Name: 인간의 산모 - 태아 인터페이스에서 백혈구의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 배우세요 인간 산모-태아 인터페이스에서 백혈구를 분리하는 방법을. 기계적 및 효소적 조직 분해와 밀도 구배 원심분리를 사용하여 세포 표면 마커를 보존하고 면역표현형 분석이 가능한 생존 세포를 얻습니다.

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이 작품은 아동 건강 및 인간 발달의 유니스 케네디 슈라이버 국립 연구소, NIH / DHHS에 의해 지원되었다. 이 작품은 또한 모자, 주 산기 모자 건강에 웨인 주립 대학 주 산기 이니셔티브에 의해 부분적으로 지원되었다. 우리는 기꺼이 원고의 그녀의 중요한 측정 값에 대한 모린 McGerty (웨인 주립 대학)을 인정합니다.

이 프로토콜은 유동 세포 계측법에 의해 모두 면역을위한 준비에 탈락의 basalis과 탈락의 parietalis에서 백혈구 분리에 적합합니다. 또한, 분리 된 세포는 세포 분류, 세포 배양, RNA 분리 및 세포학에 사용될 수있다. 이 프로토콜에 언급 된 샘플 작업을 시작하기 전에, 인간의 윤리적 승인은 지역 연구 윤리위원회 및 기​​관 검토 보드에서 얻을 수 있어야합니다. 수집 및 연구 목적으로 인간의 샘플의 활용은 아동 보건 인간 개발 (NICHD)의 유니스 케네디 슈라이버 국립 연구소의 임상 시험 심사 보드, 건강 (NIH)의 국립 연구소, 보건 복지부 (DHHS에 의해 승인되었다 베데스다, 메릴랜드, 미국)와 웨인 주립 대학 (디트로이트, 미시간, 미국). 서면 동의서 전에 조직 샘플의 컬렉션에 모든 임산부로부터 얻은 것입니다. 참고 : 동물의 혈액, 세포, 또는 위험 작업하는 동안이 프로토콜에서 언급 한 바와 같이 OU에 에이전트, 그것은 적절한 바이오 안전성 및 실험실 안전 조치가 따라야하는 것이 필수적이다. 인간의 탈락 조직 1. 해부 주 : 기부 플레이트 아래 및 기부 태반에 부착되고 모체의 표면을 나타낸다. chorioamniotic 막은 양막과 융모막을 포함한다. 기초 판은 탈락의 basalis을 포함하고 융모막은 탈락의 parietalis (그림 1)을 포함한다. <ol><li> 탈락 Basalis <ol><li> 태반 (도 1a 및 1b) 중 하나 자엽으로부터 기부 판의 부분을 해부. </li><li> 위로 향 태반 융모와 멸균 커팅 보드에 배치합니다. 태반의 융모를 보여주는 측면은 일반적으로 모양 털이 조직과 피 묻은 빨간색입니다. 기초 판은 부드럽고 붉은 색 옅은입니다. </li><li> VILL을 제거하기 위해 날카로운, 미세 포인트 가위와 집게를 사용하여OU를 조직과 혈관. 프로세스 (그림 1C) 동안 (무료 - - 2+ 및 마그네슘 칼슘) 1X PBS에 담가 조직을 유지합니다. 이 조각의 3에 2를 수집하고 혈액 (그림 1D)를 제거하는 1X PBS로 철저히 씻어. </li></ol></li><li> 탈락 Parietalis <ol><li> chorioamniotic 세포막의 조각을 해부 (약 10cm는 10cm, 그림 1E을 X). 융모막이 위로 향하게하여 보드에 놓습니다. 융모막 쪽은 피의 응고를 포함하고 일반적으로 색에 노란 빛입니다. </li><li> 가능 (그림 1E)로 혈전의만큼을 제거하는 미세 포인트 집게를 사용합니다. 1X PBS 분명히 실행될 때까지 막에서 여분의 혈액을 청소하는 멸균 1X PBS에서 막을 씻어. </li><li> 부드럽게 막에서 탈락 층을 긁어 일회용 멸균 세포 스크레이퍼를 사용합니다. MEM에 멸균 1X PBS 적용brane이 과정 (그림 1 층)을 완료한다. 탈락 조직을 수집하고 멸균 1X PBS (그림 1G)와 50 ㎖의 플라스틱 튜브에 배치합니다. </li></ol></li></ol> 2. 기계 세분화 및 효소 소화 <ol><li> 50 ㎖의 플라스틱 튜브에 멸균 1X PBS로 (단계 1.1.3에서) 탈락의 basalis 해부 조직 또는 (단계 1.2.3에서) 탈락의 parietalis을 씻으십시오. 실온에서 5 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 조직의 알약을 수집합니다. </li><li> 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 조직 펠렛 위에있는 뜨는을 대기음. 참고 : 그들은 적혈구 포함되어 있기 때문에이 시점에서, 펠릿은 매우 느슨. 펠릿의 부피에 대해 또는 3 ㎖ 미만이면, 세포 분리 용액 6 ml를 37 ℃로 미리 가온에 펠렛을 재 - 보류. 펠릿을 3 ml의 용적보다 더 크다면, 더 많은 세포 분리 용액을 추가 (토륨의 약 2 배를 추가조직 샘플의 전자 볼륨). </li><li> C 튜브에 균질 조직 (탈락의 basalis + 세포 분리 솔루션 또는 탈락 parietalis + 세포 분리 솔루션)를 전송합니다. </li><li> 자동 dissociator에서 C 튜브를 삽입하고 해당 프로그램을 실행합니다. 