Name: 원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 배우세요 원자 힘 현미경을 이용해 지지 지질 이중층의 구조와 역학적 특성을 분석하는 방법을. 고해상도 이미징과 힘 분광학을 통해 막 두께와 돌파력을 정량화하여 생물학적 막의 물리적 특성을 연구할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 (NO. 0,312,040 부여) 막스 플랑크 협회, 독일 암 연구 센터, 튀빙겐 대학과 Bundesministerium 대 Bildung 놀이 Forschung에 의해 지원되었다. 우리는 우리가이 원고의주의 독서의 힘 곡선 데이터와 박사 야콥 Suckale의 분석을 자동화 도와 에드워드 헤르만 감사합니다.

지원 지질 이중층 1. 준비 (SLB) 11,12,21 <ol><li> 지질 혼합 및 다중 층 소포 현탁액의 준비 <ol><li> 사전에 다음과 같은 버퍼를 준비합니다. <ol><li> 2.7 mM의 KCl을, 농도의 PBS 완충액을 준비가 1.5mm KH 2 PO 4, 8 mM의 나 2 HPO 4, 및 137 mM의 염화나트륨, pH가 7.2. </li><li> 150 mM의 염화나트륨, 10 mM의 HEPES, 산도 7.4의 농도에서 SLB (지원 지질 이중층) 버퍼를 준비합니다. </li><li> 1 M 염화칼슘 (2)의 솔루션을 준비합니다. </li></ol></li><li> 원하는 농도의 클로로포름에 녹인 다음 지질 : 예를 들어, 디 - 올레 일 포스파티딜콜린 10 ㎎ / ㎖의 25 ㎎ / ㎖ 및 콜레스테롤 (Chol을) 25 ㎎ / ㎖, 스 핑고 미엘린 (SM)의 (DOPC). </li><li> 2 : 1 DOPC : SM : Chol을 몰 비율이 총 지질의 1 mg을 가진 솔루션을 만들기 위해 DOPC의 18.38 μL, SM의 17.10 μL 및 Chol을의 11.30 μl를 가져 가라. conce을 기반으로 그에 따라 볼륨을 변화1.1.2에서 제조 지질 ntrations. 2 : 1 DOPC : SM : Chol을, 멤브레인 (25)의 위상 특성을 변경한다 몰비를 변화하지만, 2의 몰비를 유지한다. </li><li> 텍싱에 의해 완전히 솔루션을 섞는다. 하나는 형광 현미경에 의해 이중층를 시각화하고자하는 경우는 0.05 몰 %로 지질 형광 염료를 추가한다. 주 : 장쇄 dialkylcarbocyanines의 가족,처럼, DII 및 DIO는 넓은 파장 범위에 걸쳐 이상적으로 지질막 라벨을 사용할 수있다. 대안 적으로, 로다 포스파티딜 BODIPY 또는 콜레스테롤과 같은 형광 표지 된 지질을 사용할 수있다. 어떤 경우에, 염료의 농도는 지질에 결합 된 형광은 고농도의 지질 동작 (19)을 변경할 수 있다는 것을 염두에두고, 현미경 설정에 따라 최적화되어야한다. </li><li> N 2 가스를 사용하여 클로로포름 (또는 사용 가능한 불활성 가스 Ar과 같은 그분을) 떨어져 건조. </li><li> 또한 건조 T그는 적어도 1 시간 동안 진공 하에서 혼합 지질. 주 :이 지질 혼합물을 저장하는 경우, 불활성 가스 (N 2 나 Ar 그는)에 공기를 제거하고 -20 ℃에서 저장. 작은 갈색 유리 병에 여분의 지질 -에 - 클로로포름 나누어지는. -20 ℃에서 불활성 가스 (N 2에 Ar 또는 He)와 저장소 공기를 변위, 지질 혼합물과 유사한 방식으로 그것들을 건조시킨다. </li><li> 10 ㎎ / ㎖의 농도로 PBS 완충액 건조 지질을 녹인다. </li><li> 소용돌이 1 분에 약 20 초 동안 적극적으로 혼합물 다중 층 소포를 포함, 흐린 서스펜션을 얻을 수 있습니다. 이 병의 측면에 집착에는 지질 필름이 없는지 확인합니다. </li><li> 10 μL 씩 (지질의 1 mg을 10 분취한다)에이 현탁액을 배포합니다. </li><li> 더 사용할 때까지 -20 ℃에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 단일 층 소포의 준비 주 : 단층 라멜라 소포의 각종 크기는 초음파 법 또는 압출 법을 이용하여 제조 될 수있다. 초음파는 S를 사용운드, 에너지는 혼합물을 교반 및 다중 층 현탁액의 분액. 이는 불투명 한 현탁액까지 취소하여 표시됩니다. 압출 한정된 기공 크기의 멤브레인 필터를 통과 다중 층 소포를 강제. <ol><li> 초음파 방법 <ol><li> 다중 층 지질 현탁액의 10 μl를 타고 SLB 버퍼의 150 μl를 추가합니다. </li><li> 작은 (2 mL)에 덮인 유리 바이알에 옮기고, 혼합물을 파라 필름으로 밀봉. </li><li> 10 분 동안하거나 (직경 50 nm의 아래의 SUVs) 소형 단일 층 소포를 수득 선명해질 때까지 욕조 초음파 처리기에서 실온에서 혼합물을 초음파 처리. </li></ol></li><li> 압출 방법 <ol><li> 다중 층 지질 현탁액의 10 μl를 타고 SLB 버퍼의 150 μl를 추가합니다. </li><li> 극저온 튜브로 현탁액을 전송합니다. </li><li> 액체 질소에 몇 초 동안 극저온 튜브를 침지하여 지질 현탁액을 동결. </li><li> 해동몇 분 동안 물을 실온에서 욕조 또는 37 ° C에서 극저온 튜브를 침지하여 지질 현탁액. 동결 해동 단계 적어도 10 번 반복합니다. </li><li> 지질 현탁액을 압출하기 위해서, 200 nm의 기공 크기를 갖는 폴리 카보네이트 멤브레인을 사용하여 상업적 압출 장치 (26) (다른 기공 크기가 100 나노 미터 또는 400 나노 미터 등을 사용할 수있다). 참고 : 현재, 두 개의 압출기 장치는 상업적으로 사용할 수있다 : 수동 압출기 작은 볼륨 (몇 ml를 200 μL)에 사용할 수 있습니다. 이 경우, 샘플은 수동 두 주사기 사이에 앞뒤로 현탁액 밀어 막을 통해 압출된다. 제조사에 따라, 지질 분취 량 세트의 최대 최소 체적에 도달하기 위해 결합 될 필요가있을 것이다. 더 큰 볼륨의 경우 (50 ml)을 더 정교한 장치가 사용되는 서스펜션은 압축 가스를 이용하여 폴리 카보네이트 막을 통해 강제된다. 설정 및 압출 조건에 따라 모드 변경엘. 사용하기 전에 제조업체의 지침을 참조하십시오. 이 프로토콜은 작은 볼륨에 대한 설명서를 압출기를 의미한다. </li><li> 압출기를 통해 물을 통과시켜 물에 압출기 평형. 물 속에서 막 빠져. </li><li> 두 개의 피스톤 사이에 막 배치 장치를 조립 한 주사기로부터 다른 압출기​​를 통해 버퍼를 통과시킴으로써, 평형 완충액. 이 단계는 추가적으로 시스템 leakiness 테스트를 허용한다. 이 묻은 경우, 분해하고 다시 멤브레인을 변경 재 조립. </li><li> 압출기의 하나 주사기 ( &#39;더러운면을&#39;)를 사용하여 지질 서스펜션을 가져 가라. </li><li> 하나의 챔버에 지질 서스펜션과 반대 실의 빈 주사기가 들어있는 주사기를 연결합니다. </li><li> 한쪽 끝에서 주사기를 밀어 넣습니다. 막 통해 반대 주사기에 솔루션을 전달합니다. 이것은 1 차 패스입니다. </li><li> 31 회 등 총 멤브레인 통해 합격이 솔루션은 반대 주사기 ( &#39;깨끗한 편&#39;)에 끝나는 것을. 참고 : 압출 후 멤브레인을 확인합니다. 이 파손 되었다면, 압출 공정은 성공적이지 반복 될 필요가있다. </li><li> 작은 튜브에 주사기를 비 웁니다. 4 ℃에서 보관하는 경우 큰 단일 층 소포 (LUVs)는 1~2일에 대한 안정적이다. </li></ol></li></ol></li><li> 운모 및 Coverslips는의 준비 <ol><li> 세척은 에탄올에 먼저 물에 다음 된 커버. 공기 건조. </li><li> 운모 디스크를 취하여 접착 테이프를 사용하여 외부 층을 벗겨. </li><li> 커버 슬립에 운모 디스크를 연결합니다. 하나는 형광 현미경으로 이중층을 확인할 수 있도록 투명한 광학 접착제는 최적이다. </li><li> 광학 접착제 / 그리스를 사용하여 플라스틱 실린더 (2.5 cm 외경, 2cm 내부 직경 0.5 cm의 높이)를 연결합니다. 모든 밀봉되어 있고 누수가 없는지 확인합니다. 이들은 쉽게 번째로부터 분리 될 수있는 실린더를 다시 사용하고자 할 때 그리스를 사용전자 coverslip에 세척. 플라스틱 실린더 사이즈 AFM 캔틸레버 홀더의 크기에 의존하고 그에 따라 조정되어야한다. </li></ol></li><li> 고체 지지체에 단일 층 소포의 증착 <ol><li> 피펫 운모에 직접 전체 리포좀 솔루션입니다. 300 μL의 볼륨에 도달하기 위해 더 많은 SLB 버퍼를 추가합니다. </li><li> 3 mM의 칼슘 이온의 최종 농도에 도달하기 위해 1 M 염화칼슘 용액 0.9 μL를 추가한다. </li><li> 2 분 후, 적어도 10 분 동안 65 ° C에서 37 ° C에서 인큐베이션. 항상 버퍼 이중층 커버. 공기와 공기 거품 연락을 파괴 할 것이다. 필요한 경우 배양하는 동안, 높은 온도에서 배양 특히, 더 많은 버퍼를 추가합니다. 참고 : 배양 온도가 필요한 지질 혼합물 및 단계에 따라 다릅니다. 적어도 10 분의 배양 시간은 지원 이중층을 형성 할 필요가 있지만, 온도 및 조성에 따라, 이상이 될 수있다. </li><li> 빨래고온 (65 ℃에서)와 이중층 SLB 버퍼 15 ~ 20 시간은 칼슘과 융합 소포를 제거합니다. 버퍼에서 이중층을 유지하기 위해 세척 단계에서 좀 더주의를 기울여 부드럽게 이중층을 파괴 방지하기 위해 세척 용액을 피펫. </li><li> AFM 측정 전에 실온으로 냉각 지원 이중층. 이는 멤브레인의 상이한 위상을 형성뿐만 아니라 기기의 열적 드리프트를 최소화 할 필요가있다. </li></ol></li></ol> 2. 원자 힘 현미경 측정 (11, 12) <ol><li> 영상 참고 : 접촉 모드 또는 모드를 도청에서 원자 힘 현미경 이미징을 수행합니다. 솔루션의 이미지 지원 이중층; 이 이중층을 파괴하므로 용액이 완전히 증발 할 수 없습니다. 하나의 버퍼로 작동 될 때, 어떤 AFM 부분은 액체 유출로부터 보호되어 있는지 확인하기에 안전주의 사항을 준수하십시오. <ol><li> 부드러운 캔틸레버를 선택 (0.2 N / M의 스프링 상수가 좋습니다 이하) 및 T로 마운트그는 AFM. 캔틸레버의 강성 력 선택 분광법 더 중요하다 (이는 나중에 설명 될 것이다). </li><li> AFM 무대에서 샘플을 마운트하고 모든 진동 절연 모듈이 켜져 있는지 확인하십시오. 평형 시스템의 온도 편차를 줄이기 위해 최소 15 분 동안 기다립니다. AFM 세트 업에 따라, 조정 및 이미징 사양이 다를 수 있습니다. 제조업체의 지침서를 참조하십시오. </li><li> 접촉까지 AFM 팁과 샘플을 접근. </li><li> 지질 이중층은 일반적으로 높이가 4 나노 미터이기 때문에, (예 : 1.5 μm의 경우) 가장 높은 Z-해상도를 제공합니다 악기의 Z 범위를 사용합니다. </li><li> 이미지 영역을 선택합니다. 지질 이중층의 개요, × 25 μm의 지역 이미지에 좋은 출발점이 될 것입니다 50 μm의 × 50 μm의 25 μm의를 얻으려면. 작은 기능이 들어 오면 작은 영역에서 하나의 캔 이미지 (10 μm의 × 10 μm의, 또는 2 μm의 × 2 μm의). 촬상 영역의 선택은 또한 작업 R에 의존압전 스캐너의 플랜지. 이 용 장비 설명서를 참조하시기 바랍니다. </li><li> 이중층 매우 깨지기대로, 샘플과의 접촉을 유지하면서, 열 드리프트 최소 힘 및 정확한 영상을 유지하는 동안 AFM 팁의 세트 포인트를 조절한다. 