td><td></td></tr></tbody></table>

말라리아 단백질 바이오 마커 히스티딘 풍부한 단백질-ii의 검출을위한 이리듐 (iii) 발광 프로브

Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

이 작업에는 비 발광의 합성을 설명, cyclometalated IR (III) 착물, IR (PPY) 2 (H 2 O) 2 histidine-에 배위시 급속한 수명이 긴 인광 신호를 이끌어 + (IR1), 자성 입자의 표면에 고정화 된 단백질을 함유. IR1의 합성은, 높은 수율로, / N O 완료되고 용 매화 착물의 2 당량으로 IR (III) 클로로 - 가교 다이머 cyclometalated 부모의 분할을 포함한다. 특이성을 확인하기 위해, 합성 된 프로브에 첨가 될 때 여러 아미노산 조정 활동을 위해 프로빙하고, 히스티딘은 단지 신호 응답을 이끌어 냈다. BNT-II, 말라리아 히스티딘 리치 바이오 마커 단백질 II (pfHRP-II)의 분지 된 펩티드를 모방하여, 이리듐 프로브 HRP-II 검출을위한 도구로 입증되었다. L-히스티딘 / IR1 비교할 때 급냉 효과 BNT-II / IR1 적정에서 언급 되었으나, 이러한 입체 장애 및 트리에 기인 한상태 담금질을 plet. Biolayer 간섭계는 BNT-II IR1와의 상호 작용을 실시간으로 반응 속도를 결정하는 데 사용되었다. 시스템 최적화 된 후에 프로브를 사용 rcHRP-II의 검출 한계는 용액에 12.8 nm 인 것으로 밝혀졌다. 이 단백질이 50 ㎛ 인 자성 아가 입자의 표면에 고정화 한 경우, 검출 한계는 14.5 nm였다. 강력한 시그널이 무기 프로브의 응답뿐만 아니라 용액 사용의 유연성 또는 표면에 고정화는, 진단 용도에서 이미징, 다양한 애플리케이션을 향해 빌려줄 수있다.