참고 : 탈락의 basalis의 프로그램이 실행 당 668 총 라운드 17 초 동안 실행됩니다. 탈락의 parietalis의 프로그램이 실행 당 235 총 라운드 37 초 동안 실행됩니다. 이 프로그램은 탈락의 basalis 또는 좋은 수율 및 세포 생존과 탈락의 parietalis에서 백혈구를 분리 정의하고있다. </li><li> 이러한 accutase로서 시판 세포 분리 용액으로 조직 다이제스트, 조직의 세분화를 따라 기계적; 부드러운 교반과 함께 37 ℃에서 45 분 동안 (단백질 분해 및 collagenolytic 효소를 포함하는 칵테일). </li></ol> 백혈구 3. 분리 <ol><li> 인큐베이션 후, dige로 1X PBS 10 ㎖를 추가stion 혼합물과 50 ml의 플라스틱 튜브에 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 전달합니다. 소화 혼합물의 끈적 거림에 따라, 하나 하나의 혼합물에 대한 몇 가지 세포 여과기를 사용해야 할 수도 있습니다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 300 XG에 1X PBS로 튜브와 원심 분리기를 입력합니다. 신중 세포 펠렛 위에 1X PBS를 제거하고 얼음처럼 차가운 FACS 완충액 5 mL를 펠릿을 다시 일시. 참고 : 6.1 단계로 이동, 함께 다형과 단핵 백혈구을 연구; 단핵 백혈구을 연구하기 위해, 3.3 단계로 진행합니다. </li><li> 15 ml의 플라스틱 튜브에 20 %의 5 ml의 밀도 구배 매체 (1.077 + 0.001 g / ㎖)를 첨가하고, 서서히 밀도 구배 매체의 상부에 세포 현탁액을 오버레이. 샘플 적층 동안, 세포 현탁액 밀도 구배 매체를 혼합하지 않는 것이 중요하다. </li><li> 브레이크없이 4 ℃에서 30 분 동안 500 XG에 스윙 아웃 로터와 원심 분리기. 그것은 세포와 L을 혼합 방지하기 위해 브레이크를 해제하는 것이 매우 중요합니다그라디언트입니다 osing. 백혈구 밀도 구배 매체 및 FACS 버퍼 사이의 계면에서 발견 될 것이다. </li><li> 피펫을 사용하여 매우 신중 외과 버퍼와 세포 파편을 포함하는 상위 계층을 제거합니다. 계면에서의 밴드는 탈락 단핵 세포와 다형 핵 백혈구의 일부를 포함하고 있습니다. </li><li> 새로운 15 ml의 플라스틱 튜브로 완전히 계면에 세포를 옮긴다. 외과 버퍼의 최소 3 배 이상의 볼륨을 추가합니다. </li><li> 세포 펠릿을 5 분 동안 300 XG 원심 분리기. 뜨는을 기음과 외과 버퍼로 세포를 씻어. RT에서 5 분 동안 300 XG에 다른 원심 분리하여 세포를 펠릿 화. 참고 : 6 단계를 참조하십시오, 모두 면역을 수행하려면 5 단계를 참조 셀 정렬을 수행하려면 4 단계를 참조 세포 배양을 수행 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 응용 프로그램 - 세포 배양 <ol><li> USI 가능한 세포 개수를 RPMI 배지 1640 1 ㎖의 단계 3.7에서 세포를 다시 일시자동 세포 계수기 또는 혈구와 트리 판 블루 용액 0.4 %를 ng를. </li><li> 1 × 106 세포 / ml의 세포 농도를 만들기 위해 RPMI 배지의 양을 추가한다. 셀은 문화에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 5. 응용 프로그램 - 기본 세포 배양을위한 대 식세포의 분리 <ol><li> 자기 CD14 마이크로 비드 (107 세포 당 20 ㎕의 비드)와 단계 3.7에서 세포를 라벨, CD14 + 세포를 분리하기 위해, 15 4 ℃에서 min으로하고, 자장을인가하여 다른 유형의 세포에서 분리 된 CD14 + 세포를 배양한다. MACS 완충액 및 자계의 제거와 2 세척 후에, MACS 완충액 자기 유지 CD14 + 세포를 용출. </li><li> 원심 분리 후, 다시 정지 세포 도금 (그림 2)에 대한 준비가 RPMI 배지 1640에서 세포 펠렛을. </li></ol> 6. 응용 프로그램 - 모두 면역 <ol><li> immunophenot의 세포를 사용하려면yping, 1X PBS 1 ㎖의 단계 3.7에서 세포를 다시 일시. 자동 세포 계수기 또는 혈구와 트리 판 블루 용액 0.4 %를 사용하여 가능한 세포를 계산합니다. </li><li> 고칠 생존 염료 (그림 3)과 세포를 레이블. 외과 버퍼로 두 번 세포를 씻고 얼룩 버퍼에있는 세포를 다시 일시 중지합니다. 4 ° C에서 15 분 동안의 FcR 차단에 품어. </li><li> 형광 색소에 접합 세포 항체를 추가합니다. 예를 들어,이 프로토콜에서, 항 CD3을 사용, 항 CD19, 항 CD14, 항 CD15 그리고 항 CD56 항체 (표 1). 어둠 속에서 4 ℃에서 30 분 동안 품어. </li><li> 1X PBS 2 세척 후, 세포를 유동 세포 계측기를 사용하여 염색 완충액 500 μL를 분석한다. 탈락 조직에서 발견 백혈구 하위 집단을 분석하는 데 사용 게이팅 전략의 표현은도 4에 도시되어있다. </li></ol>