접촉 모드에서, 세트 포인트를 최소화한다. 탭핑 모드에서, 상기 세트 포인트를 최대화. </li><li> 다항식 레벨링 기능에 대한 각각의 스캔 라인 피팅으로 프로세스 이미지. AFM 제조 회사의 전용 소프트웨어를 사용하여 막과 접촉을 잃는 스캔 라인에 대해 제거를 수행한다. </li></ol></li><li> 힘 분광학 <ol><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 지침에 따라 캔틸레버를 보정합니다. 교정은 포토 다이오드 힘 (그림 1B)의 전기 신호의 변환을 할 수 있습니다. <ol><li> 볼트의 팁의 감도 (길이의 단위) Z-압전 운동으로 변형을 측정하는 대신에 전기 신호를 보정합니다. <bR /&gt; 주 : AFM은 레이저를 이용하여 캔틸레버의 변형의 변화는 캔틸레버의 배면에서 반사를 검출한다. 레이저는 공간적으로 레이저 스폿의 위치를​​ 검출 할 수있는 포토 다이오드에 도달한다. 이 시료와 접촉시 굽혀 같이 캔틸레버의 휨의 변화는 &quot;수직 편향&quot;등이 포토 다이오드에 의해 검출되고, 이는 전압의 단위이다. 캔틸레버가 Z-피에조 의해 이동되기 때문에, 수직 편향은 Z-피에조에서 운동에 관한 것이다. 수직 편향 및 z-운동의 비율은 감도라는 거리에 전압을 변환한다. </li><li> 일반적으로 AFM 소프트웨어에 통합 열 잡음 주파수 방식을 사용 캔틸레버 스프링 상수를 계산한다. 이 방법에서, 전력 스펙트럼 밀도 플롯을 생성 발진 주파수에 따른 소음 진동의 진폭을 플롯. 이 그래프는 공진 주파수 주변의 피크를 보여줍니다. 여기서 주파수 진폭 I큰 s의 것은 공진 주파수이다. 소프트웨어에 의해 자동으로 스프링 정수를 산출하는 피크 주위 로렌츠 함수를 장착한다. 열 잡음 방법의 이론에 대한 몇 가지 유용한 리소스를 참조 27-30에 나와있다. </li></ol></li><li> 이중층의 영역을 묘화 한 후, 힘 분광법을 수행하는 이중층으로는 5㎛ × 5 ㎛의 영역을 선택한다. </li><li> 그것은 그 지역의 16 × 16 격자에 힘 곡선을 취하도록 AFM을 설정합니다. 이 지역 당 256 힘 곡선을 초래한다. 이웃하는 두 점 사이의 공간은 막 면적은 다음 점과 일치 한 것 포인트 프로빙되는 것을 방지하기에 충분해야한다. 이 팁 반경에 따라 달라집니다. 두 점 사이의 100 nm의 거리가 이상적 일 것이다. 16 × 16 격자에 5 μm의 X 5 μm의 영역을 나눈다. 위상의 크기에 따라 하나 또는 더 작은 영역을 선택하고 그에 따라 격자 크기를 조정할 수있다. </li><li> 로 설정 Z-압전 변위400 nm의. 이 Z-피에조의 움직임의 최대 범위를 결정합니다. 그것은 캔틸레버가 완전히 측정 사이에 샘플에서 멀리 후퇴 있는지 확인하기 위해 충분히 커야한다. </li><li> 800 나노 미터 / 초에 접근 속도를 설정하고 200 nm의 / 초의 속도를 철회. 이중층 조성 및 지질 상 -6,16-를 공부하기에 따라 6,000 나노 미터 / 초 400 사이의 접근 속도를 사용합니다. </li><li> 모든 파라미터를 설정 한 후, AFM 소프트웨어의 &quot;실행&quot;버튼을 누르면, 힘 곡선을 취득. </li><li> 신장 곡선 대 세력으로 힘 곡선 (Z-피에조 이동 계수)를 저장한다. 이 때 시료와 접촉 계정에 캔틸레버의 굽힘을지지 않습니다. 데이터 처리 단계에서, 소프트웨어는 AFM 이중층 두께에 대한 적절한 값을 제공 할 것이다 팁 - 샘플 분리 곡선 (도 1C), 대 힘을 얻기 위해, 캔틸레버 벤딩에 대한 보정을 허용한다. 보정 값은 일반적으로 캘리 브레이션에 인용각각의 힘 곡선과 함께 저장됩니다 ATION. 주어진 지점에서 압전 운동에서 수직 편향을 뺀 팁 샘플 분리를 계산합니다. 주 : 접근 력 곡선 피크 (력 수치 아래 캔틸레버 운동 방식주기 정지하더라도 간다) 멤브레인의 침투 력 인 반면,이 피크의 위치와 시점의 위치의 차이 힘이 위로 상승하기 시작 위치를 다시 막의 두께를 제공한다. </li><li> 좋은 통계를 얻기 위해 각각의 조건에 대해 최소 500 힘 곡선을 획득. 기원 또는 매트랩 같은 프로그램을 이용하여 값의 히스토그램을 플롯 및 분포의 피크 폭을 얻기 위해 가우시안 분포 히스토그램을 장착한다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).</li>
<li>Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+Tunneling+Microscopy+and+Atomic+Force+Microscopy%3A+Application+to+Biology+and+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology.</a> Science. 242, 209-216 (1988).</li>
<li>Gaczynska, M., Osmulski, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM+of+biological+complexes%3A+What+can+we+learn%5BTitle%5D)+AND+%22Curr%2C+Opin.+Colloid+In%22%5BJournal%5D)">AFM of biological complexes: What can we learn.</a> Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).</li>
<li>Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -C., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM+for+structure+and+dynamics+of+biomembranes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">AFM for structure and dynamics of biomembranes.</a> BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).</li>
<li>Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM%3A+A+Nanotool+in+Membrane+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry-US%22%5BJournal%5D)">AFM: A Nanotool in Membrane Biology.</a> Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).</li>
<li>Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRedondo-Morata%2C+L+%22Atomic+Force+Microscopy+in+Liquid%3A+Biological+Applications%22">Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications</a>. Baró, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. , Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).</li>
<li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+supported+lipid+bilayers%3A+From+biophysical+studies+to+sensor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design.</a> Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).</li>
<li>Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+of+Biological+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy of Biological Membranes.</a> Biophys. J. 96, 329-338 (2009).</li>
<li>Mennicke, U., Salditt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Solid-Supported+Lipid+Bilayers+by+Spin-Coating%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating.</a> Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).</li>
<li>Raviakine, I., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+Supported+Phospholipid+Bilayers+from+Unilamellar+Vesicles+Investigated+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy.</a> Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).</li>
<li>Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+AFM+and+Two-Focus+SFCS+Study+of+Raft-Exhibiting+Model+Membranes.+%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. </a> ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).</li>
<li>Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+effects+on+membrane+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics.</a> Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).</li>
<li>Domènech, Ò, Sanz, F., Montero, M. T., Hernández-Borrell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+and+structural+study+of+the+main+phospholipid+components+comprising+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane.</a> BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).</li>
<li>Domènech, Ò, Morros, A., Cabañas, M. E., Teresa Montero, M., Hernández-Borrell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayers+from+hexagonal+phases%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayers from hexagonal phases.</a> BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).</li>