도 1 금속 중심 불용성의 AgCl의 형태 클로라이드의 침전에 의해 상위의 이량 클로라이드 다리 IR1 solvento 복잡한 관여의 합성 및 분리 물 분자의 관계에 도시 된 바와 같이. IR1의 형성은 1 H NMR 및 ESI에 의해 확인 하였다. 365 nm에서 여기 된 때 또한 금속 리간드 전하 이동의 특징 UV 가시 밴드 π-π * 전이 더욱 IR1의 형성을 확인하는, 스펙트럼을 할당 하였다. 이것은 복잡한 전시물을 더 방출 특성을 용해하지 않는다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig1.jpg" /> 그림 1 :.의 IR1 디클로로 (2- (2- 피리 디닐) 페닐)의 염화 다리 분할 반응 합성 및 특성 디 이리듐 (III) 아쿠아 단지의 Ir를 만들려면 (PPY) 2 (H 2 O) 2 </서브&gt; + (IR1). 첨가시 L-그의 수성 버퍼의 아쿠아 단지에, 발광 신호가 켜집니다. 착물 합성 및 특성화되었다 일단 이전 유사한 이리듐 유사체 (17)를 이용하여 설명한 바와 같이, 아미노산 선택성, 분석 하였다.도 2a는 365 nm에서 여기 된 경우에만 히스티딘, 510 nm에서 신호 응답을 유도 것을 보여준다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig2.jpg" /> 그림 2 : 아미노산, 선택도, 히스티딘 풍부한 펩타이드와 IR1의 적정 (A) 50 μm의 다양한 아미노산 (시스테인, 빼앗아, ASP, 글루,의 Phe,리스,의 Arg, 티르, TRP, 그의) 200 μM의 상호 작용. HBS에서 IR1. 스펙트럼 스캔 블랙 96 웰 플레이트에 365 nm 인 여기 파장 400-700 nm 내지 촬영 하였다. 모든 아미노산 B의 상대 형광 단위로 신호 (RFU)esides 히스티딘 (점선 블랙 추적) 무시할 수 있었다. BNT-II (▪) 및 rcHRP-II (♦)의 (B) 나노 몰 농도는 HBS에서 IR1으로 적정 하였다. 히스티딘 풍부한 펩티드는 365 nm의 빛 여기 후 510 nm에서 방출을 읽기 전에 용액에서 15 분 동안 프로브와 함께 배양 하였다. 검출 한계는 y는 3σ를 비워 = x의 값으로 계산 하였다. 히스티딘이 조정되었을 때의 Ir의 단일 여기 상태 (1 MLCT / 1 LC)이 (III) bioconjugate는 삼중 항 여기 상태 (3 MLCT)에 간 교차을 거쳐 때문에 이리듐 프로브의 인광이 &quot;ON 스위치는&quot;발생 금속 중심에. 이 프로브는 BNT-II에 말라리아 원충 히스티딘 풍부한 단백질 II (HRP-II PF) 말라리아 바이오 마커의 모방 펩타이드를 적용 하였다. IR1와 BNT-II의 적정에서 농도 의존적​​ 신호 응답이 관찰되었다 ( <stronG&gt; 그림 2B). 재조합 HRP-II (rcHRP-II)도 솔루션에서 비슷한 반응을 보였다. 솔루션 BNT-II와 rcHRP-II의 검출 한계는 각각 54.8 nM의 12.8 nm이었다. biolayer 간섭 기술을 사용하여, BNT-II의 결합의 IR1 K D는 니켈 (II) NTA 표면에 고정화는 2.05 μM (도 3) 인 것으로 밝혀졌다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig4.jpg" /> 그림 3 :. 니켈 (II) NTA 유리 센서의 표면에 BNT-II의 결합 IR1의 다양한 농도의 운동 분석을위한 BNT-II Biolayer 간섭과 IR1의 실시간 운동 분석. KB (지역)에 센서를 평형화 후, 센서는 0.5 μm의 BNT-II (지역 B)와 함께로드됩니다. 펩티드를 센서에 탑재되면,베이스 라인은 종래 BNT-II (지역 D) 내지 (IR1)의 관계를 측정하는 (C 영역)에 설정된다. 후협회의 기간은, 센서는 해리 (지역 E)를 측정하기 위해 KB에 다시 배치됩니다. 전체 운동 분석 프로세스 미만 30 분 소요됩니다. 자성 입자 플랫폼 용액 기반 분석법에서 전환하는 경우, 시스템 내의 입자의 복잡성 고려되어야했다. 에서 볼 수 있듯이 그것은, 위의 설명 (24) 블랙 형광 판 솔루션 분석을 위해 잘 작동했다. 이들 입자가 효율적으로 말라리아 바이오 마커 PF HRP-II를 결합하는 것으로, 이전의 연구에서 알려져 있지만 흰색 플레이트에 입자 검출 플랫폼에 더 적합했다되었다 도 4a. 화이트 판, 광 따라서 입자의 표면에 결합하여 더 IR1 흡광도 있도록 다시 샘플로 반사된다. 온 - 입자 분석에서, rcHRP-II의 검출 한계는 14.5 nM의 (도 4B)로 측정되었다. rcHRP-II에 대한 검출 한계 솔루션과 온 - 비드 statis했다짝 t 검정 (p = 0.731가)에 기초하여 동일한 학적. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> 그림 4 :. 검은 50 μm의 니켈의 표면에 BNT-II에 결합 IR1에서 검출 된 신호 사이에 비드 BNT-II와 HRP-II의 감지 () 차이 (II) NTA 자기 아가 입자 96 잘 흰색 96 웰 플레이트 (점선) 대 판 (실선). 입자는 365 nm의 광으로 여기하여, 발광은 510 nm에서 측정 하였다. rcHRP-II의 (B) 적정 자성 입자에 고정 및 IR1을 이용하여 검출. 검출 한계는 다음과 같이 계산 하였다 VAX의 루는 Y는 3σ를 비워 = 때. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" /> 그림 5 : IR1와 rcHRP-II의 온 - 비드 검출의 도식 표현 니켈 (II) NTA 입자와 IR1 표지의 표면에 결합 HRP-II의 일반 계획.. 입자를 15 분 동안 히스티딘 풍부 펩티드와 함께 배양된다. 이 배양 기간 후, 입자 HBST이 용액으로부터 입자를 끌어하기 위하여, 자석을 이용하여 세척한다. 마지막으로, 펩티드 결합 입자는 종래 365 nm의 광으로 여기 한 후 510 nm에서 발광을 판독을 1 시간 동안 IR1 함께 배양된다.

