학습의 개별 단계에서 설치류에서 원격 음소거 신경 활동하는 방법

이 절차의 목표는 동물이 학습 및 기억 작업에 참여하는 동안 개별 뇌 영역의 신경 세포 활동을 일시적 및 원격으로 침묵시키는 것입니다. 이것은 먼저 디자이너 수용체와 리포터를 포함하는 a a v 를 주입을 위해 주사기에 로드하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 쥐의 뇌에 있는 관심 영역에 a a v 를 주입하는 것이다.

다음으로, 생물학적으로 불활성인 디자이너 약물인 클로자핀과 옥사이드를 제조하여 쥐에 전신적으로 주입합니다. 마지막 단계는 감각 전처리 패러다임을 사용하여 행동 테스트를 수행하는 것입니다. 궁극적으로 쥐의 뇌 조직에 대한 면역형광 현미경 검사는 디자이너 수용체의 배치를 확인하는 데 사용됩니다.

이 방법은 동기 부여, 주의력, 학습 및 기억의 조절을 포함하되 이에 국한되지 않는 행동 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다 이 비디오에 사용된 바이러스는 생물 안전성 레벨 1 화합물로 분류됩니다. 10% 표백제 용액을 준비합니다. 오염 제거 a v 폐기물 장소, 표백제 용액이 들어있는 bega 및 멸균 10 마이크로 리터 주사기.

작업 공간에서 a v의 부분 표본이 들어 있는 마이크로 원심분리기 튜브를 표준 벤치 바이스 로드, 최소 4마이크로리터의 a v가 있는 10마이크로리터 주사기에 넣습니다. a v 용액의 4마이크로리터에 기포가 없는지 확인합니다. 주사기에서 10% 표백제가 들어있는 비커에 빈 바이러스 튜브를 버립니다.

폐기물 용기에 10% 표백제를 추가로 추가하고 기관 지침에 지정된 대로 오염이 제거된 액체 폐기물을 처리하기 전에 폐기물을 30분 동안 그대로 두십시오. 입체운동 장치 아래와 전용 바이러스 취급 구역으로 지정된 인접 공간에 흡수성 벤치 용지를 놓아 수술 부위를 준비합니다. 마취 유도 후 3%isof, 불소, 산소를 분당 1리터의 비율

눈 사이부터 귀 약간 뒤까지 털을 깎습니다. 면도 후 쥐를 입체 장치에 고정한 상태에서 3분 동안 쥐를 유도 챔버에 다시 눕힙니다. 안과 연고로 눈을 가리고 베타딘으로 세정하여 절개 부위를 정돈합니다.

눈에서 약 2mm 코말부터 시작하여 두개골 위에 2.4cm 정도의 정중선을 절개한 후 피부를 수축시켜 두개골을 노출시킨 다음 bgma와 lambda가 명확하게 보일 때까지 두개골에서 막 조직을 제거합니다. 두개골이 평평한지 확인한 후 드릴을 bgma에 배치하고 좌표를 0으로 만든 다음 드릴을 원하는 내측, 측면 및 전방 후방 좌표로 이동합니다. 0.9, 0.7 또는 0.5mm 드릴 비트를 사용하여 구멍을 뚫습니다.

주입 펌프를 설정하여 분당 0.2마이크로리터의 속도로 바이러스를 전달하도록 합니다. La 주사기를 입체 장치의 주입 암에 넣고 주사기를 원하는 좌표로 내립니다. 바이러스 전달이 완료된 후 펌프를 사용하여 원하는 양의 바이러스를 전달합니다.

바늘로 역류하는 것을 방지하기 위해 주사기를 10분 동안 제자리에 두고 분당 약 5mm의 속도로 주사기를 천천히 올립니다. 그런 다음 다음 좌표로 이동하고 모든 좌표에 a v가 주입될 때까지 절차를 반복합니다. 승인된 프로토콜에 따라 상처를 봉합하고 수술 후 진통제를 제공한 후, 쥐를 침구, 뚜껑 및 적절한 표지판이 있는 깨끗한 케이지에 넣습니다.