<li>Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+line+tension+on+the+lateral+organization+of+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes.</a> J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).</li>
<li>Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Force+Spectroscopy+on+Supported+Lipid+Bilayers%3A+Effect+of+Temperature+and+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation.</a> Biophys. J. 103, 38-47 (2012).</li>
<li>Butt, H. -J., Franz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rupture+of+molecular+thin+films+observed+in+atomic+force+microscopy+I.+Theory%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory.</a> Physical Review E. 66, 031601(2002).</li>
<li>Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Temperature+on+the+Nanomechanics+of+Lipid+Bilayers+Studied+by+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy.</a> Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).</li>
<li>Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raft+domain+reorganization+driven+by+short-+and+long-chain+ceramide%3A+a+combined+AFM+and+FCS+study%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study.</a> Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).</li>
<li>Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+spectroscopy+as+a+tool+to+investigate+the+properties+of+supported+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Techniq%22%5BJournal%5D)">Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes.</a> Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).</li>
<li>García-Sáez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+Formation+by+a+Bax-Derived+Peptide%3A+Effect+on+the+Line+Tension+of+the+Membrane+Probed+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM.</a> Biophys. J. 93, 103-112 (2007).</li>
<li>Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+future+of+scanning+probe+microscopy%3A+Combining+atomic+force+microscopy+with+other+surface-sensitive+techniques%2C+optical+microscopy+and+fluorescence+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques.</a> Nanoscale. 1, 40-49 (2009).</li>
<li>Simons, K., Vaz, W. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+Systems%2C+Lipid+Rafts%2C+and+Cell+Membranes1%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Bioph.+Biom%22%5BJournal%5D)">Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1.</a> Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).</li>
<li>Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rafts+defined%3A+a+report+on+the+Keystone+symposium+on+lipid+rafts+and+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function.</a> The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).</li>
<li>Kahya, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Lipid+Mobility+of+Raft-exhibiting+Model+Membranes+by+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).</li>
<li>Akbarzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome%3A+classification%2C+preparation+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Liposome: classification, preparation and applications.</a> Nanoscale Research Letters. 8, 102(2013).</li>
<li>Butt, H. -J., Jaschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+thermal+noise+in+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Calculation of thermal noise in atomic force microscopy.</a> Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).</li>
<li>Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+validation+of+theoretical+models+for+the+frequency+response+of+atomic+force+microscope+cantilever+beams+immersed+in+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids.</a> Journal of Applied Physics. 87, 3973(2000).</li>
<li>Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+response+of+cantilever+beams+immersed+in+viscous+fluids+with+applications+to+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 84, 64(1998).</li>
<li>Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+scaling+law+for+stiffness+measurement+of+small+bodies+with+applications+to+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 97, 12490310(2005).</li>
<li>Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognizing+and+avoiding+artifacts+in+atomic+force+microscopy+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging.</a> Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).</li>
<li>Lee, M. -T., Chen, F. -Y., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+of+Pore+Formation+Induced+by+Membrane+Active+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry-US%22%5BJournal%5D)">Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides.</a> Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).</li>
<li>Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+membrane+elasticity+by+micro-pipette+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+physical+journal.+E%2C+Soft+matter%22%5BJournal%5D)">Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration.</a> The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).</li>
<li>Nichols-Smith, S., Teh, S. -Y., Kuhl, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+and+mechanical+properties+of+model+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes.</a> BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).</li>
<li>Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Line+Tension+at+Fluid+Membrane+Domain+Boundaries+Measured+by+Micropipette+Aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration.</a> Phys. Rev. Lett. 98, (2007).</li>
<li>Rigaud, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%3A+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Medical+and+Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).</li>
</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