강력한 검출 시약은 새로운 말라리아 진단 도구를 개발하기 위해 점점 더 많은 필요성을 느끼고 있습니다. 이리듐(III) 프로브는 히스티딘이 풍부한 말라리아 단백질 바이오마커가 있는 상태에서 오래 지속되는 발광 신호를 방출하도록 설계되었습니다. 용액 내에서 또는 자성 입자에 고정된 단백질을 검출하면 응용 분야에 유연성을 제공합니다.

말라리아 단백질 바이오 마커 히스티딘 풍부한 단백질-II의 검출을위한 이리듐 (III) 발광 프로브

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived ...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 인광 이리듐 프로브를 사용하여 시료 내 히스티딘 풍부 말랄 단백질 바이오마커의 존재를 검출하는 것입니다. 이는 먼저 사이클로 메틸화 이리듐 복합체를 합성함으로써 달성됩니다. 모체 이량체 복합체의 빠른 염화물 가교 분해 후, 사이클로 메틸화 이리듐 복합체를 분리 및 정제하여 분석법에 사용할 수 있습니다.두 번째 단계는 프로브가 다양한 아미노산과 상호작용하는지 확인하여 특이성을 검증하는 것입니다. 히스타민만 있는 경우, 인광 신호는 히스타민이 존재할 때만 켜지며 발광 분광법으로 관찰됩니다. 다음으로, 개념 증명을 위해 이리듐 프로브를 말라리아 바이오마커인 histidine rich protein two의 펩타이드 모방체로 적정하여 용액 내 검출 한계를 결정합니다.또한, 바이오레이어 간섭계(biolayer interferometry)를 사용하여 프로브와 펩타이드의 상호작용 역학을 규명합니다. 마지막 단계는 재조합 히스티딘 풍부 단백질을 니켈 NTA 자기 입자 표면에 고정하고, 해당 프로브를 사용하여 단백질의 검출 한계를 평가하는 것입니다. 궁극적으로, 루미노미터와 분광법을 사용하여 새로운 종류의 인광 이리듐 프로브를 통해 고체 지지체 표면에서 단백질을 어떻게 검출할 수 있는지 보여줍니다.형광 단백질 표지나 면역 분석법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 프로브가 견고하다는 것입니다. 결합 속도가 빠르며, 광퇴색의 영향을 받지 않습니다. 또한, 이 기술은 면역 분석법처럼 오랜 시간이 소요되지 않습니다.이 기술의 영향력은 말라리아 감염 진단까지 확장될 수 있습니다. 이는 Plasmodium SRO 감염의 단백질 바이오마커인 Histidine rich protein two의 히스티딘 함량이 높기 때문입니다. 저희는 살아있는 세포를 염색하기 위해 cyclo methylated iridium 프로브를 사용한 논문이 발표된 것을 보고 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다.본 논문에서 저자들은 프로브가 살아있는 세포 내로 들어가 히스토딘 풍부 단백질(histidine rich proteins)에 결합하여 핵을 발광시켰다고 기술하였습니다. 말라리아 바이오마커인 히스티딘 풍부 단백질 2(histidine rich protein 2)의 특성을 고려하여, 우리는 관심 단백질을 검출하기 위해 이 프로브를 사용하기로 결정했습니다. 분석 과정의 복잡성과 표적 단백질을 입자 상에서 검출하는 데 필요한 수많은 세척 및 전이 단계로 인해, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 우선, 53.6 mg의 모체 이리듐 이량체(parent iridium dimer)를 정량하여 5 mL의 메틸렌 클로라이드에 녹입니다.이 용액을 스털바가 들어 있는 50 milliliter Lummi 플라스크에 넣습니다. 그런 다음 26.2 milligrams의 silver FL을 정량하여 5 milliliters의 methanol에 녹입니다. 용해된 silver FL을 모체 iridium dimer 용액에 첨가하고 1시간 동안 교반합니다.한 시간 후에 크림색 슬러리가 형성되어야 하며, 이 슬러리를 실리카겔을 통해 필터로 여과합니다. 여과된 생성물을 25 by 95 mm DRAM 바이알로 옮기고, 회전 증발기를 사용하여 남은 용매를 5~10분 동안 증발시킵니다. 