Name: 파상풍의 자극에 의해 지역의 CA1 γ 진동의 발생 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 학습하세요 뇌 슬라이스를 준비하여 CA1 영역의 감마 진동을 기록하는 방법을. 이 기법은 신경흥분성 모델로 약물 효과를 평가하고 신경질환의 발병 기전을 이해하는 데 활용됩니다.

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APA에서 RJH로, NHMRC 프로그램 보조금 400121 SP로, NMHRC 펠로우십 1005050에서 SP로 지원합니다. CAR은 ARC(FT0990628) 및 DOWD 펠로우십 제도의 지원을 인정합니다. 플로리 신경과학 및 정신 건강 연구소(Florey Institute of Neuroscience and Mental Health)는 빅토리아 주 정부 인프라 기금의 지원을 받습니다.

마우스의 모든 실험은 플로리 연구소의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었다. 뇌 조각을 절단 1. 설치 <ol><li> (MM) (125) 콜린 CL 2.5의 KCl, 0.4 CaCl2를,도 6의 MgCl 2, 1.25의 NaH 2 PO 4, 26의 NaHCO3 이루어진 절삭 액을 준비 20 D-포도당 carbogen 가스 (95 % O 2 -5 포화 (㎜) 125의 NaCl, 2.5 KCl을,이 CaCl2를, 2의 MgCl 2, 1.25의 NaH 2 PO 4, 26의 NaHCO3 이루어지는 %의 CO 2)와 인공 뇌척수액 (ACSF) 기록 액, 10 D 글루코오스로 포화 carbogen. 감기를 유지하기 위해 얼음에 절단 솔루션을 놓습니다. </li><li> 절단 용액을 약 400 ㎖의 동결 및 얼음 슬러리를 만들기 위해 고정 된 절삭 용액 100 ㎖과 함께 블렌드. carbogen와 버블 (95 % O 2 -5 % CO 2의) 작은 C 내지 약 0.5 L / min의 유량에서aliber 튜브 또는 소결 유리 거품의 꾸준한하지만 부드러운 흐름을 생성한다. </li><li> 뇌 조각이 배치 될에 제기 나일론 메쉬 인서트 (250) 비이커를 준비합니다. 거품이 직접 조각 수용 지역을 방해하지 않는 것이 보장 carbogen와 약 2cm로 메쉬와 거품 다루 ACSF로 채 웁니다. 그것은 거기 나일론 메쉬 안에 기포가없는, 그래서 어떤 위험이있는 경우이를 제거하는 것이 중요하다. 이것은 유지 실되며 RT로 유지된다 (20-25 ° C). </li><li> 가위의 큰 쌍, 가위, 크고 작은 마이크로 주걱과 집게의 크고 작은 쌍의 작은 쌍을 포함 해부 악기를 레이아웃과 얼음에 그들을 진정. 알루미늄 호일의 광장에 얼음에 vibratome 조직 절단 블록을 놓습니다. 6cm 필터 종이, 하나의 에지 면도날,뿐만 아니라 절단 솔루션 슬러리로 채워진 25 비이커 2 개를 얻습니다. </li><li> 얼음과 제 2 용기를 입력하고 조직 아빠의 조각을 배치어 및 얼음에 상단에 12cm의 배양 접시를 놓습니다. carbogen와 솔루션 아이스 슬러리 거품을 절단 배양 접시를 채우십시오. 이것은 뇌 해부를 수행 할로하는 컨테이너입니다. </li><li> vibratome를 준비합니다. 신선한 양날 면도날 제거의 포장 (신선한 날 때마다 사용) 및 80 % 에탄올 후 탈 이온수로 스프레이. 이 테이퍼 시작 지점에서 3 ㎖ 플라스틱 전송 피펫을 잘라. 이것은 뇌 조각을 전송하는 데 사용된다. 벤드 약 45 °, 1 ML의 주사기에 부착하여 기지에서 27 G 바늘. 이것은 절단시 슬라이스를 조작하는 데 사용된다. </li></ol> 2. 뇌 조각을 절단 <ol><li> 2 % 이소 플루 란 또는 로컬 승인 방법 - 마우스 (P18 P16)를 마취. 