산모 - 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에서 백혈구의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 쥐 모체 태아 계면의 침투하는 백혈구를 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 자궁, 태반 및 eua를 채취하여 수행됩니다. 조직은 효소 용액에서 기계적 해리에 의해 분해된 후 후속 효소 분해가 이루어집니다.

그 결과 생성된 세포 현탁액을 여과하고 세척한 다음, 관심 면역 세포를 소 태아 혈청 구배에 의해 생존 불가능한 세포와 같은 세포 파편에서 분리합니다. 궁극적으로 분리된 백혈구는 면역표현형 세포 배양 또는 세포 분류에 사용할 수 있습니다. 우리는 모체 태아 계면에서 백혈구를 분리하기 위한 프로토콜을 확립하려고 할 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸고, 발표된 방법이 우리가 관심을 갖고 있는 희귀 면역 세포의 분리를 촉진하지 않는다는 것을 깨달았습니다.

시연 : 제 실험실의 연구원 인 Mile El Sanchez Rodriguez Marcina Hernandez가 시술 할 것입니다 : 모체 태아 계면 조직을 수집하기 위해 멸균 수술 용 가위를 사용하여 피부와 근육 조직의 하복부 부분을 완전히 제거하는 것으로 시작합니다. 다음으로, 집게를 사용하여 자궁과 난소가 보일 때까지 다른 모든 장기를 옆으로 움직입니다. 그런 다음 자궁을 복막강 밖으로 옮깁니다.

UCT 원위부의 난소와 각 자궁 각의 자궁 난관 접합부를 찾습니다. 그런 다음 자궁 난관 접합부를 절개하여 자궁 혈관을 포함하는 mesentary에서 뿔을 분리합니다. 복막강에서 자궁 뿔을 분리하기 위해 자궁 경부를 절제합니다.

그런 다음 수술용 가위를 사용하여 자궁경부와 뿔의 아래쪽 부분 사이를 절개하고 자궁 뿔이 열리지 않도록 자궁경부의 일부를 붙인 상태로 둡니다. 10-15밀리리터의 PBS로 채워진 큰 페트리 접시에 뿔과 자궁경부를 담가 착상 부위에 수분을 공급합니다. 조직에서 지방을 제거하십시오.

그런 다음 집게로 뿔을 제자리에 고정합니다. 자궁에서 착상 부위 중 하나를 제거하기 위해 착상 부위를 가로 절단합니다. 이제 그 부위를 제자리에 고정하고 태반 및 잔류 조직에 인접한 자궁 벽을 작게 절개합니다.

조직이 자궁벽과 맥락막막에서 분리될 때까지 태반과 데시두아의 둘레를 다듬습니다. 그런 다음 태반과 부속된 탈피 조직을 3-5밀리리터의 PBS가 들어 있는 신선한 페트리 접시에 옮깁니다. PBS가 있는 다른 페트리 접시에 태아를 옮기고 가는 끝 핀셋을 사용하여 태반 표면에서 흰색 회색 데시 조직을 부드럽게 벗겨냅니다.

태반 및 ECI 조직의 무결성을 유지하기 위해 주의를 기울입니다. 태반과 ECI 조직을 PBS로 채워진 두 개의 개별 라벨이 붙은 페트리 접시로 나눕니다. 그런 다음 가는 핀셋을 사용하여 chorio Allen toic membrane의 자궁 벽을 부드럽게 제거하고 이 자궁 조직을 PBS로 채워진 새 페트리 접시에 넣어 조직을 기계적으로 해리합니다.

다음으로, 100-150 밀리그램의 자궁 디스크와 태반 조직 2개를 옮기고 개별적으로 라벨을 붙인 2개의 밀리리터 원추형 튜브를 이식합니다. 각 튜브에 하나씩 500마이크로리터의 저온 효소 용액을 추가합니다. 그런 다음 멸균 가위를 사용하여 현탁액이 나타날 때까지 2분 이상 각 조직을 기계적으로 해리하지 않습니다.

유백색 외모를 개발합니다. 각 튜브에 하나씩 500마이크로리터의 차가운 효소 용액을 더 넣고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 80RPM의 부드러운 안와 교반으로 모든 조직을 배양하고 30-35분 후에 튜브를 얼음 위에 올려 소화를 멈춥니다.

이제 100 미크론 스트레이너를 통해 각 조직 슬러리를 개별적으로 표시된 50 밀리리터 원추형 튜브에 변형시키고 각 2 밀리리터 튜브와 스트레이너를 20 밀리리터의 PBS로 2-3 회 세척하여 모든 세포를 수집합니다. 모든 세포가 여과되면 세포를 스핀다운하고 펠릿을 방해하지 않고 SUP 나틴을 조심스럽게 흡인합니다. 분리된 백혈구와 기질 세포를 와류 없이 1ml의 RPMI 배양액 배지에 부드럽게 현탁시킵니다.

그런 다음 각 조직에 대해 500마이크로리터의 소 태아 혈청을 5밀리리터 폴리스티렌 튜브에 넣고 혈청에 세포 현탁액을 천천히 오버레이합니다. 마지막으로, 모든 세포가 중첩되면 원심분리기의 세포가 끊어지지 않고 흡인되면 세포 펠릿을 건드리지 않고 supinate를 흡입합니다. 이 이미지에서 F의 형태는 정산 조직과 자궁 조직에서 분리된 4개의 80 양성 대식세포입니다.

16.5일 후에는 모계 및 태아 계면 조직의 세포가 표시됩니다. 이 방법에 의한 분리 후 70% 이상의 생존력을 나타내며 거울 및 모체 태아 계면의 조직에서 분리된 CD 11 C 백혈구 하위 집단을 coex로 발현하는 대식세포의 비율이 높은 호중구 대식세포, T 세포, NK 세포 및 수지상 세포 집단을 포함합니다. 또한 B 세포 및 CD를 포함하고, 4개의 양성 T 세포, CD 8개의 양성 T 세포 및 CD 3개의 양성 CD 4개의 음성 CD 8개의 음성 T 세포도 이 밀도 플롯에서 관찰된 바와 같이 분리됩니다.

좋아, 이 절차를 시도하는 동안 인큐베이터에서 올바른 온도를 설정하기 위해 조직과 효소 칵테일을 얼음 위에 보관하고 이 절차에 따라 소화하는 동안 조직을 과도하게 조작하지 않는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 면역 표현형 분석, 세포 배양, 세포 분류 및 D-N-A-R-N-A 분리와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 모체 태아 계면, 자궁, 태반에서 침투하는 백혈구를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.