DOPC 이루어지는 SLB 수 : SM : Chol을 (2 : 2 : 1) 염화 칼슘에 의한 소포 ​​흡착 및 파열 후에 운모 상에 형성 하였다. 이 지질 조성물 L D와 L 오 상으로 분리 하였다. L 오 단계는 스 핑고 마이 엘린과 콜레스테롤이 풍부한과 L의 D 단계 (11)보다 적은 유체 / 점성 (그림 1A)이다. L의 D 단계에서 L 오의 분리 주변 (그림 1B, C) ​​이상 상승으로 원형 구조를 명시한다. 플랫폼가 L D 단계에 둘러싸여 L 오 단계입니다. 막 결함 (또는 막에 구멍)도 (도 1b, 청색 화살표)이 보이는 결함에 걸쳐 높이 프로파일은 이중층의 두께를 나타낸다. L의 D / L의 O를 높이 차이는 ...

원자 힘 현미경 (AFM)은 매우 날카로운 팁 (1)과 캔틸레버를 사용하여 샘플의 영역에 걸쳐 주사함으로써 표면의 화상을 생성한다. 캔틸레버의 이동은 시료의 표면 토폴로지를 프로빙. 액체 2-5에 공기 또는 거의 원시 상태에서 고정 된 샘플을 분석하는 그 다양성 때문에, 단백질, DNA와 세포막을 포함하여 - AFM 널리 생체 분자에 적용되었습니다. 외에 나노 미터 범위에서의 고해상도 영상화 능력에서, AFM 캔틸레버는 작용 힘 (부착 및 반발력) 및 샘플 5,6의 기계적 특성을 조사하기 위해 스프링 역할을한다. 이것은 힘 분광법으로 알려져있다. 이 모드에서, 프로브는 먼저 샘플 (도 1a)과 접촉을 상실 할 때까지 후퇴되고, 시료에 접근하고 그것에 힘을 발휘한다. 생성 된 곡선은 앱 모두 캔틸레버의 거리의 함수로서 힘을 보여바퀴벌레과 후퇴. 탄성률 등 여러 가지 특성은 재료의 강성을 측정하고, 접착력이 유도 될 수있다. 지원 지질 이중층은 고체 지지체 위에 누워 생물학적 모델 막이다 - 보통 운모, 붕 규산염 유리, 용융 실리카, 또는 실리콘 산화 7. 이들은 소포 증착과 같은 다양한 기술을 사용하여 제조되며, 랭 뮤어 - 블로 젯 방법 및 8,9 스핀 코팅. AFM 영상이 지원 이중층 (10)의 형성을 수행하고, 상이한 조성 11-15의 멤브레인에 의해 형성된 상이한 구조를 조사하기 위해 사용되었다. 접근 곡선의 피크에서 지원 이중층 결과에 힘 분광법을 수행. 이 피크는 이중층을 관통하기 위해 필요한 힘을 나타내고, 획기적인 힘이라고 부른다. 이중층의 두께는도 6 힘 곡선을 사용하여 측정 될 수있다. 이중층의 전형적인 획기적인 힘1-50 사이의 범위 윈 6. 이러한 특성은 지질 포장 (액체 또는 젤 상)과 구조 (아실 체인 길이와 불포화도)과 막 활성제 (16)에 의해 변경에 따라 달라집니다. 파열 배후 이론은 17을 설명했지만 이러한 캔틸레버 부드러움, 팁 반경 및 접근 속도와 같은 다른 변수는 실험 15, 16, 18 획기적인 힘에 영향을 미친다. 포스 분광법은 막 (21)의 안정성, 다른 지질 상 11,19, 펩티드 등 조성 의존성 12,20 변화뿐만 아니라, 다른 생 분자의 효과의 특성을 분석하기 위해 사용되어왔다. 지원 이중층의 평면 방향은보다 구조 및 막의 성질을 특성화하기 위해 이러한 표면 플라즈몬 공명 (22) 및 형광 현미경 11,19 같은 다른 방법으로 결합 AFM 유리하다. 이 자세한 영상 프로토COL은 소포 증착을 사용하여 지원 된 지질 이중층을 준비하고 AFM 힘 분광기로 분석하도록 구성된다. 다양한 크기의 소포는 이중층을 제조하는데 사용될 수 있지만,이 프로토콜은 소형 및 대형 단층 라멜라 소포에 초점을 맞춘다. 상 액체 주문 (패 O) 및 액체 무질서 (패 D) 단계로 분리 지원 이중층은 11, 15을 특징으로했다. 2 : 1의 비율로 막 2에 디 - 올레 일 포스파티딜콜린 (DOPC), 스 핑고 미엘린 (SM), 및 콜레스테롤 (Chol을)로 구성된다. 이 구성 모델 단백질 인신 매매 및 정렬, 세포 신호 및 다른 세포 과정 (23, 24)에 대한 중요한 플랫폼으로 작동하도록 제안 지질 뗏목,.