유도 후, 가위의 큰 쌍의 동물 목을 벨과 버블 절단 솔루션 슬러리를 포함 12cm 문화 접시에 머리를 놓습니다. 슬러리를 완전히위한 헤드 젖어 있어야급속 냉각. </li><li> 한 손으로 피부 앞으로 코쪽으로 결합 조직을 박리와 머리의 앞쪽을 잡고. 결합 조직을 잘라 작은 가위를 사용하면 기본 두개골을 공개합니다. 그런 다음 두개골과 목 등의 측면을 덮는 근육을 제거합니다. </li><li> 먼저 큰 집게와 두개골의 전면을 확보하여 두개골에서 뇌를 제거하고 작은 가위 (그림 1, A1과 A2 표지 컷)를 사용하여 난원 매그넘의 뼈 양쪽을 통해 두 가지 측면 컷을합니다. <ol><li> 눈 사이 다른 컷 (브레 그마의 바로 앞쪽) (그림 1, 절단 표시 B)를 조심스럽게 전방 시상 봉합을 따라 절단을 확인하고 뇌 (그림 1, 컷 라벨 C)를 공개 할 컷 두개골 부분을 반영합니다. </li><li> 배양 접시에 뇌와 장소를 특종에있는 작은 주걱을 사용합니다. 크랑의주의필요 뇌의 하부 측면에 IAL 신경이 작은 크기의 마이크로 주걱을 사용하여 수행 될 수 있고, 절단한다. 사용하여 더 큰 주걱은 절단 솔루션 슬러리 가득 25 비이커에 뇌를 전송합니다. </li></ol></li><li> 슬라이스에 대한 뇌 반구를 준비합니다. <ol><li> 다음 신선한 절단 솔루션 슬러리 거품 채우기 새로운 배양 접시의 바닥에 6cm 필터 종이 한 조각을 놓습니다. 필터 종이에, 아래로 뇌, 복부 측면의 위치를​​ 더 큰 주걱을 사용합니다. 새로운 청소 하나의 에지 면도날을 가지고 다음, 소뇌를 제거 중간 선을 따라 잘라 두 개의 반구로 뇌를 분리 할 수​​ 있도록 뇌를 잘라. </li></ol></li><li> vibratome 조직 블록을 준비. <ol><li> 상기 냉장 vibratome 조직 블록을 받아 표면을 건조하고, 중간에 시아 노 아크릴 레이트 접착제의 드롭을 배치하고 뇌의 대략적인 크기로 고르게 확산. 중 하나를 조작하는 작은 주걱을 사용하여큰 마이크로 주걱 위에 뇌 반구 뇌의 안쪽면이 아래로 그래서. </li><li> 가능한 해결책 중 많이 제거하는 필터 종이 조각에 제 뇌의 계면에서의 주걱 부분을 만지지. 접착제에 그것을 안내하는 작은 주걱을 사용하여 더 큰 주걱 떨어져 머리를 밀어 넣습니다. </li><li> 뇌가 완전히 잠기 보장 vibratome 챔버로 절단 블록을 고정 및 절단 솔루션 슬러리 거품 챔버를 입력합니다. 뇌의 복부 측면이 블레이드를 향하도록 절단 블록을 돌립니다. </li></ol></li><li> 뇌 조각화. 참고 : 각 vibratome 그렇게 제조업체의 지시에 따라 고유합니다. <ol><li> 450 μm의 슬라이스 두께를 설정하고, 약 0.3 mm / s의 속도로 뇌를 통해 이동함에 따라 블레이드가 진동을 보장한다. 대뇌 피질의 표면에 복부 측면에서 뇌를 완전히 잘라,이 수 b 전체 뇌 시상 슬라이스를 생성합니다전기 생리 녹음에 사용되는 전자. 조각 내측 측방 생성되며 일반적 3-4 슬라이스 각 반구로부터 절단 될 수있다. </li><li> 슬라이스 리프트의 기본 슬라이스 다시 아래 부드러운 언론에 구부러진 27 G 바늘을 사용하는 경우. 각 절편이 절단됨에 따라, 그들은 최대 8 시간 동안 생존하다 유지 실에서 플랫폼 상을 이동하는 전송 피펫을 사용한다. </li></ol></li></ol> 3. 세포 외 전기 생리학 녹음 <ol><li> 기록 챔버 내의 슬라이스 실장. <ol><li> 2 ml / 분, 32 ℃로 가열 - 전송 피펫을 사용하여 ACSF 1에서 흐르는 관류 잠수 기록 챔버로 뇌 조각을 배치합니다. 