저자는 이해 상충을 공개하지 않습니다.

인간의 산모 - 태아 인터페이스에서 백혈구 침투의 기능 및 표현형 특성의 특성은 임신 장애로 이어질 면역 메커니즘의 이해에 필수적이다. 몇 가지 기술은 임신 10,14,25,28,37,42,43에 걸쳐 인간의 모체 - 태아 인터페이스로부터 백혈구를 분리하기 위해 설명되었다. 그러나, 이들 기술들의 각각은 별개 항상 분리 된 세포의 생존 능력을 지정하지 않고, 가장 중요한 것은, 효소 또는 효소 결합 다른 사용이 필요 상이한 해리 시간을, 조직의 수량을 지정하지 않고. 여기에 설명 된 프로토콜은 생존의 높은 수율의 결과로 인간의 모체 - 태아 인터페이스에서 백혈구 (탈락의 basalis과 탈락의 parietalis)을 침투의 분리를 허용하고 상세한 상업 시약에 대한 정보, 버퍼 준비, 조직 수량 및 배양 시간 valida을 제공합니다우리의 실험실에서 테드. 백혈구 분리 공정의 제 중요한 단계 조직 해리이고; 이 단계는 기계적인 인종 차별 폐지 및 / 또는 효...

임신은 세 가지 면역 학적 상 특징 : 1) 주입 및 프로 - 염증 반응과 관련된 초기 태반이 (즉, 주입은 &#39;열린 상처&#39;과 유사) 2) 두 번째 임신과 면역 항상성이 산모 - 태아 인터페이스에서 주로 항 염증 상태를 통해 달성 임신의 세 번째 임신의 대부분; 3) 분만, 염증성 상태 1-7. 면역 세포는 모체 - 태아의 계면에서 염증 반응을 조절하는데 중요한 역할을하는 곳들이 풍부 임신 6-9 걸쳐 파악 변화. 인간으로, 산모 - 태아 인터페이스는 모성 (탈락) 태아 (융모막 또는 영양막 세포) 조직 사이의 직접 접촉의 영역을 나타냅니다. 1) 탈락 선 자궁강이 태반에 포함하지 않는 것이 parietalis과 병렬 인 :이 인터페이스는 포함융모막의 laeve에; 2)이 침입 trophoblasts (10) (그림 1)에 의해 침략하는 태반의 기초 판에있는 탈락의 basalis. 접촉이 지역의 친밀감은 산모의 면역 체계 11-13에 태아 항원 노출에 대한 조건을 만듭니다. 당연히 백혈구 전형적인 기질 형 세포 및 세포 선의 8,14,16 이외에 탈락 세포 8,9,14,15 30-40 %까지 포함한다. 산모 - 태아 인터페이스에서 백혈구의 역할은 영양막 세포의 침윤 (17)의 제한, 나선형 동맥 (18, 19)의 리모델링, 어머니의 허용 오차 12, 20의 유지 보수 및 노동 21-26의 개시를 포함하는 여러 프로세스를 포함한다. 적응 및 즉, T 세포, 대 식세포, 호중구, B 세포, 수지상 세포 및 NK 세포, 탈락 막 조직에서 확인되었다 면역계의 타고난 사지, 그 양의 백혈구비율 및 활성화 상태는 임신 6-10,12,14,24,27-30 걸쳐 공간적 및 시간적으로 변화시키는 것으로 나타났다. 백혈구 인구 및 / 또는 기능의 교란은 자연 유산 (31), 자간전증 (32), 자궁 내 성장 제한 32, 33, 및 조산 7,24과 연결되어 있습니다. 따라서, 인간의 모체 - 태아의 계면에서의 표현형 특성과 백혈구의 기능에 대한 연구는 임신 장애의 조절 곤란 면역 학적 경로의 해명을 촉진 할 것이다. 여러 매개 변수를 동시에 34 ~ 36의 정량 분석을 할 수 있습니다 유동 세포 계측법 된 표현형과 백혈구의 기능적 특성을 결정하는 데 사용되는 가장 강력한 도구 중 하나, 기술. 유동 세포 계측법에 의한 백혈구를 분석하기 위해, 단일 세포 현탁액 내의 백혈구의 분리가 필요하다. 따라서, 방법은 레 침투 분리하는산모 - 태아 인터페이스에서 kocytes들은 표현형 및 기능적 특성을 연구하기 위해 필요합니다. 몇 가지 방법이 인간 모체 - 태아 인터페이스 10,14,25,27,37-39로부터 백혈구를 분리하는 기술되었다. 일부는 기계 세분화 10,25,27,38을 적용하는 동안, 다른 사람은 조직 분리에 대한 효소 소화 37,40를 사용합니다. 기계적인 세분화가 낮은 수율 및 감소 된 생존 41과 생존 세포 표면 마커 보유 42에 영향을 미칠 수있는 효소 적 분해를 생성하기 때문에, 본원에 기재된 방법은 세포 생존을 손상시키지 않고 절연 백혈구의 수율을 증가시키는 효소 전처리와 부드러운 기계적 해리를 결합한다. 방법의 유사한 조합이 모체 - 태아의 인터페이스 (39)에서 탈락 조직으로부터 백혈구 분리에 효과적인 것으로 입증되었다. 따라서, 본 명세서에 설명 된 프로토콜을 포함 메카반대 메스, 면도날, 또는 수술 가위 10,28 전통 닦지에 비해 시간과 노동을 절약하면서 일관성을 증가시키는 자동 조직 dissociator와 nical 세분화. 티슈 해리를 위해 선택된 효소 Accutase이었다. 일반적으로 사용되는 43 콜라게나 제와는 달리, 44 디스 파제, 트립신 45 Accutase (세포 분리 용액)을 일반적으로 단백질 가수 분해하고 효율적인 아직 부드러운 (46, 47)의 해리에 기여 collagenolytic 활동 모두를 결합한다. 분리 후, 백혈구는 밀도 구배 원심 분리에 의해 탈락 막 세포의 전체 인구에서 농축된다. 각종 밀도 구배 매체는 이전 퍼콜 (콜로 이달 실리카 입자의 현탁액) (48) 및 피콜 (합성 고 분자량의 중합체 자당) (49)이다 가장 일반적인 그중, 이용되어왔다. 크로스 폴리머에 의한 분리의 우수한 효율 previo있다usly 50를 도시하고, 본 명세서에서 더 설명 프로토콜이 밀도 구배 매체 단핵구의 충분히 높은 순도를 생산하고 있음을 증명한다. 따라서, 본원에 기재된 프로토콜은 인간 탈락 조직으로부터 백혈구를 분리하는 밀도 구배 매체 (1.077 + 0.001 g / mL)로 자동 티슈 dissociator, 세포 분리 용액과 소화 효소, 백혈구 분리하여 기계적 조직의 세분화를 결합한다. 이 프로토콜은 세포 생존과 함께 세포 표면 항원을 유지하는 입증되었다. 