<table><tbody><tr><td>1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850375P</td><td>는 밀봉된 바이알에 동결건조 분말로 제공됩니다. 개봉 시 클로로포름의 모든 분말을 녹이십시오. 건조된 지질 필름으로 여분의 저장, 불활성 분위기 하에서, -20&nbsp; &deg;C입니다. 방문 <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp; view=기사& id=1679& 보관 및 취급에 대한 자세한 내용은 itemid=398">here</a>를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>스핑고미엘린(뇌, 돼지)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>860062P</td><td>는 밀봉된 대형 플라스틱 용기에 동결건조 분말로 제공됩니다. 개봉 시 클로로포름에 분말 분말의 주걱 끝을 녹입니다. 건조된 지질 필름으로 여분의 저장, 불활성 분위기 하에서, -20&nbsp; &deg;C. 방문 <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp; view=기사& id=1679& 보관 및 취급에 대한 자세한 내용은 itemid=398">here</a>를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>700000P</td><td>는 밀봉된 대형 플라스틱 용기에 동결건조 분말로 제공됩니다. 개봉 시 클로로포름에 분말 분말의 주걱 끝을 녹입니다. 건조된 지질 필름으로 여분의 저장, 불활성 분위기 하에서, -20&nbsp; &deg;C. 방문 <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp; view=기사& id=1679& 보관 및 취급에 대한 자세한 내용은 itemid=398">here</a>를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl), 99.8 %</td> <td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl), 88 %</td> <td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>인산 수소 나트륨 (Na2HPO4), >99 %</td> <td>AppliChem GmbH</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 이수소 인산 염 (KH 2PO 4), 99%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물 (CaCl2), 분자생물학 등급</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 분자생물학 등급</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립, 24&nbsp; 엑스&nbsp; 60&nbsp; mm, 1&nbsp; mm 두께</td><td>Duran Group</td><td>2355036</td><td></td></tr><tr><td>펀치 및 다이 세트</td><td>정밀 브랜드 제품, Inc</td><td>40105</td><td></td></tr><tr><td>광학 접착제</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA 88</td><td>장파장 자외선에서 경화되면 경화되는 액체 접착제.&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Mica blocks</td><td>NSC Mica Exports Ltd.</td><td></td><td>이들은 면적이 최소 1제곱인치이고 두께가 0.006인치에서 0.016인치 사이인 운모 조각입니다. 그들은 배송을 위해 회사에서 특정 크기로 절단합니다. 작은 운모 디스크는 펀치와 다이 세트를 사용하여 운모 블록에서 펀칭할 수 있습니다.&nbsp; 항상 장갑이나 핀셋으로 운모를 다루십시오.</td></tr><tr><td>실험실 장비 그리스</td><td>Borer Chemie AG</td><td>Glisseal N</td><td></td></tr><tr><td>리포좀 압출기</td><td>Avestin</td><td>LiposoFast-Basic</td><td>대안으로 Northern Lipids, Inc.의 제안을 살펴볼 수도 있습니다.</td></tr><tr><td>접착 테이프</td><td>3M</td><td>Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)</td><td></td></tr><tr><td>Bath Sonicator</td><td>Bandelin Sonorex Digitec</td><td>DT-31</td><td>No heating, 주파수: 35 kHz, 초음파 피크 출력: 160 W, HF 전력: 40 W. (<a href="http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf">데이터 시트</a>)</td></tr><tr><td>실리콘 나이트라이드 AFM 캔틸레버&nbsp;</td><td>Bruker AFM 프로브</td><td>DNP-10</td><td>각 캔틸레버에는 네 개의 팁이 있으며 공칭 팁 반경은 20nm입니다(최대 60μm; nm)입니다. 사양에 따라 공진 주파수가 18kHz이고 공칭 스프링 상수가 0.06N/m인 팁 D를 사용합니다.</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200</td><td></td>에 장착된 <td>AFM</td><td>JPK</td> JPK 나노위저드 II</tr></tbody></table>