녹음에 사용 ACSF는 Mg를 2 + 4 mM의 농도가 2 mM 내지 증가함에 따라 유지 실에서 그와 다르다. </li><li> (- 3 mm의 간격 (2)에 걸쳐 뻗어 나일론 가닥 세미 원형 스테인레스 스틸) &quot;하프&quot;로 슬라이스를 고정합니다. 장소하프 가닥 CA1에 평행하게 실행되도록. 32 ° C에서 10 ml / 분 - 8 관류의 속도를 높입니다. </li></ol></li><li> 해부 현미경 장소 자극 전극과 CA1 (도 2a)의 radiatum 지층의 표면 상에 기록 전극 (ACSF 기록 용액으로 채워진 유리 전극) 아래. 기록 전극을 배치 먼저 자극 전극을 배치합니다. </li><li> 샤퍼는 120 담보 자극 - 150 μA의 진폭과 0.1 밀리 초 지속 시간 테스트 펄스와 슬라이스 건강 (그림 2B)를 결정하는 결과 필드 흥분성 시냅스 후 전위 (fEPSP) 파형을 관찰한다. 슬라이스 표면에서 100 ㎛ fEPSP 작은 섬유 발리와 큰 진폭으로 기록 얻을 - 자극과 기록 전극은 약 50 슬라이스로 이동해야 할 수 있습니다. 샤퍼 담보는 fEPSPs이 박힌하고 슬라이스 건강의 좋은 지표를 제공 유발. Healthy 조각은 일반적으로 0.3 미만의 진폭 비율을 fEPSP하는 섬유 발리슛을 보여줍니다. </li><li> 전극을 위치 변경. <ol><li> 해부 현미경을 사용하여, 지층 oriens의 중간 자극 전극을 이동하고도 3a에 도시 된 바와 같이 가능한 기록 전극에 가깝게 피라미드 세포 층에 기록 전극을 이동. 150 μA 테스트 펄스 1 약 MV입니다 - 120 fEPSP 응답 진폭이되도록 100 ㎛ - 자극과 기록 전극은 약 슬라이스로 (50)를 밀어해야 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> γ 진동을 발생시킨다. <ol><li> γ 진동 200 Hz에서 전달 20 × 0.1 밀리 초 펄스의 기차와 조직을 자극 생성합니다. 매 5 분을 배달 할 때 파상풍의 자극이 재현 응답을 얻을 수 있습니다. </li></ol></li><li> 다음과 같은 기록 매개 변수를 사용합니다. <ol><li> 의 입력 전압 범위와 일치하는 출력 신호의 이득을 스케일아날로그 - 디지털 변환기. 최대 예상 신호 편위는 입력 전압 범위의 30 %의 최소값을 사용하는지 확인. 신호가 클립 수있는 높은으로 이득을 설정할 때주의해야합니다. 필드 레코딩에 필요한 일반적인 대역폭은베이스 라인 드리프트를 제거하는 0.1 Hz에서 AC 커플 링 500 Hz입니다. </li><li> 신호의 에일리어싱을 피하기 위해 저역 통과 필터의 코너 주파수보다 5 배 빠른 - 적어도 4 디지털화. </li></ol></li><li> 데이터 분석. <ol><li> 5 Hz에서 하이 패스 필터 데이터는베이스 라인의 변화를 제거합니다. 10 밀리 최소 이벤트 분리 피크 7 MS의 회귀 간격 ~ 100 MV / 밀리의 임계​​치 전형적인 이벤트 시간, 100 %의 분리 계곡, 유도체 임계치를 이용한 스파이크를 확인한다. 제 스파이크 식별 소요 시간이 자극 인공물의 종료 후 발생하는 지연 시간과 같이 계산한다. 이 분석은 스파이크, 대기 시간, 이벤트 간 간격의 수의 특성을 허용하고, 시간은 다음과 같이 계산다음과 같습니다 : </li><li> 각 스윕 발진 당 스파이크의 갯수가 결정된다으로 스파이크의 수를 계산한다. </li><li> 발진 대기 시간을 계산합니다. 각각의 진동을 위해, 자극 인공물의 단부로부터 제 식별 스파이크의 시간을 뺀다. </li><li> 평균 간 이벤트 간격 (ISI)를 계산합니다. 스파이크와 다중 검출 간의 평균 시간을 결정한다. </li><li> 발진 기간을 계산합니다. 각 진동 내의 첫번째와 마지막 검출 스파이크 사이의 시간을 측정한다. </li></ol></li></ol>