고립 된 백혈구는 유동 세포 계측법 및 체외에서 기능 연구와 면역 표현형을 포함 여러 애플리케이션에 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Dissection</td></tr><tr><td>Sterile dissections tools: 수술용 가위, 집게, 그리고 세밀한 끝 핀셋&nbsp;</td><td>모든 공급 업체</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>1X 인산염 완충 식염수 (PBS)</td> <td>Life Technologies</td><td></td> <td>(1X PBS)</td></tr> <tr><td>크고 작은 페트리 접시</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr> < colspan = "4 ">Dissociation</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td> <td>(cell detachment solution)</td></tr> <tr><td>멸균 2 ml 안전 잠금 원추형 튜브</td><td>Any 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50ml 원추형 원심분리기 튜브</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m 세포 여과기</td><td>FALCON/Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>의 트랜스퍼 피펫</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td>의</tr><tr><td>C 튜브</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">cell culture</td></tr><tr><td>RPMI culture medium 1640&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td>(1X) (10% FBS 및 1% P/S)</td></tr><tr><td>플라스틱 챔버 슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Thermo Scientific Corporation</td><td>HEPA Class 100</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Fisher Scientific</td><td>ISOTEMP 110</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수기</td><td>Nexelcom</td><td>Cellometer Auto2000</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>올림푸스</td><td>올림푸스 CKX41</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">세포 분리</td></tr><tr><td>MS 열</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>세포 분리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu; m 사전 분리 필터</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-40</td><td></td></tr><tr><td>멀티스탠드</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 안전 잠금 원뿔형 튜브</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS 버퍼&nbsp;</td><td></td><td></td><td>(0.5% 소 혈청 알부민, 2 mM EDTA 및 1X PBS)</td></tr><tr><td colspan="4"> 시약</td></tr><tr><td>FcR 차단</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>(Fc Block)</td></tr><tr><td>항인간 세포 표면 항원 항체&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>(표 1)</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 생존 염료</td><td>BD Biosciences</td><td>564406</td><td></td></tr><tr><td>Lyse/Fix buffer&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>346202</td><td></td></tr><tr><td>FACS 완충액&nbsp;</td><td></td><td></td><td>(0.1% BSA, 0.05% 아지드화 나트륨 및 1X PBS, pH=7.4)</td></tr><tr><td>염색 완충액&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>554656</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 솔루션 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-011</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>20% 밀도 구배 매체(1.077 + 0.001 g/ml)</td></tr><tr><td colspan="4">추가 기기</td></tr><tr><td>쉐이커가 있는 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>MAXQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td>LSR-Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>SpinChron DLX</td><td></td></tr><tr><td>진공 시스템</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자동 조직 해리기&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>젠틀MACS 해리게이터</td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 산모 - 태아 인터페이스에서 백혈구의 분리