용매의 대부분이 제거되면 바이알에 노란색 오일성 잔여물이 남아 있는지 확인합니다.이 잔여물에 메탄올 1 mL를 첨가하여 생성물을 용해합니다. 노란색 고체가 생성될 때까지 1~2일 동안 방치하고, 이리듐 프로브와 다양한 아미노산 간의 상호작용을 조사하기 위해 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 생성물을 분석합니다. 각 아미노산 용액 100 µL를 검은색 96웰 플레이트에 피펫팅합니다.블랭크로 사용하기 위해 플레이트에 100 µL의 완충 식염수 또는 HBS를 추가합니다. 그런 다음 준비된 2 mM 이리듐 프로브 용액 2.5 µL를 각 샘플에 추가하고 플레이트 셰이커에서 10분 동안 흔들어 줍니다. 10분 후, 96웰 플레이트 리더를 사용하여 샘플의 방출 스펙트럼을 측정합니다.이를 위해 플레이트를 기기에 넣고 플레이트 리더 소프트웨어를 열어 새 실험을 설정하십시오. 다음으로, 시료를 투명한 96 Well 플레이트로 옮기고 UV trans illuminator를 사용하여 방출 이미지를 촬영함으로써, 말라리아 바이오마커인 histamine rich protein two BNT two의 분지형 펩타이드 모방체와 이리듐 프로브의 적정을 수행합니다. 먼저 HBS에 BNT two 1 mM 스톡 용액을 준비하십시오.그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 BN T two 용액을 단계별로 희석하십시오. 96-웰 플레이트의 각 웰에 HBS를 공시료(blank)로 하여 각 희석액 100 µL를 3반복으로 넣고, 각 샘플에 2.5 µM iridium probe를 추가하십시오. 플레이트 쉐이커에서 10분 동안 흔들어 준 후, 96-웰 플레이트 리더를 사용하여 510 nm에서 방출 강도를 측정하십시오.마지막으로, 샘플을 투명한 96-well 플레이트로 옮기고 UV 투과 조명기를 사용하여 적정 과정을 이미지화함으로써 생물층 간섭계(biolayer interferometry)를 이용한 실시간 역학 분석을 수행합니다. 먼저, 검은색 96-well 플레이트의 첫 번째 열에 있는 8개 웰에 역학 완충액 200 µL를 첨가합니다. 플레이트를 플라스틱 센서 홀더에 삽입한 후, 8개의 니켈-A 바이오센서의 팁이 완충액이 담긴 웰에 잠기도록 플라스틱 홀더의 첫 번째 열로 조심스럽게 옮깁니다.그런 다음 간섭계 장치의 왼쪽에 있는 플라스틱 홀더에 새로운 검은색 96웰 플레이트 피펫을 거치하고, 동일한 플레이트의 1열과 3열에 있는 8개 웰 모두에 KB 200 µL씩을 분주합니다. 2열의 웰에는 0.5 µM BNT two 용액 200 µL씩을 분주합니다. 이어서 4열에는 이리듐 프로브의 각 희석액 200 µL씩을 분주하되, A4 웰에 공시료인 KB를 먼저 넣습니다. 열 아래로 내려갈수록 이리듐 프로브 농도가 증가하도록 희석액을 분주하십시오.이 플레이트를 바이오레이어 간섭계(biolayer interferometry) 소프트웨어에서 사전 습윤 센서가 포함된 플레이트의 오른쪽에 배치하십시오. 플레이트 어세이와 센서 팁을 정의하여 플레이트를 설정함으로써 기본적인 키네틱 실험을 구성하십시오. 화면의 열을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 적절한 정의를 선택하십시오. 웰(well)의 경우 버퍼(buffer)를 선택하십시오.1번 및 3번 컬럼의 경우, 2번 컬럼과 샘플을 위해 로딩하십시오. 4번 컬럼의 경우, 먼저 '평형 추가(add equilibrium)'를 클릭하여 다음 탭에서 분석법을 정의하십시오. 로딩 60초, 120초입니다.결합 시간 120초, 해리 시간 300초로 설정하십시오. 평형 단계를 선택하고 첫 번째 열을 더블 클릭하십시오. 그런 다음 동일한 방법으로 로딩은 두 번째 열, 베이스라인은 세 번째 열, 결합은 네 번째 열, 해리는 세 번째 열에 할당하십시오.마지막으로, nickel NTA 센서를 선택하십시오. 실험 설정이 올바르게 구성되었는지 확인하십시오. 파일 이름을 입력하십시오.지연 실험(delay experiment) 항목이 체크되었는지 확인하고 go를 누르십시오. 