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급성 뇌 조각의 CA1의 γ 진동을 생성하는 강력한 방법을 설명한다. 생성 된 진동은 제어 및 네트워크 (12)의 진동 신경 생리 학적 근거를 더 잘 이해하기위한 기회를 가능 지역 회로로부터 발생한다. AMPA 수용체, GABA 수용체, 나는 H와 T 형 칼슘 채널은 모든 모델에서 γ 진동 필요합니다. 여기에 설명 된 로컬 CA1 진동 견고하게 생성 될 수 있지만 이는 뇌 조각은 건강 보장에 의존한다. 중요한 단계는 차가운 얼음 솔루션에서 제거하고 신속한 침수 동안 뇌에 침투하지 않도록 돌보는 두개골에서 뇌를 신속하게 제거된다. 슬라이스 건강 (21)를 보존하기 위해 60 초 - 이상적으로 잘린 및 두개골에서 뇌의 제거 사이의 시간은 더 이상 30 이상이어야한다. 파상풍의 자극을 이용하여 지역의 CA1 γ 진동이 될 수 있습니다약리 에이전트에 의존하지 않고 표준 생리 학적 기록 ...

뇌 네트워크 진동은 행동 상태에 상관 별개의 주파수 대역 내에서 발생한다. 설치류, 해마 θ 진동 (5-10 Hz에서)를 탐색 행동 1,2 동안 관찰 γ 진동 동안 - 인식과 관심 3,4 등 다양한인지 과정과 (20 ~ 80 Hz에서) 연결합니다. 동기식 네트워크 γ 활성은 또한 정신 분열증, 간질 및 5,6- 같은 장애의 병리학에 관련된다. 예를 들면, γ 진동은 피질 간질 병소 5,7,8의 영역에 해당하는 것으로 생각되고 pharmacosensitivity 또는 저항, 간질 연구 조사 9 개의 중요한 영역의 마커로 사용될 수있다. 뇌 해마 슬라이스 널리 네트워크 활동 10-12을 조사하기 위해 사용 된 모델이다. 다양한 프로토콜은 전형적으로 그 뇌 조각의 γ 진동을 생성하기 위해 개발 된 I저 마그네슘 2 + 4 아미노 피리딘 (4AP), bicuculline 및 kainic 산 12-17로 nvolve 약리 변조. 약리학 트리거 진동의 단점은 약물 신청 후 무작위로 발생하고 안정적​​으로 생성 또는 시간에 안정되지 않습니다 있습니다. 전기적 진동 γ들이 이러한 문제점들을 극복하고 또한 시간적 에피소드 기록 및 분석을 가능 이벤트 자극에 고정되는 이점이 트리거. 다음은 프로토콜이 해마 슬라이스 지층 oriens에 파상풍의 자극을 제공함으로써 CA1의 γ 진동을 생성하는 기술되어있다.

<table><tbody><tr><td>4-(N-에틸-N-페닐아미노)-1,2-디메틸-6-(메틸아미노) 피리미디늄 클로라이드(ZD7288)</td><td>시그마-알드리치</td><td>Z3777</td><td></td></tr><tr><td>바이쿨린</td><td>시그마-알드리치</td><td>14340</td><td></td></tr><tr><td>6-시아노-7-니트로퀴녹사-라인-2,3-디온(CNQX)</td><td>시그마-알드리치</td><td>C127</td><td></td></tr><tr><td>니켈</td><td>시그마-알드리치</td><td>266965</td><td></td></tr><tr><td>카르바마제핀</td><td>시그마-알드리치</td><td>C4024</td><td></td></tr><tr><td>(2R)-아미노-5-포스포펜타노-에이트 (APV)</td><td>토크리스 바이오사이언</td>스 <td>0105</td><td></td></tr><tr><td>레티가빈</td><td>켐퍼시픽</td><td>150812-12-7</td><td></td></tr><tr><td>콜린-Cl</td><td>시그마-알드리치</td><td>C1879-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5KG</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &bull; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 & 황소; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>전극 유리</td><td>Harvard 장치&nbsp;</td><td>GC150F-10</td><td></td></tr><tr><td>동심원 바이폴라 자극 금속 전극&nbsp;</td><td>FHC</td><td>CBBPF75</td><td></td></tr><tr><td>디지털 아이솔레이터</td><td>가져오기 기기</td><td>모델 BJN8-9V1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>모델 1800 앰프</td><td>A-M 시스템</td><td>모델 1800 앰프</td><td></td></tr><tr><td>디지타이저</td><td>National Intruments</td><td>NI USB-6211</td><td></td></tr><tr><td>Vibrotome</td><td>Leica</td><td>VT1200s</td><td></td></tr></tbody></table>