원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

원자력 현미경(AFM)은 생체 막을 시각화할 수 있는 다목적 고해상도 이미징 기술입니다. 멤브레인 하부 구조와 개별 분자를 검사하기에 충분한 배율을 가지고 있습니다. AFM은 멤브레인의 상호 작용 및 기계적 특성을 측정하는 힘 프로브 역할을 할 수 있습니다. 지지된 지질 이중층은 일반적으로 AFM 연구에서 멤브레인 모델로 사용됩니다. 이 프로토콜에서는 지원되는 이중층을 준비하고 AFM을 사용하여 구조 및 기계적 특성을 특성화하는 방법을 보여줍니다. 여기에는 이중층 두께와 돌파력이 포함됩니다. 
AFM 이미징 및 힘 분광법에서 제공하는 정보는 멤브레인의 기계적 및 화학적 특성을 정의하는 데 도움이 됩니다. 이러한 특성은 환경 스트레스로부터 세포 지혈을 유지하고, 막 단백질을 함께 모으고, 단백질 복합체를 안정화하는 것과 같은 세포 과정에서 중요한 역할을 합니다.

DOPC 이루어지는 지원 지질 이중층 : SM : Chol을 (2 : 2 : 1) AFM 이미지화 하였다 (도 2 AC). 때문에 지질 조성물, SM / Chol을 풍부 L의 O 및 DOPC 풍부한 L d 개의 상을 관찰 하였다. AFM 영상에서 높이 프로파일은 막 구조에 대한 중요한 정보를 제공 할 수있다. 높이 프로파일을 조사하여 이중층 두께를 제공 할 수있는 막 (도 2b) 또는 L의 O / L의 d 개의 상 사이의 높이 차이에 결함의 존재를 측정 할 수있다. 또한, AFM은 특히 선택이 단계를 대표하는 지역과 힘 분광법 (- F 그림 2 D)를 사용하여 기계적 특성을 분석 할 수 있습니다. 힘 분광법 모드로부터 유도 력 곡선 힘 곡선 (도 2D 및 E)의 피크 하중 값을 찾음으로써 획기적인 힘...

원자력 현미경 및 힘 분광법을 사용하여 지원되는 지질 이중층의 준비 및 특성화를 위한 프로토콜을 설명합니다.

