원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

다음 실험의 전반적인 목표는 원자력 현미경을 사용하여 상 분리막의 물리적 특성을 이미지화하고 조사하는 것입니다. 이는 먼저 딜리오, 포스파티딜콜린, fgo, 미엘린 및 콜레스테롤을 2:2 대 1의 비율로 혼합하여 위상 분리 지질 혼합물을 형성함으로써 달성됩니다. 다음으로, 지지된 지질 이중층은 원자력 현미경을 사용하여 리포좀 현탁액을 MICA 표면에 증착하여 제조됩니다.

그런 다음 이중층의 표면을 스캔하여 높이와 같은 구조적 특징을 측정할 수 있는 지형 이미지를 생성합니다. 다음으로 힘 분광법은 이중층의 물리적 특성, 특히 파괴력과 멤브레인 두께를 조사하기 위해 이중층의 특정 영역에서 수행됩니다. 궁극적으로 결과는 FM 이미지와 힘 곡선을 기반으로 서로 다른 지질 상 간의 특성 차이를 보여줍니다.

형광 현미경 검사와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 FM이 샘플에서 조사할 수 있는 해상도와 추가 특성이 증가한다는 것입니다. 이 방법은 생물학적 막의 구조 및 이러한 막에 내장된 단백질과 같은 생물 물리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 우리는 또한 막의 물리적 특성을 살펴보고 구성 또는 막 활성제의 추가가 이러한 특성을 어떻게 변화시킬 수 있는지 모니터링 할 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 샘플의 취약한 특성 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이는 시료 준비, 캔틸레버 취급 선택 및 FM 이미징 및 분광학 조건에 영향을 미칩니다.먼저 DOPC, 스피노, 미엘린 및 콜레스테롤을 원하는 농도의 클로로포름으로 용해합니다. 그런 다음 18.38 마이크로 리터의 DOPC, 17.1 마이크로 리터의 노래 미엘린 및 11.3 마이크로 리터의 콜레스테롤을 결합하여 총 지질 1 밀리그램과 각각 2 대 2 : 1의 몰 비율로 용액을 만듭니다.

볼텍싱으로 용액을 혼합하고 질소와 같은 불활성 가스를 사용하여 혼합물을 건조시킨 다음 최소 1시간 동안 진공 상태에서 더 건조시킵니다. 다음으로, 건조된 지질을 PBS 100마이크로리터에 10밀리리터당 10밀리그램의 농도로 용해시킵니다. 소용돌이가 약 1분 동안 격렬하게 혼합됩니다.

다중 층류 소포를 포함하는 흐린 현탁액을 얻기 위해. 바이알 측면에 지질 필름이 부착되어 있지 않은지 확인하십시오. 10마이크로리터의 다중 층류 지질 현탁액을 취하고 150마이크로리터의 지지된 지질 이중층 완충액을 추가합니다.

그런 다음 용액을 혼합하여 2밀리리터의 뚜껑을 씌운 작은 유리 바이알에 옮기고 파라 필름 초음파 처리로 밀봉합니다. 혼합물을 실온에서 욕조에서 10 분 동안 초음파 처리합니다. 이 시간 동안 용액은 투명해져야 하며 직경이 약 50나노미터인 작은 uni 또는 소포를 생성해야 합니다.

유리 덮개를 물에 넣은 다음 에탄올을 씻은 다음 자연 건조시킵니다. 다음으로 Micah 디스크를 제거하고 접착 테이프를 사용하여 바깥 층을 벗겨냅니다. 투명한 광학적으로 투명한 접착제 한 방울을 사용하여 MICA 디스크를 커버 슬립에 부착합니다.

그런 다음 진공 그리스를 사용하여 플라스틱 실린더를 MICA에 부착하고 누출이 없는지 확인합니다. 전체 리포좀 용액을 운모에 직접 파이프를 연결하고 140마이크로리터의 지지된 지질 이중층 완충액을 추가하여 300마이크로리터의 부피에 도달합니다. 다음으로, 0.9 마이크로 리터의 1 몰 염화칼슘 용액을 첨가하여 3 밀리 몰의 칼슘의 최종 농도에 도달하고, 섭씨 37 도에서 2 분 동안 샘플을 배양 한 다음, 이 단계에서 섭씨 65도에서 최소 10분 동안 지원된 지질 이중층 버퍼를 섭씨 65도로 예열합니다.