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

임신은 생식 조직과 모성 - 태아 인터페이스에서 백혈구 (탈락의 basalis과 탈락의 parietalis)의 침윤을 특징으로한다. 이 인터페이스는 산모와 태아 조직 사이의 접촉의 해부학 적 위치이다; 따라서, 임신 동안 작업의 면역 사이트이다. 산모 - 태아 인터페이스에서의 침투 백혈구는 전달의 중심 주입 역할, 임신의 유지 보수 및 타이밍을한다. 따라서 이러한 백혈구의 표현형 및 기능 특성화 임신 장애로 이어질 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다. 몇몇 프로토콜들은 탈락의 basalis 및 탈락의 parietalis로부터 백혈구 침윤 분리하기 위해 설명되었다; 그러나, 배양 시약, 효소, 및 시간에서의 일관성 결여 어려운 이들 결과를 비교한다. 본원에 기재된 부드러운 기계적 및 효소 DISS의 사용을 겸비한 신규 한 접근법ociation 기술 모체 - 태아의 계면에서의 인간 조직에서 분리 된 백혈구 세포 및 세포 마커의 생존과 무결성을 보존한다. 제외하고 모두 면역, 세포 배양, 세포 분류에서,이 프로토콜의 미래 응용 프로그램은 많고 다양하다. 이 프로토콜에 따라, 절연 백혈구 DNA를 시험 관내 백혈구 기능 (즉, 식세포 작용, 세포 독성 T 세포 증식 및 가소성 등)에 메틸화, 표적 유전자의 발현 및 활성 산소 종의 생성을 결정하는데 사용될 수있다 산모 - 태아 인터페이스에서. 또한, 설명 된 프로토콜을 사용하여,이 연구소는 산모 - 태아 인터페이스에서 새로운 희귀 백혈구를 설명 할 수있다.