쥐가 마취에서 완전히 회복되면 기숙사로 되돌려 놓는다. 디자이너 수용체의 적절한 발현을 보장하기 위해 행동 테스트를 시작하기 3주 이상 기다립니다. 이 그림은 감각 사전 조건화 패러다임의 세 단계, 즉 사전 조건화 단계, 조건화 단계 및 테스트 단계를 보여줍니다.

디자이너 약물인 클로자핀(clozapine)과 옥사이드(Oxide) 또는 CNO는 신경 활동을 침묵시키는 데 사용되며, 설계 수용체를 활성화함으로써 CNO는 테스트의 모든 단계 전에 주입될 수 있습니다. 여기서, CNO는 각 프리컨디셔닝 세션 30분 전에 주입됩니다. 프로토콜의 서면 부분에 있는 지침에 따라 밀리리터당 1밀리그램의 클로자핀과 산화물 용액을 새로 준비한 후, 행동 테스트 30분 전에 킬로그램당 1밀리그램의 용량으로 CNO를 복강내에 주입합니다.

적절한 동작 세션을 위한 컴퓨터 코드를 시작합니다. 30분이 경과한 후, 쥐를 실험실에 넣고 청각 및 시각 자극의 전달로 구성된 12개의 혼합 시험을 쥐에게 제시하여 4개의 64분 사전 조정 세션 중 첫 번째 세션을 시작합니다. 6건의 임상시험에서는 10초 동안 전제조건 자극을 한 다음, 다른 6건의 임상시험에서 5초 동안 번쩍이는 빛 자극을 제시했다.

백색 소음, 즉 공기가 불지 않는 자극을 10초 동안 단독으로 제시합니다. 사전 컨디셔닝 단계가 완료된 후 컨디셔닝 세션을 시작하며, 이는 5일 연속으로 진행됩니다. 쥐에게 시각적 자극을 전달하고 5초 동안 깜박이는 불을 켠 다음 즉시 2개의 45밀리그램 음식 알갱이를 전달하는 것으로 구성된 8개의 시도를 제시합니다.

이 시간에는 컨디셔닝 세션이 완료될 때 7분 동안 테이버되는 트라이얼 인터벌이 포함됩니다. 청각 자극의 전달만으로 구성된 12개의 혼합 시험을 쥐에게 제시하여 78분 테스트 세션을 수행합니다. 6번의 재판에서.

톤 자극, 전제 조건 자극을 10초 동안 단독으로 제시합니다. 다른 6번의 시도에서는 짝을 이루지 않은 자극인 백색 잡음을 10초 동안 단독으로 제시합니다. 행동 과제가 완료되면, 즉시 방에서 쥐를 꺼내 동물 군집으로 돌려보낸다.

프로토콜의 서면 부분에 있는 자세한 지침에 따라 컨디셔닝 및 테스트 단계의 데이터를 분석합니다. 태그가 지정된 리포터 또는 리포터 단백질에 대한 면역조직화학을 수행한 후, 현미경으로 염색 단면을 검사하여 설계자 수용체 및/또는 리포터의 위치와 발현을 예상대로 대조군 및 실험용 쥐는 번쩍이는 빛 자극과 음식 사이의 파블로프 연관성을 유사하게 학습했습니다. 컨디셔닝 세션 중에.

세션에서 두 그룹 모두 컨디셔닝 세션 동안 음식 보상을 얻도록 동기를 부여받았습니다. 대조적으로, 비판적 테스트 세션 동안 실험용 쥐는 사전 조건화된 청각 자극과 방송되지 않은 청각 자극을 구별하지 못한 반면, 대조군 쥐는 사전 조건 자극의 제시에 대한 반응으로 더 큰 음식 컵 행동을 보였습니다. 따라서, 실험적이 아닌 대조군의 쥐는 감각 사전 조건화 효과를 보였다.

이 이미지는 발달 후 설치류 뇌의 관심 영역으로의 a a v 주입 위치에 대한 조직학적 검증을 보여줍니다. 이 기술은 신경 과학 분야의 연구자들이 생체 내 복잡한 행동에 대한 특정 뇌 영역 및/또는 세포 유형의 기여도를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.