파상풍의 자극에 의​​해 지역의 ca1 γ 진동의 발생

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

신경 네트워크 진동은 건강과 질환에서 뇌 활동의 중요한 특징이며 임상 적으로 사용되는 약물들에 의해 변조 될 수있다. (- 80 Hz에서 20) 프로토콜은 CA1의 γ 진동을 연구하기위한 모델을 생성하기 위해 제공된다. 이러한 γ 진동은 적어도 30 분 동안 안정하고 조정기 전류의 활성화에 추가하여 흥분성 시냅스 활성을 억제 의존한다. Tetanically 자극 진동은 네트워크 상태에보고 스파이크 카운트, 발진 기간, 대기 시간 및 주파수를 포함 재현성 쉽게 정량화 특성들을 갖는다. 전기적 진동 자극의 장점은 네트워크 기능의 강력한 특성화를 가능 안정성, 재현성 및 일시적인 수집을 포함한다. CA1의 γ의 진동이 모델은 셀룰러 메커니즘을 연구하는 체계적 질환과 약제에 의해 변경되는 방법을 신경 네트워크 활동을 조사하는데 사용될 수있다.질병 상태 약리학 용이 구체적 질병 메커니즘을 대상 약물의 선택을 가능하게하기 위해 유전자 변형 또는 중재 동물 모델에서 뇌 조각의 사용에 의해 통합 될 수있다.

지층 oriens의 파상풍의 자극이 강력하고 재현 γ 진동 (35.4 ± 2.2 Hz에서) 생성, 그림 (b)를 참조하십시오. 진동은 CA3로부터 입력이 구부러진 32 G 바늘을 사용 CA2 영역 슬라이스를 절단하여 절단 된 CA1 로컬 네트워크 내에서 생성되었다는 것을 증명한다. 진동 로컬로 생성되는 것을 나타내는, (포경 조각 5.89 ± 0.8 스파이크를, N = 6;, 절단 조각 6.16 ± 1.1 스파이크 N = 6 P = 0.85) 절단 조각의 진동 특성은 포경 조각에서 차이가 없었다. 이 방법의 중요한 장점은, 녹음의 안정성이다. 파상풍은 5 분 간격으로 제공되었을 때의 진동은 (15 분, 30 분에 대 스파이크 번호에 대한 p = 0.26) 주어진 슬라이스에 대해 적어도 30 분 동안 안정적이었다. 진동 및 기타 매개 변수 내의 스파이크 총 슬라이스 간의 변동이있다. D를위한베이스 라인 특성의 차이가 작은 요인되도록 깔 페어링 실험...

진동은 기본적인 네트워크 속성이며 질병과 약물에 의해 조절된다. 뇌 슬라이스 진동을 공부하는 것은 통제 된 조건에서 격리 된 네트워크의 특성을 수 있습니다. 프로토콜은 CA1의 γ 진동을 불러 일으키는 급성 뇌 조각의 준비를 위해 제공됩니다.