. 산모 - 태아 인터페이스에서 인체 조직 (탈락의 basalis과 탈락의 parietalis)의 해부는 그림 1에 나타낸다이 절차는 탈락의 basalis (- D 그림 1A)를 포함하는 기초 판의 절개를 포함한다. 탈락 된 basalis는 기부 플레이트 (도 1C)에서 태반 융모 (태아 측)을 제거함으로써 얻어진다. 탈락의 parietalis 부드럽게 융모 막 (그림 1E - F)를 긁어에 의해 수집된다. (2) 자기 세포 정렬을 사용하여 용어 임신에서 탈락의 parietalis에서 수집 고립 된 대 식세포 (CD14의 +)의 형태를 보여줍니다. 격리 식세포는 배양 3 일 후에 사이토 카인을 방출 할 수있는 기능을 유지 (데이터는 보이지 않음). 탈락 된 basalis 및 탈락의 parietalis로부터 분리 가능한...

본원에 설명된 것은 인간 모체-태아 계면(human maternal-fetal interface)인 decidua basalis와 decidua parietalis의 침투 백혈구를 분리하고 추가로 연구하기 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 세포 표면 마커의 무결성을 유지하고 유세포 분석 분석으로 입증된 바와 같이 다운스트림 응용 분야에 충분한 생존 세포를 생성합니다.