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

다음 실험의 전반적인 목표는 원자 힘 현미경을 사용하여 상분리 막의 물리적 특성을 이미징하고 조사하는 것입니다. 이를 위해 먼저 dilio, phosphatidylcholine, fgo, myelin 및 콜레스테롤을 2:2:1 비율로 혼합하여 상분리 지질 혼합물을 형성합니다. 그다음, 원자 힘 현미경을 사용하여 MICA 표면에 리포좀 현탁액을 증착함으로써 지지 지질 이중층을 준비합니다.그런 다음 이중층의 표면을 스캔하여 높이와 같은 구조적 특징을 측정할 수 있는 지형 이미지를 생성합니다. 이어서 이중층의 특정 영역에 대해 힘 분광법(force spectroscopy)을 수행하여 이중층의 물리적 특성, 특히 파괴력(breakthrough force)과 막 두께를 조사합니다. 최종적으로, FM 이미지와 힘 곡선을 바탕으로 서로 다른 지질 상(lipid phase) 간의 특성 차이를 확인합니다.형광 현미경과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 분해능이 향상되었으며, FM을 통해 시료에서 탐색할 수 있는 추가적인 특성들이 많다는 점입니다. 이 방법은 생체막의 구조 및 해당 막에 내장된 단백질과 같이 생물물리학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 막의 물리적 특성을 살펴볼 수 있으며, 조성의 변화나 막 활성제의 추가가 이러한 특성들을 어떻게 변화시키는지 모니터링할 수 있습니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 샘플의 취약한 특성 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이는 샘플 준비, 취급, 캔틸레버의 선택, 그리고 FM 이미징 및 분광법 조건에 영향을 미칩니다. 우선 DOPC, spino, myelin 및 cholesterol을 원하는 농도로 chloroform에 녹입니다. 그다음 DOPC 18.38 µL, sing myelin 17.1 µL, cholesterol 11.3 µL를 혼합하여 총 지질 함량이 1 mg이고 몰비가 각각 2:2:1인 용액을 제조합니다.용액을 볼텍싱하여 혼합하고, 질소와 같은 불활성 가스를 사용하여 혼합물을 건조시킨 후, 진공 상태에서 최소 1시간 동안 추가로 건조하십시오. 다음으로, 건조된 지질을 100 µL의 PBS에 녹여 10 mg/mL 농도로 만드십시오. 약 1분 동안 강하게 볼텍싱하여 혼합하십시오.다중층 소포를 포함하는 혼탁한 현탁액을 얻습니다. 바이알 벽면에 지질 막이 남아 있지 않은지 확인하십시오. 다중층 지질 현탁액 10 µL를 취하여 지지 지질 이중층 완충액 150 µL를 첨가합니다.그 다음 용액을 혼합하여 2 mL 용량의 작은 캡형 유리 바이알에 옮기고 파라필름으로 밀봉합니다. 실온의 초음파 세척기(bath sonicator)에서 10분 동안 초음파 처리합니다. 이 과정 동안 용액은 투명해지며, 직경이 약 50 nm인 작은 유니라멜라 또는 멀티라멜라 소포가 생성됩니다.유리 커버슬립을 물과 에탄올로 차례로 세척한 후 공기 중에서 건조시킵니다. 다음으로, Micah 디스크를 가져와 접착테이프를 사용하여 외층을 벗겨냅니다. 투명한 광학용 접착제를 한 방울 사용하여 MICA 디스크를 커버슬립에 부착합니다.그 다음, 진공 그리스를 사용하여 MICA에 플라스틱 실린더를 부착하고 누출이 없는지 확인합니다. 리포좀 용액 전체를 mica 위에 직접 피펫팅하고, 지지 지질 이중층 버퍼 140 µL를 추가하여 총 부피를 300 µL로 맞춥니다. 다음으로, 1 M 염화 칼슘 용액 0.9 µL를 첨가하여 칼슘의 최종 농도가 3 mM이 되도록 하고, 샘플을 37 °C에서 2분 동안, 이어서 65 °C에서 최소 10분 동안 인큐베이션합니다. 이 단계에서 지지 지질 이중층 버퍼 또한 65 °C로 예열합니다.시료가 마르지 않도록 필요한 경우 버퍼를 추가하십시오. 샘플 챔버를 커버슬립으로 덮어주면 시료의 수분을 유지할 수 있습니다. 그런 다음, 미리 데워둔 supported lipid bilayer buffer로 시료를 10~15회 부드럽게 헹구어 칼슘과 융합되지 않은 소포를 제거하십시오.세척 단계 후 지질 이중층이 마르지 않도록 세척 과정 동안 특별히 주의하십시오. 지지체 기반 이중층을 상온으로 냉각합니다. 원자 힘 현미경으로 측정하기 전, 용액 내 지질 이중층의 이미징을 수행할 수 있도록 원자 힘 현미경 또는 FM을 설정하십시오.제조사의 사양에 따라 컨택 모드를 사용하며, 실험 전체 과정 동안 샘플이 버퍼에 잠겨 있도록 버퍼를 추가합니다. 샘플을 AFM 스테이지에 장착하고 모든 진동 격리 모듈이 켜져 있는지 확인하십시오. 시스템이 평형 상태에 도달하고 열 표류(thermal drift)가 감소할 수 있도록 최소 15분 동안 기다립니다.다음으로, 접촉이 이루어질 때까지 부드러운 AFM 캔틸레버 팁으로 샘플에 접촉 모드로 접근합니다. 이중층은 매우 취약하므로, 접촉 모드 이미징 동안 AFM 팁의 설정값(set point)을 최소화하여 가해지는 힘을 최소로 유지하고, 샘플과의 접촉을 유지하면서 열 표동(thermal drift)을 보정하십시오. 이미징이 완료되면, 각 스캔 라인을 다항식 레벨링 함수(polynomial leveling functions)에 맞추어 이미지를 처리합니다.막과의 접촉이 끊어진 스캔에 대해 라인 제거(line removal)를 수행합니다. AFM 제조사의 전용 소프트웨어를 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 캔틸레버를 보정함으로써 전기 신호를 힘 측정값으로 정확하게 변환합니다. 이중층의 특정 영역을 이미징한 후, 힘 분광법(force spectroscopy)을 수행하기 위해 이중층 내에서 5 µm × 5 µm 영역을 선택합니다.해당 영역에서 16x16 그리드로 포스 커브(force curve)를 측정하도록 AFM을 설정하여 영역당 256개의 포스 커브를 얻습니다. 그런 다음 Z 피에조 변위를 400 nanometers로 설정합니다. 이는 z 피에조의 최대 이동 범위를 결정하며, 측정 사이의 간격 동안 캔틸레버가 샘플로부터 완전히 후퇴하도록 보장합니다.다음으로 접근 속도를 800 nanometers per second로, 후퇴 속도를 200 nanometers per second로 설정하십시오. 또한 이 경우 각 힘 곡선(force curve)의 최대 목표 힘을 12 nano Newton으로 설정하십시오. 모든 파라미터 설정을 마친 후, AFM 소프트웨어의 실행 버튼을 눌러 힘 곡선을 획득하십시오.충분한 통계적 유의성을 확보하기 위해 각 조건당 최소 500개의 힘 곡선(force curves)을 획득하고, 해당 값들의 히스토그램을 작성한 후, 이를 가우시안 분포로 피팅하여 분포의 피크와 너비를 구합니다. 본 연구에서 사용한 지질 조성으로 인해 두 개의 주요 막 영역이 형성됩니다. 하나는 fing, myelin 및 cholesterol로 구성된 액체 질서상(liquid ordered) 영역이며, 다른 하나는 주로 DOPC로 구성된 액체 무질서상(liquid disordered) 영역입니다.AFM 이미징을 통해 얻은 높이 프로파일을 분석하면 막 구조에 관한 중요한 정보를 얻을 수 있습니다. 막에 존재하는 결함을 활용하여 이중층의 두께를 측정할 수 있습니다. 또한 높이 맵을 통해 규칙상(ordered phase)과 무질서상(disordered phase) 사이의 높이 차이를 측정할 수 있습니다.포스 스펙트로스크로피 모드에서 얻은 힘-거리 곡선(force curve)은 여기에서 보여주는 것과 같이 곡선의 정점(peak)에서의 힘 값을 확인하여 파괴력(breakthrough force)을 측정하는 데 사용됩니다. 또한, 힘-거리 곡선의 정점부터 곡선이 다시 상승하기 시작하는 지점까지의 거리 값을 빼줌으로써 막의 두께를 도출할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안, 열 표류(thermal drift) 현상과 팁에 쌓이는 D의 영향을 보정하기 위해 B 층 형성 용액을 유지하고 FM 조립 상태를 지속적으로 모니터링하는 것이 중요합니다.막 역학(membrane dynamics)과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 공초점 형광 현미경(confocal fluorescence microscopy)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 지질 이중층(supported lipid bilayers)을 준비하는 방법과 형광 현미경(FM)을 사용하여 이러한 이중층의 물리적 특성을 이미징하고 조사하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

