파상풍의 자극에 의​​해 지역의 CA1 γ 진동의 발생

이 절차의 전반적인 목표는 신경 흥분성의 모델로서 세포 외 감마 진동을 기록하기 위해 뇌 절편을 준비하는 것입니다. 이것은 먼저 두개골에서 뇌를 제거함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 뇌척수액(CSF)이 함유된 얼음으로 뇌를 빠르게 냉각시켜 450미크론 조각으로 자르는 것입니다.

다음으로, 슬라이스를 기록실로 옮기고 자극 전극을 지층에 배치하고 기록 전극을 ca-one stratum parama doole에 놓습니다. 마지막 단계는 감마 진동을 유도하고 약물이 신경 흥분성에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 궁극적으로, 해마 감마 진동의 특성화는 네트워크 기능에 대한 약물의 효과를 보여주거나 신경 유전 질환에서 질병 발생의 메커니즘을 이해하는 데 사용됩니다.

이 방법은 간질, 자폐증, 알츠하이머병과 같이 신경 네트워크 흥분성이 증가하는 질병 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있으며 약물에 대한 작용 방법을 조사하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 250ml 비커에 돌출된 나일론 메쉬를 삽입하여 고정 챔버를 수리합니다. 다음으로, 비커에 CSF를 채워 메쉬를 약 2cm 덮고 실온에서 탄수화물로 거품을 냅니다.

거품이 슬라이스 고정 영역을 직접 방해하지 않는지 확인하십시오. 그런 다음 큰 가위, 작은 가위, 크고 작은 마이크로 주걱, 작고 큰 집게를 포함한 해부 도구를 얼음 위에 놓습니다. 냉각된 Vibram 조직 절단 블록을 얼음 위의 알루미늄 호일에 놓습니다.

그 수리 후, 6cm 여과지 두 장, 단일 가장자리 면도날, 절단 용액 슬러리로 채워진 25ml 비커. 다음으로, 뇌 해부를 위해 두 번째 용기에 얼음을 채웁니다. 얼음 위에 티슈 한 장을 깔고 그 위에 12cm 배양 접시를 놓습니다.

그런 다음 배양 접시에 절단 용액 얼음 슬러리를 채우고 발암제로 거품을 일으킵니다. 이 절차에서는 작은 가위를 사용하여 코쪽으로 머리의 피부와 결합 조직을 치료하고 결합 조직을 잘라 밑에 있는 두개골을 드러냅니다. 그런 다음 두개골과 목의 등쪽 위에 있는 근육을 제거합니다.

뇌를 제거하려면 한 쌍의 큰 집게로 두개골 앞쪽을 고정하십시오. 그런 다음 rem과 magnum의 양쪽에 있는 뼈를 두 개의 측면 절단으로 만듭니다. 그런 다음 bgma 바로 앞쪽의 눈 사이를 다시 절개합니다.

시상 봉합선을 따라 조심스럽게 자르고 절단된 두개골 부분을 반사하여 뇌를 드러냅니다. 다음으로, 작은 주걱을 사용하여 뇌를 퍼내고 뇌 신경을 조심스럽게 절단합니다. 배양 접시에 뇌를 넣으십시오.

그런 다음 절단 용액 슬러리로 채워진 25ml 비커로 뇌를 옮깁니다. 뇌 반구를 썰 준비를 하려면 6cm 여과지 조각을 배양 접시 바닥에 놓습니다. 그런 다음 새로운 절단 용액, 슬러리, 거품으로 채우고 자동차로 거품을 일으킵니다.

그런 다음 뇌 복부 쪽을 필터 페이퍼 위에 아래로 놓습니다. 다음으로, 깨끗하고 깨끗한 새 면도날로 소뇌를 제거합니다. 두 반구를 분리하기 위해 정중선을 따라 자릅니다.

Vibram 조직 블록을 준비하려면 냉각된 Vibram 조직 절단 플랫폼의 표면을 건조시킵니다. 중간에 Sano ACRL 접착제 한 방울을 놓고 뇌의 대략적인 크기에 맞게 골고루 펴 바릅니다. 작은 주걱을 사용하여 한쪽 반구를 큰 마이크로 주걱으로 옮기고 뇌의 내측이 아래를 향하도록 배치합니다.

