마우스 종양 모델에서 종양 세포 순환의 분리 및 전파

이 절차의 전반적인 목표는 간세포암 전이가 있는 동계 마우스 종양 모델의 전혈에서 순환 종양 세포를 분리하고 증식시키는 것입니다. 이는 먼저 마우스에서 채취한 전혈을 원심 분리하여 버피코트(buffy coat)를 분리함으로써 수행됩니다. 그다음, 버피코트 내의 적혈구를 용해시키고 순환 종양 세포를 펠렛 형태로 수집합니다.

그 다음 세포를 세척하고 완전 배양 배지에 현탁한 후 세포 배양을 통해 증식시킵니다. 빠르게 성장하는 종양 세포는 수많은 계대 배양 후에도 생존력을 유지하며, 표준 분자 진단 기술을 사용하여 이를 확인할 수 있습니다. 본 기술을 이용하여 순환 종양 세포를 분리하는 것의 의의는 임상 환경에서의 잠재적 활용을 위해 최적화할 수 있는 재현 가능한 모델을 제공한다는 점에 있습니다.

저희 연구실의 학부생인 Michelle Nadu가 이 절차를 시연하겠습니다. 우선, 별도의 JoVE 영상에 설명된 바와 같이 간세포암 전이가 있는 Ciea Kamau 종양 모델에서 전혈을 채취하십시오. 채취한 전혈을 상온에서 1,167 ×g로 5분 동안 원심 분리하십시오.

층 분리가 완료되면, 상층의 혈장층을 조심스럽게 제거하여 cell-free 핵산 검출과 같은 추가 실험을 위해 별도의 1.5 milliliter rogen free 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 적혈구 용해 준비를 위해 버피코트(Buffy coat) 층을 별도의 1.5 milliliter ROGEN free 튜브로 옮깁니다. 이는 순환 종양 세포를 분리하기 전, 버피코트 층에 남아 있는 잔여 적혈구를 제거하기 위해 필요합니다.

최종 농도가 155 millimolar ammonium chloride 및 10 millimolar triss인 적혈구 용해 버퍼(red blood cell lysis buffer) 용액 1 liter를 준비하는 것으로 시작합니다. 용액의 pH를 7.5로 조정합니다. 준비된 1 liter 적혈구 용해 버퍼 혼합 스톡에서 약 2~4 milliliter의 aliquot를 취합니다.

그 다음, 수집된 버피코트(buffy coat)가 들어 있는 튜브에 적혈구 용해 버퍼 1 mL를 첨가합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 내용물을 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 벤치 위 상온에서 5분 동안 배양합니다.

다음으로 혼합물을 5분 동안 원심분리합니다. 1,167 ×g에서 원심분리하면 흰색 펠렛이 형성됩니다. 펠렛이 손상되지 않도록 주의하며 붉은색 상층액을 10% 표백제에 천천히 조심스럽게 버립니다.

상층액을 제거한 후, 희백색 펠렛을 1 mL의 PBS로 세척합니다. 그 다음 세포를 다시 펠렛화하고 완전 배양 배지에 재현탁합니다. 재현탁된 세포를 세포 배양 접시에 옮기고, 공기와 5% 이산화탄소가 공급되는 가습 인큐베이터에서 37 °C로 배양합니다.

세포 배양 배지를 2~3일마다 교체하십시오. 5~7일 후면 순환 종양 세포가 세포 배양 접시에 부착되어 증식하기 시작합니다. 간세포암 순환 종양 세포가 정확하게 분리되었는지 확인하기 위해 다음과 같이 진행합니다.

Stu가 설명하고 검증한 방법에 따라 마우스 베타 글로빈 유전자의 특정 세그먼트에 대해 PCR을 수행하십시오. 그런 다음 간세포 특이적 마커인 Cyclic A MP responsive element binding protein three like three에 특이적인 항체로 세포를 면역 염색하십시오. 여기에 제시된 표준 기술을 사용한 결과는 서로 다른 두 마리의 마우스에서 채취한 순환 종양 세포의 대표 이미지입니다.

간세포암의 정위성 동계 마우스 모델로부터 배양되었습니다. 전이성 종양 세포는 배양 접시에 부착되어 빠르게 증식합니다. 이 세포들은 25세대 이상 확장 가능하며, 반복적인 동결-해동 주기에도 견딜 수 있습니다.

이 영상을 시청하신 후에는 생존 가능한 환상 종양 세포를 분리 및 증식시키는 방법과, 이를 분자적 및 기능적으로 특성화하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.