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

본 절차의 전반적인 목적은 인간의 탈락막(decidua), 기저 탈락막(basalis) 및 벽측 탈락막(decidua parietalis)에서 백혈구를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 태반에서 인간의 탈락막 조직을 박리하여 수행합니다. 다음으로, 기계적 해리와 효소 소화를 통해 탈락막 조직을 분해합니다.그 후 100 µm 셀 스트레이너를 사용하여 세포 현탁액을 여과하며, 이때 1xPBS로 세척합니다. 4 °C에서 300 G로 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 얻습니다. 마지막으로, 세포 현탁액을 밀도 구배 용액 위에 얹어 원심분리한 후 백혈구가 포함된 계면을 수집합니다. 최종적으로 분리된 백혈구는 면역 표현형 분석, 세포 배양 및 기능 연구에 사용할 수 있습니다.이 기술의 기존 방법(기계적 해리 또는 효소 소화 등) 대비 장점은 기계적 조직 분해를 자동 조직 연합기와 결합하고, Accutane을 이용한 주제적 소화 및 분변 구배를 이용한 백혈구 분리를 결합했다는 점입니다. 이 프로토콜은 세포 생존력 내에서 세포 표면 항원을 보존하는 것으로 입증되었으며, 그 영향은 산전 합병증의 병인과 관련된 모체-태아 인터페이스에서 침윤된 백혈구의 기능적 및 표현형 특성에 대한 이해로 확장됩니다. 연구 목적의 인체 시료 수집 및 활용은 Eunice Kennedy Shriver, national Institute of Child Health and Human Development, national Institutes of Health, department of Health and Human Services 및 Wayne State University의 기관생명윤리위원회(IRB)로부터 승인되었습니다.조직 샘플을 수집하기 전, 모든 임산부로부터 서면 동의서를 받았습니다. 우선, 태반의 한쪽 가장자리에서 기저판 조각을 절개합니다. 이를 멸균 절단판 위에 놓으며, 이때 털과 같은 모양의 붉은색 융모가 있는 면이 위를 향하게 합니다.기저판은 매끄럽고 연한 붉은색을 띠며, 조직을 1×PBS에 적신 상태에서 날카롭고 끝이 뾰족한 가위와 포셉을 사용하여 융모 조직과 혈관을 제거합니다. 2~3조각을 수집하고 PBS를 사용하여 혈액을 완전히 씻어냅니다. Decidua parietalis를 분리하기 위해 10cm × 10cm 크기의 정사각형 조각을 박리합니다.혈전이 포함되어 있으며 보통 연한 노란색을 띠는 chorion 부위가 위를 향하도록 보드 위에 놓습니다. 다음으로, 정밀 핀셋을 사용하여 가능한 한 많은 혈전을 제거합니다. 그런 다음 멸균된 1x PBS로 PBS가 투명하게 흘러나올 때까지 막을 헹굽니다.일회용 멸균 세포 스크래퍼를 사용하여 멤브레인에 PBS를 적신 상태에서 탈락막 층을 부드럽게 긁어냅니다. 탈락막 조직을 수집하여 멸균 PBS가 담긴 50 milliliter 플라스틱 튜브에 넣고 탈락막 조직(decidua Bali 또는 deci paral)을 기계적으로 분리합니다. 먼저 50 milliliter 튜브에 담긴 조직을 멸균 1X PBS로 세척합니다.그 다음 조직을 300 G, 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 조직과 분리 용액을 재현탁한 후, 균질화된 조직을 C 튜브로 옮깁니다.튜브를 자동 조직 해리기에 넣고 해당 프로그램을 실행합니다. 상용 세포 분리 용액(예: Accutane)을 사용하여 조직을 해리하고, 37°C에서 가볍게 흔들어주며 45분 동안 배양하여 조직을 소화시킵니다. 배양이 끝나면 소화 혼합물에 10 mL의 PBS를 첨가하고, 100 µm 세포 여과기를 통해 50 mL 튜브로 옮깁니다. 조직의 점성에 따라 한 번의 소화물을 여과하는 데 여러 개의 여과기가 필요할 수 있습니다.PBS를 사용하여 튜브를 채운 다음, 300 G의 원심력과 상온에서 5분 동안 원심 분리합니다. 상층액 S를 조심스럽게 제거하고, 5 mL의 얼음처럼 차가운 fax buffer를 사용하여 세포 펠렛을 재현탁합니다. 단핵 백혈구를 연구하려면, 15 mL 플라스틱 튜브에 20% 밀도 구배 배지 5 mL를 추가합니다.그다음 세포 현탁액을 천천히 위에 층이 섞이지 않도록 주의하며 겹쳐줍니다. 4°C에서 500 G의 스윙 아웃 로터 원심분리기를 사용하여 브레이크 없이 30분 동안 원심분리하면, 밀도 구배 매질과 FACS 버퍼 사이의 경계면에 백혈구가 위치하게 됩니다. 이어서 FACS 버퍼와 세포 잔해를 포함하는 상층액을 조심스럽게 피펫으로 제거합니다. 경계면에는 잔류 단핵구와 일부 다형핵 백혈구가 포함되어 있습니다.이 층을 새로운 15 milliliter 튜브로 옮깁니다. 튜브에 최소 3배 부피의 fax buffer를 추가한 후, 300 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포를 펠릿화하기 위해 상층액을 흡입하여 제거하고, 세포 배양을 수행하기 전 fax buffer로 세포를 두 번째로 세척합니다.텍스트 프로토콜에 따른 분리 및 면역표현형 분석 결과로, 본 그림은 자기 세포 분리를 이용하여 만삭 임신의 decidua pariahs에서 수집한 분리된 대식세포의 형태를 보여줍니다. 분리된 대식세포는 3일간의 배양 후에도 사이토카인을 방출하는 능력을 유지합니다. 밀도 구배 분리 후 decidua, baus 및 decidua paral에서 분리된 생존 세포의 수득률을 측정하였습니다.여기에 표시된 것과 같이 고정 가능한 생존율을 사용했을 때, 각 데시 세포 집단(deci cell population)의 생존율은 90% 이상이었습니다. 가시적 게이팅 내의 다형핵 및 단핵 백혈구를 분석하기 위한 게이팅 전략이 여기에 제시되어 있으며, 여기에는 T 세포, 중성구, 대식세포, NK 세포, NK T 세포 및 B 세포가 포함됩니다. 만삭 임신 시, 이 수치는 만삭 임신에서 분리된 잔류 세포로부터 얻은 중성구, 대식세포, T 세포 및 B 세포를 보여줍니다.마지막으로, 만삭 임신에서 분리된 잔여 세포로부터 얻은 NK, NKT 및 T 세포가 이 플롯 세트에 나타나 있습니다. 숙달되면 이 기술은 적절하게 수행했을 때 3시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 혈액 오염을 방지하기 위해 조직을 충분히 세척하고, 절차 중에 조직과 효소 칵테일을 계속 관찰하는 것이 중요합니다.

isolation-of-leukocytes-from-the-human-maternal-fetal-interface

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

murine 두뇌에서 침투 leukocytes을 얻는 빠른 방법을 설명합니다. 이 방법은 연속 Percoll 기울기와 백혈구 - 농축 레이어를 선택하고 정화 불연속 Ficoll 기울기를 사용합니다. 절연 leukocytes 그때 흐름 cytometric 측정에 의해 특징 수 있습니다.

브레인 - 침투 Leukocytes의 분리

여기 탯줄 혈액에서 전구체의 하위 집합 B-세포를 분리에 대한 프로토콜을 설명합니다. 핵산의 충분한 수량과 품질은 세포에서 추출되어 DNA 또는 RNA를 이용 후속 assays에 사용 될 수 있습니다.