샘플이 마르지 않도록 필요한 경우 버퍼를 추가합니다. 커버 슬립으로 샘플 챔버를 덮으면 샘플의 수분을 유지할 수 있습니다. 그런 다음 예열 지지된 지질로 샘플을 10-15회 헹구어 칼슘과 융합되지 않은 소포를 제거합니다.

세탁 단계에 따라 이중층이 건조되지 않도록 세탁 단계에서 각별히 주의하십시오. 지원되는 이중층을 실온으로 냉각합니다. 원자력 현미경으로 측정하기 전에 원자력 현미경 또는 FM을 설정하여 용액 내 지질 이중층의 이미징을 수행합니다.

제조업체의 사양에 따라 접촉 모드를 사용하여 샘플에 버퍼를 추가하여 전체 실험 동안 버퍼에 담근 상태를 유지합니다. A FM에 샘플을 장착tage 모든 방진 모듈이 켜져 있는지 확인하십시오. 시스템이 평형을 이루고 열 드리프트를 줄일 때까지 최소 15분 동안 기다립니다.

다음으로, 접촉이 이루어질 때까지 부드러운 FM 캔틸레버 팁을 사용하여 접촉 모드에서 샘플에 접근합니다. 이중층은 매우 약하기 때문에 접촉 모드 이미징 중에 A FM 팁의 설정점을 최소화하여 힘을 최소한으로 유지하고 샘플과의 접촉을 유지하면서 열 드리프트를 수정하십시오. 이미징이 완료되면 각 스캔 라인을 다항식 레벨링 기능에 맞춰 이미지를 처리합니다.

멤브레인과의 접촉을 잃은 스캔에 대해 라인 제거를 수행합니다. A FM 제조 회사의 독점 소프트웨어를 사용하여 전기 신호를 힘 측정으로 올바르게 변환하는지 결정하기 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 캔틸레버를 보정합니다. 이중층의 영역을 이미징한 후 이중층에서 5미크론 x 5미크론 영역을 선택하여 힘 분광법을 수행합니다.

해당 영역의 16 x 16 그리드에서 힘 곡선을 취하도록 AFM을 설정하여 영역당 256개의 힘 곡선을 생성합니다. 그런 다음 Z piso 변위를 400나노미터로 설정합니다. 이것은 z piezo의 최대 이동 범위를 결정하고 캔틸레버가 측정 사이에 샘플에서 완전히 후퇴했는지 확인합니다.

다음으로 접근 속도를 초당 800나노미터로 설정하고 후퇴 속도를 초당 200나노미터로 설정합니다. 또한 이 경우 각 힘 곡선에 대한 최대 목표 힘을 12나노 뉴턴으로 설정합니다. 모든 매개변수를 설정한 후 A FM 소프트웨어의 실행 버튼을 눌러 힘 곡선을 획득합니다.

각 조건에 대해 최소 500개의 힘 곡선을 구하여 좋은 통계량을 보장하고, 값의 히스토그램을 플로팅한 다음, 분포의 피크와 너비를 구하기 위해 히스토그램을 가우스 분포에 피팅합니다. 이 연구를 사용한 지질 조성으로 인해 두 개의 주요 막 영역이 형성됩니다. 핑(fing), 미엘린(myelin), 콜레스테롤(cholesterol)로 구성된 액체 정렬 영역(liquid ordered region)과 주로 DOPC로 구성된 액체 무질서 영역이 있습니다.

A FM 이미징의 높이 프로파일은 높이 프로파일을 보고 멤브레인 구조에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있습니다. 이중층 두께는 멤브레인 결함의 존재를 활용하여 측정할 수 있습니다. 높이 맵은 정렬된 단계와 무질서한 단계 사이의 높이 차이를 측정하는 데에도 사용할 수 있습니다.

force spectroscopy 모드에서 파생된 force curves는 여기에 표시된 것처럼 force curve의 정점에서 force 값을 vining하여 파괴력을 측정하는 데 사용됩니다. 또한, 멤브레인 두께는 힘 곡선의 피크에서 거리 값까지 거리 값을 빼서 파생할 수 있습니다. 힘 곡선이 다시 상승하기 시작하면 이 절차를 시도하는 동안 B 레이어링 솔루션을 유지하고 FM 어셈블리를 지속적으로 모니터링하여 팁에 대한 열 드리프트 및 D 축적의 영향을 수정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

컨포칼 형광 현미경 검사와 같은 다른 방법은 멤브레인 역학과 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 레이어가 지원하는 준비를 하고 FM을 사용하여 이러한 이중층의 물리적 특성을 이미지화하고 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.