파상풍의 자극에 의​​해 지역의 CA1 γ 진동의 발생

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

이 절차의 전반적인 목표는 신경 흥분성의 모델로서 세포 외 감마 진동을 기록하기 위한 뇌 절편을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 두개골에서 뇌를 제거함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 A CSF가 담긴 얼음에서 뇌를 빠르게 냉각시킨 후 450 micron 두께의 절편으로 자르는 것입니다.다음으로, 슬라이스를 기록 챔버로 옮기고 자극 전극을 stratum에, 기록 전극을 ca one stratum parama doole에 배치합니다. 마지막 단계는 감마 진동을 유도하고 약물이 신경 세포 흥분성에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 최종적으로, 해마 감마 진동의 특성 분석은 네트워크 기능에 대한 약물의 효과를 보여주거나 신경 유전 질환의 질병 발생 메커니즘을 이해하는 데 사용됩니다.이 방법은 뇌전증, 자폐증, 알츠하이머병과 같이 신경망 흥분성이 증가하는 질환의 메커니즘에 대한 통찰을 제공하는 데 사용할 수 있으며, 약물의 작용 기전을 조사하는 데에도 활용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 250 milliliter 비커에 높게 솟은 나일론 메쉬를 삽입하여 홀딩 챔버를 준비합니다. 다음으로, 메쉬가 약 2 cm 정도 잠길 때까지 비커에 CSF를 채우고, 실온에서 carbogen으로 버블링합니다.기포가 슬라이스 고정 부위를 직접적으로 방해하지 않도록 하십시오. 그런 다음 큰 가위, 작은 가위, 소형 및 대형 마이크로 스패튤라, 그리고 소형 및 대형 핀셋을 포함한 해부 도구들을 얼음 위에 놓으십시오. 냉각된 Vibram 조직 절단 블록을 얼음 위 알루미늄 호일 위에 놓으십시오.해당 수리 후, 6 cm 필터 페이퍼 두 조각, 외날 면도날, 그리고 절단 용액 슬러리가 채워진 25 mL 비커를 준비합니다. 다음으로, 뇌 해부를 위해 두 번째 용기에 얼음을 채웁니다. 얼음 위에 티슈 페이퍼 한 장을 깔고 그 위에 12 cm 배양 접시를 올립니다.그 후 배양 접시에 절단 용액의 얼음 슬러리를 채우고 카보겐(carbogen)으로 버블링합니다. 이 과정에서 소형 가위를 사용하여 코 방향의 머리 피부와 결합 조직을 박리하고, 결합 조직을 절개하여 아래의 두개골을 드러냅니다. 그런 다음 두개골의 등쪽 면과 목을 덮고 있는 근육을 제거합니다.뇌를 적출하기 위해, 커다란 포셉을 사용하여 두개골 앞부분을 고정합니다. 그런 다음 rem과 magnum 양측의 뼈를 따라 두 번의 외측 절개를 수행합니다. 그 후, bgma 바로 앞쪽의 양 눈 사이를 가로질러 추가로 절개합니다.시상봉합을 따라 조심스럽게 절개하고, 절단된 두개골 부분을 젖혀 뇌를 노출시킵니다. 다음으로, 소형 스패출러를 사용하여 뇌신경이 손상되지 않도록 주의하며 뇌를 긁어냅니다. 뇌를 배양 접시에 옮겨 담습니다.그런 다음 뇌를 절단액 슬러리가 채워진 25 milliliter 비커로 옮깁니다. 슬라이싱을 위해 뇌 반구를 준비하려면, 배양 접시 바닥에 6 centimeter 여과지를 놓습니다. 그런 다음 신선한 절단액 슬러리를 채우고 car로 기포를 발생시킵니다.그 다음, 뇌의 복측면이 아래로 향하게 하여 여과지에 놓습니다. 이어서, 새것의 깨끗한 단일면 면도날을 사용하여 소뇌를 제거합니다. 중앙선을 따라 절개하여 두 반구를 분리합니다.Vibram 조직 블록을 준비하려면, 냉각된 Vibram 조직 절단 플랫폼의 표면을 건조시키십시오. 