탯줄 혈액에서 전구체 B-세포 하위 집합의 절연

본 명세서는 마우스의 모체-태아 계면(자궁, 십후 및 태반)에서 조직의 침투하는 백혈구를 분리하고 분석하기 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 대부분의 세포 표면 마커의 무결성을 유지하고 유세포 분석을 포함한 다운스트림 응용 분야에 충분한 생존 가능한 세포를 생성합니다.

산모 - 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에서 백혈구의 분리

여기에서 우리는 고립과이 조직에서 중간 엽 줄기 / 간질 세포 (MSC)의 확장 다음에 인간의 장기 태반에서 태아와 모체 조직의 절개 방법을 설명합니다.

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

기본 인간의 태반 (융모) 및 탈락 기관 배양을 설정하는 간단한 방법을 설명한다. 융모와 탈락 기관 배양은 인간의 모체 - 태아 인터페이스에서 발병 기전을 연구하기위한 귀중한 도구입니다. 통성 세포 내 세균 리스테리아 균에 감염이 증명된다.

인간의 태반과 탈락 오르간 문화는 산모 - 태아 인터페이스에서 감염을 연구하는

여기서, 우리는 인간 탯줄 (UC)와 코드에 태아 태반 샘플 분리 용 (CL), 왓슨의 젤리 (WJ), 코드 - 태반 접합부 (CPJ) 태아 태반 (FP) 라이닝 박리를위한 프로토콜을 제시 상기 이식편 배양 기술을 이용하여 중간 엽 간질 세포 (MSC들)의 특성화.

인간 제대혈 및 태아 태반에서 중간 엽 기질 세포의 분리 및 특성

이 프로토콜은 응용 프로그램 (예: immunocytochemistry, cytometry, 등)의 다양 한 사용 될 수 있는 기간 placentae의 태아 세포 막에서 수집한 기본 인간 decidual 세포의 고립에 대 한 메서드를 보여 줍니다 목표로 임신 합병증에 다른 세포 인구의 역할...

기간 Placentae의 태아 세포 막에서 기본 인간 Decidual 세포의 고립

모유는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)를 전송하지만 HIV에 감염된 어머니가 모유로 기르는 유아의 15 %만이 감염됩니다. 모유로 기르는 유아는 ~ 105-10 8 이 세포가 understudyed 하더라도 매일8 개의 모계 백혈구를 섭취합니다. 여기에서 우리는 모유 백혈구의 격리및 그들의 식세포 용량의 분석을 기술합니다.

HIV 표적의 항체 의존적 세포 식세포 분석에서 사용하기 위해 인간 모유에서 백혈구의 분리

이것은 임신과 비 임신 마우스 둘 다에서 자궁 림프세포를 격리하는 방법입니다. 이 방법은 FACS phenotyping, 세포 선별, 기능 적 작용, RNA-seq 및 프로테오믹스와 같은 여러 다운스트림 응용 제품에 사용할 수 있습니다. 여기서 프로토콜은 혈류 세포측정에 의한 표현형 그룹 1 자궁선천성 림프구 세포를 전파한다.

유동 세포측정에 의한 분석을 위한 자궁 내 선천 림프구 세포의 격리

이 프로토콜은 인플루엔자 감염 후 안정적인 상태에서 마우스 폐에서 살아있는 면역 및 비면역 집단을 격리하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한 상피 및 골수성 세포 부분 집합을 식별하기 위한 게이팅 전략을 제공합니다.

Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung(쥐 폐에서 살아있는 골수성 및 상피 세포 집단의 분리)

이 프로토콜은 인간 기저 배반의 소추모 및 융모막에서 1차 HLA-G+ 외 영양층(EVT)의 정제, 특성 분석 및 배양을 가능하게 합니다. 1차 EVT 배양은 96시간 동안 생존 가능성을 유지하여, 샘플이 일치한 모체 면역세포와의 공동 배양과 이들의 상호작용에 대한 유동 세포 및 분자 분석을 가능하게 합니다.

표현형 및 기능 분석을 위한 HLA-G+ 외 영양층 정제 인간 임기 태반 조직에서

배우세요 인간 산모-태아 인터페이스에서 백혈구를 분리하는 방법을. 기계적 및 효소적 조직 분해와 밀도 구배 원심분리를 사용하여 세포 표면 마커를 보존하고 면역표현형 분석이 가능한 생존 세포를 얻습니다.

인간의 산모 - 태아 인터페이스에서 백혈구의 분리

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