키네틱 런(kinetic run)이 완료되면, 제공된 프로세싱 소프트웨어에서 데이터를 처리하여 이리듐 프로브를 이용한 BNT two 및 재조합 HRP two의 비드 검출을 수행하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 BNT two 및 재조합 HRP two의 연속 희석액을 준비하십시오.그 후, 희석액 각각 100 µL를 화이트 96-웰 플레이트에 3회 반복하여 분주하며, 각 열에 가장 낮은 농도부터 가장 높은 농도 순으로 희석액을 넣습니다. 각 희석 웰에 50 µM nickel NTA 자성 비드 10 µL를 분주합니다. 이때 분주하는 동안 자성 비드가 부유 상태를 유지하는지 확인하십시오. 비드가 가라앉기 시작하면 피펫으로 섞거나 볼텍싱하십시오. 플레이트를 플레이트 셰이커에 놓고 15분 동안 셰이킹하여 샘플을 비드와 함께 배양합니다. 배양 기간이 끝나면, 플레이트를 96-웰 자석 위에 놓고 자성 비드가 용액 밖으로 끌어당겨질 때까지 30초 동안 기다립니다.멀티 채널 피펫을 사용하여 기존 샘플을 빨아들여 폐기한 후, 마그넷에서 플레이트를 제거하고 각 웰에 200 µL의 tween 함유 HBS 또는 HBST를 넣습니다. 멀티 채널 피펫을 이용하여 버퍼를 여러 번 상하로 펌핑하여 자성 입자를 세척합니다. 플레이트를 다시 마그넷 위에 놓고 입자가 용액에서 분리될 때까지 30초 동안 기다립니다.멀티채널 피펫을 사용하여 200 µL의 완충액을 빨아들여 폐기합니다. 자석에서 플레이트를 제거한 후, 세척 단계를 두 번 더 반복하여 입자를 총 세 번 세척합니다. 그 다음, 자기 입자가 포함된 각 웰에 100 µL의 HBST를 넣고, 이어서 2 mM 이리듐 프로브 용액 2.5 µL를 추가합니다.플레이트 쉐이커에서 입자를 이리듐 프로브와 함께 1시간 동안 배양합니다. 1시간 후, 96-웰 플레이트 리더를 사용하여 510 nanometers에서 방출 강도를 측정합니다.사이클로 메틸화 이리듐 프로브의 합성 및 특성 분석 후, 다양한 아미노산을 사용하여 복합체와의 반응성을 테스트합니다. 프로브를 적정했을 때 히스티딘만이 상대 형광 단위에서 신호 응답을 유도합니다. 히스티딘을 포함하는 두 가지 펩타이드 용액에서는 농도 의존적 응답이 관찰됩니다.이 응답은 광대역 UV 광원 하에서 여기서 확인할 수 있습니다. 니켈 NT.A 유리 센서 표면에서 다양한 농도의 이리듐 프로브가 BNT two에 결합하는 것에 대한 운동학적 분석을 위한 생체층 간섭계 결과, 이리듐 프로브가 히스티딘 함유 펩타이드에 대해 마이크로몰 수준의 친화력을 가짐을 보여줍니다.프로브를 사용한 히스티딘 풍부 단백질의 검출 한계는 단백질이 자성 입자 표면에 고정되었을 때도 유사하게 나타났습니다. 용액 상태일 때와 마찬가지로, 숙련된 후에는 단백질의 이러한 표지가 입자 표면 자체에서 시각화될 수 있습니다. 이 기술은 적절히 수행될 경우 2시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 자성 단백질 결합 입자를 세척하고 옮기는 단계에서 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 결합되지 않은 단백질을 세척하여 제거하는 것은 고정화된 P-F-H-R-P two의 적절한 검출을 위해 중요하며, 이는 항체-항원 상호작용을 통해 결합된 단백질을 특이적으로 표적하는 분자 인식 요소를 설계하는 것입니다. 개발 후에도 견고한 이리듐 프로브를 계속 사용하면 입자 표면에 결합된 단백질을 더욱 민감하고 특이적으로 검출할 수 있습니다.이 기술은 진단 분야의 연구자들이 말라리아뿐만 아니라 다른 감염성 질환의 검출에도 유용한 견고한 시약을 활용하는 방안을 탐색할 수 있는 길을 열어줄 가능성이 있습니다.

iridium-iii-luminescent-probe-for-detection-malarial-protein

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연구

JoVE Journal

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화학

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