중앙에 Sano ACRL 접착제를 한 방울 떨어뜨리고 뇌의 대략적인 크기에 맞게 고르게 펴 바릅니다. 작은 스패튤라를 사용하여 뇌 반구 하나를 커다란 마이크로 스패튤라 위로 옮긴 다음, 뇌의 내측면이 아래를 향하도록 배치하십시오.거름종이 한 조각으로 뇌 용액을 가능한 한 많이 흡수합니다. 그런 다음 큰 스패튤라에서 뇌를 미끄러뜨려 옮긴 후, 작은 스패튤라를 사용하여 뇌를 접착제 위로 안내합니다. 그 후, 절단 플랫폼을 Vibram 챔버에 고정합니다.절단 용액 슬러리를 이용하여 뇌가 완전히 잠기도록 챔버를 구성하고 카보젠(carbogen)으로 용액에 기포를 공급합니다. 그런 다음 절단 플랫폼을 회전시켜 뇌의 복측(vental side)이 칼날을 향하게 합니다. 뇌를 450 micrometers 두께의 섹션으로 절단하며, 복측 표면에서 배측(dorsal surface) 표면 방향으로 절단하여 전기생리학적 기록을 위한 전뇌 시상면 슬라이스를 제작합니다.슬라이스의 바닥 부분이 들뜨는 경우, 27 gauge 굴곡 바늘을 사용하여 슬라이스를 조심스럽게 눌러줍니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 슬라이스를 보관 챔버로 옮깁니다. 일반적으로 각 반구에서 3~4개의 hippo Campbell 슬라이스를 절단하여 기록 챔버에 장착할 수 있습니다.분당 1~2 mL의 속도로 CSF가 흐르고 32 °C로 가열된 침수 기록 챔버에 뇌 절편을 넣습니다. 기록에 사용되는 A CSF는 마그네슘 농도가 2 mM에서 4 mM로 증가하여 유지 챔버의 CSF와 다릅니다. 반원형 스테인리스강 무게추의 가닥이 해마 ca 1과 평행하게 놓이도록 하여 절편을 고정합니다.그 후, 32°C에서 관류 속도를 8~10 mL/min으로 높입니다. 해부 현미경을 사용하여 자극 전극을 stratum orients의 중앙으로 이동시킵니다. 그런 다음 기록 전극을 자극 전극에 최대한 가깝게 parameter layer로 이동시킵니다.그 후, 자극 전극과 기록 전극 모두를 슬라이스 내부로 50~100 µm 낮춥니다. 감마 진동을 유도하기 위해 120~150 µA의 테스트 펄스에 반응하여 1 mV의 field EPSP를 생성하려면, 200 Hz로 전달되는 0.1 ms 펄스 20회 열로 조직을 자극하십시오. 이러한 강력한 자극은 5분마다 전달될 때 재현 가능한 반응을 얻을 수 있습니다.이 도식은 CA1 영역의 stratum oriens에 위치한 자극 전극과 stratum pyramidale에 위치한 기록 전극의 위치를 보여줍니다. 여기는 전기 자극에 의해 유도된 감마 진동의 예시입니다. 이 그림은 20 $\mu$M CNQX를 이용한 AMPA 수용체 차단, 20 $\mu$M bicuculline을 이용한 $\text{GABA}_A$ 수용체 차단, 20 $\mu$M picrotoxin을 이용한 $I_H$ 전류 차단, 그리고 T-타입 칼슘 채널의 약리학적 차단을 보여줍니다.100 µM nickel 조건에서, 각 약제는 독립적으로 스파이크 생성 수를 감소시킬 수 있었습니다. 이러한 준비 과정은 약물의 네트워크 규모 작용을 결정하는 데 이상적입니다. Tine은 칼륨 채널을 열어 막 흥분성을 감소시키는 임상적으로 사용되는 항경련제입니다.tine을 처리한 결과, 진동 지속 시간 동안의 스파이크 수가 농도 의존적으로 감소하였습니다. 본 절차를 숙달하면 뇌 슬라이스 준비 및 전기생리학적 기록을 위한 박리를 약 10분 이내에 수행할 수 있습니다. 전세포 패치 클램프 기록과 같은 다른 방법들을 추가로 적용하여, 약물 투여 후 또는 질병 상태에서 네트워크 내 개별 뉴런의 역할을 이해할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