atomic-force-microscopy-imaging-force-spectroscopy-supported-lipid

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오에서는 미세유체 플랫폼이라고 하는 지지된 지질 이중층의 포스파티딜에탄올아민 지질에 태그가 지정된 pH 민감 형광 염료를 사용하여 pH 조절 분석을 사용하여 미세유체 패턴의 단백질-포스포이노시티드 상호 작용을 시연합니다. 단백질이 인지질에 결합한 후 pH의 조절은 형광 소멸을 유발합니다.

단백질-포스포이노시티드 상호작용을 검출하기 위해 지원되는 지질 이중층에 대한 pH 조절 분석

우리는 고해상도 현미경 운모지지 지질 이중층을 제조하는 방법을 제시한다. 운모는 원자 규모에서 투명하고 평면이지만, 거의 때문에 어려움을 처리하는 영상에서 사용되지; 우리의 준비는 운모 시트도 증착 결과 및 이중층의 제조에 사용되는 물질을 감소시킨다.

운모의 준비 고해상도 광학 현미경 이미징 지질 이중층 지원

다양한 단일 분자를 AFM 팁에 공유 결합하는 프로토콜이 제시됩니다. 고체 지지체 및 생체 계면에서 이러한 분자의 접착력과 자유 에너지를 결정하기 위한 절차와 예가 제공됩니다.

원자 힘 분광학에 의해 단일 ​​분자 접착 조사

우리는 지질 소포를 사용하지 않고 고체 기판 상에지지 지질 이중층을 형성하는 실험 프로토콜을 제시한다. 우리는 다양한 생물학적 응용을위한 콜레스테롤이 풍부한 도메인과 지질 이산화 규소 및 골드 이중층뿐만 아니라지지 막을 형성하는 하나의 단계 방법을 보여준다.

용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법에 의해 생체막 제작

단백질 기능화 평면 유리 지지 지질 이중층의 준비, 내 단백질 이동성 측정 및 단백질 밀도 측정이 여기에 나와 있습니다. 노이즈를 줄인 내부 전반사(Total Internal Reflection) 현미경을 구축하기 위한 로드맵이 요약되어 있으며, 이를 통해 높은 시공간 해상도로 단일 이중층 상주 형광 색소를 시각화할 수 있습니다.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

여기, 우리는 단일 분자 감도와 ~ 15 밀리 초 시간 해상도와 편광 TIRFM를 사용하여 리포좀과 미세 유체 채널에 지원 이중층 사이에 하나의 SNARE 매개 융합 이벤트를 감지하는 프로토콜을 제시한다. 지질 용해성화물 분리를 동시에 검출 할 수있다. 리포좀의 크기, 지질 확산과 융합 기공 특성을 측정한다.

편광 TIRF 현미경에 의해 감시 미세 유동 흐름 전지에 닿는 지원 이중층 단일 테오의 SNARE 매개 퓨전

우리는 액체 내에서 진폭 변조 (탭핑 모드) 원 자간 력 현미경으로 나노 미터 이하 해상도의 이미지를 달성하기위한 방법을 제시한다. 이 방법은 상용 원 자간 력 현미경에 설명된다. 우리는 매개 변수의 우리의 선택 뒤에 이론적 근거를 설명하고 해상도 최적화를위한 전략을 제안한다.

액체의 진폭 변조 원자 힘 현미경과 서브 나노 미터 해상도 이미징

이 논문은 지질 막의 중성자 스핀 에코 (NSE) 연구에서 샘플 준비, 데이터 감소 및 데이터 분석을위한 프로토콜을 설명합니다. 지질의 현명한 중테리움 라벨링은 중요한 생물학적 과정이 발생하는 중전 길이와 시간 척도에 대한 다양한 막 역학에 접근할 수 있게 합니다.

지질 막 역학 및 막 단백질 상호 작용을 위한 독특한 프로브로 중성자 스핀 에코 분광법

이 프로토콜은 유니 지질 및 다중 지질 소포, 지원지질 이중층 및 일시 중단 된 지질 이중 층을 모방 하는 세포의 형성을 설명 합니다. 이러한 체외 모델은 다양한 지질 유형을 통합하도록 조정할 수 있으며 다양한 분자 및 거대 분자 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

원자력 현미경(AFM) 프로브 팁이 샘플 표면에 가하는 접촉 면적과 힘을 정량화하면 나노 크기의 기계적 특성을 측정할 수 있습니다. 탄성 계수 또는 기타 나노기계적 특성을 측정하기 위해 연질 및 경질 샘플의 공기 또는 유체에서 AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션을 구현하는 모범 사례에 대해 설명합니다.

원자력 현미경 캔틸레버 기반 나노인덴테이션: 공기 및 유체의 나노 스케일에서 기계적 특성 측정

그라마시딘 A-도핑된 액상 계면 이중층을 조립, 전기자극, 분석하는 실험 프로토콜이 제시됩니다. 지질-단백질 구조-기능 관계는 막 면적, 이온 플럭스, 단일 채널 전도도 변화를 측정하고, 이러한 반응을 전기 시냅스에서 영감을 받은 막 모델에서 이온 전도의 가소성 유사 변화와 연관하여 정량화합니다.

액상 인터페이스 이중층을 이용한 지질-단백질 막 구조-기능 특성 분석

배우세요 원자 힘 현미경을 이용해 지지 지질 이중층의 구조와 역학적 특성을 분석하는 방법을. 고해상도 이미징과 힘 분광학을 통해 막 두께와 돌파력을 정량화하여 생물학적 막의 물리적 특성을 연구할 수 있습니다.

원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

더 많은 동영상 탐색