절연 hippocampi에서 급성 뇌 조각뿐만 아니라 astrocytes와의 뉴런의 동시 electrophysiological 레코딩의...

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

이 비디오는 테타닉 시뮬레이션을 사용하여 CA1 해마 마우스 뇌 절편에서 국소 CA1 감마 진동을 유도하는 절차를 보여줍니다. 이 방법은 뉴런 네트워크 활동을 이해하는 데 중요합니다.

해마 뇌 절편에서 테타닉 자극을 사용하여 국소 cornu ammonis 1 (CA1) 감마 진동 생성

이 비디오는 쥐 해마 절편에서 CA3-CA1 시냅스 반응을 기록하는 방법을 보여줍니다. 해마 절편에 자극 및 기록 전극을 배치하고 시냅스 반응 강도를 평가하기 위해 fEPSP(field excitatory postsynaptic potential)를 측정하는 단계를 간략하게 설명합니다.

쥐 해마 절편에서 CA3-CA1 시냅스 반응 기록

이 비디오는 쥐의 뇌 절편에서 유전적으로 변형된 빛에 민감한 인터뉴런을 활성화하여 세타 진동 동기화를 향상시키고 신경 회로 동작을 연구함으로써 광유전학을 사용하여 해마 네트워크 역학을 조절하는 방법을 보여줍니다.

해마 네트워크 역학의 광유전학적 제어

pedunculopontine 핵 (PPN)은 뇌간에 위치하고 있으며 그 뉴런은 최대한 깨어 및 빠른 안구 운동 (REM) 수면 뇌 상태 동안 활성화됩니다. 이 작품은 PPN 뉴런 시험관 감마 밴드 서브 쓰레 숄드 막 진동에 기록 할 수있는 실험 방법을 설명합니다.

Pedunculopontine 핵 뉴런에서 녹음 감마 밴드 진동

여기에서, 우리는 격리 된 전체 해마 제조물로부터 리듬 뉴런 네트워크 세타 및 감마 진동을 기록하기위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 해마 추출에서 현장, 단일 및 전체 세포 패치 클램프 녹음뿐만 아니라 theta 리듬의 광 발생기 페이싱에 이르기까지의 실험 단계를 설명합니다.

Hippocampal 쎄타 밴드의 튜닝<em&gt; 체외에서</em&gt; : 격리 된 설치류 Septohippocampal Circuit에서 기록하는 방법론

우리 동작 쥐에서 hippocampal 세타 진동 (5-10 Hz)의 선택적 조작에 대 한 optogenetics 및 electrophysiological 기록의 사용을 설명합니다. 리듬 유입의 효능은 사용 하 여 로컬 필드 가능성을 모니터링 하 고 있다. 광학-및 pharmacogenetic 저해의 조합 해결 hippocampal 동기화의 원심 판독 합니다.

Optogenetic 쥐 행동에 Hippocampal 세타 진동의 유입

이 프로토콜 로컬 필드 전위 선형 실리콘 프로브 멀티 생크와의 녹음을 설명 합니다. 현재 소스 밀도 분석을 사용 하 여 신호 변환 마우스 해 마에 지역 전기 활동의 개조를 허용 한다. 이 기술을 공간적으로 제한 된 뇌 진동 자유롭게 마우스를 이동에 공부 될 수 있다.

행동 하는 쥐의 해 마에서 진동 제한 공간 기록

급성 발작 모델은 epileptiform 이벤트를 기본 메커니즘을 공부 하 고 중요 합니다. 또한, epileptiform 이벤트에 수요를 생성 하는 기능에는 그들의 개시를 기본 이벤트의 정확한 순서를 공부 하 매우 효율적인 방법을 제공 한다. 여기, 우리가 마우스 및 인간의 조직에 급성 4-aminopyridine 대뇌 피 질의 발작 모델을 설명 합니다.

설치류와 인간의 조직에 급성 Ictal 활동의 생성 및 요청 시 개시

여기 우리는 캘리포니아2 + 이미징 신경 그리고 glial 세포, 캘리포니아2 + 신호 subcellular 해상도 해 부를 수 있게 하는 프로토콜을 제시. 이 프로세스는 유전자 인코딩된 Ca2 + 지표의 식을 허용 하는 모든 셀 형식에 적용 됩니다.

로컬 Ca2 + 신호 막 대상 Ca2 + 지표에 의해 경작된 한 세포에의 해 부

우리는 세로 해마 뇌 슬라이스에 기록 및 자극 전극을 사용하고 세포 외 후유증 전위를 불러 일으키고 입증하기 위해 생체 내 등도 해마에서 세로 로 배치 된 기록 및 자극 전극을 사용했습니다. 세로 인터라멜라 CA1을 따라 장기 시냅스 가소성.

전기 생리학 필드 기록에 의하여 인터라멜라 해마 CA1에 있는 장기 시냅스 가소성 조사

학습하세요 뇌 슬라이스를 준비하여 CA1 영역의 감마 진동을 기록하는 방법을. 이 기법은 신경흥분성 모델로 약물 효과를 평가하고 신경질환의 발병 기전을 이해하는 데 활용됩니다.

파상풍의 자극에 의​​해 지역의 CA1 γ 진동의 발생

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