가능한 한 많은 여과지 조각으로 뇌의 용액을 흡수하십시오. 그런 다음 더 큰 주걱에서 뇌를 밀어내고 더 작은 주걱을 사용하여 접착제 위로 유도합니다. 그런 다음 절단 플랫폼을 Vibram 챔버에 고정합니다.

절단 용액 슬러리로 챔버를 구축하여 뇌를 완전히 덮고 발암제로 용액을 거품을 일으킵니다. 그런 다음 뇌의 복부 쪽이 칼날을 향하도록 절단 플랫폼을 회전합니다. 뇌를 450마이크로미터 두께의 절편으로 자르고, 복부 표면에서 등쪽 표면까지 뇌를 절단하여 전기생리학적 기록을 위한 전체 뇌 시상 절편을 생성합니다.

슬라이스의 바닥이 들리면 구부러진 27 게이지 바늘을 사용하여 슬라이스를 부드럽게 누릅니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 슬라이스를 고정 챔버로 옮깁니다. 일반적으로 3-4개의 하마 캠벨 슬라이스를 각 반구에서 절단하여 녹음실에 슬라이스를 장착할 수 있습니다.

뇌 절편을 수중 기록실에 넣고 분당 1-2밀리리터로 흐르는 CSF를 관류하고 섭씨 32도까지 가열합니다. 녹음을 위한 A CSF 사용은 마그네슘 농도가 2밀리몰에서 4밀리몰로 증가하기 때문에 홀딩 챔버의 CSF 사용과 다릅니다. 반원형 스테인리스 스틸 추를 그 위에 놓고 가닥이 해마와 평행하도록 슬라이스를 고정합니다.

그런 다음 섭씨 32도에서 분당 8-10밀리리터로 관류 속도를 높입니다. 해부 현미경을 사용하여 자극 전극을 지층 방향의 중앙으로 이동합니다. 그런 다음 기록 전극을 자극 전극에 최대한 가깝게 매개변수 층으로 이동합니다.

그런 다음 자극 전극과 기록 전극을 모두 슬라이스 안으로 50-100 마이크로 미터 낮춥니다. 감마 진동을 생성하기 위해 120-150 마이크로 테스트 펄스에 응답하여 1 밀리 볼트의 필드 EPSP를 생성하기 위해 200 헤르츠에서 전달되는 20 곱하기 0.1 밀리 초 펄스의 트레인으로 조직을 자극하십시오. 이 타이타닉 자극은 5분마다 전달될 때 재현 가능한 반응을 생성할 수 있습니다.

이 개략도는 지층 방향에서의 자극 전극의 위치와 ca 1의 지층 파라에서 기록 전극의 위치를 보여줍니다. 다음은 타이타닉 자극에 의해 유도되는 감마 진동의 예입니다. 이 그림은 20 마이크로몰을 가진 AMPA 수용체, 20 마이크로몰을 가진 CN QX gabaa 수용체, 20 마이크로몰 페리듐, 염화물 및 T형 칼슘 채널이 있는 Coline IH 전류에 의한 수용체의 약리학적 차단을 보여줍니다.

100마이크로몰 니켈을 사용하여 각 작용제는 생성되는 스파이크의 수를 독립적으로 줄일 수 있었습니다. 이 제제는 약물의 네트워크 규모 작용을 결정하는 데 이상적입니다. Tine은 칼륨 채널을 열고 막 흥분성 목욕을 감소시키는 임상적으로 사용되는 항간질제입니다.

타인을 적용하면 진동 지속 시간 동안 스파이크 수가 선량 의존적으로 감소했습니다. 일단 숙달되면 뇌 절편 준비와 전기 생리학적 기록을 위한 해부는 이 절차에 따라 약 10분 안에 수행할 수 있습니다. 전체 세포 패치 클램프 기록과 같은 다른 방법을 추가하면 질병에서 네트워크 내 개별 뉴런의 역할을 이해하고 약물 적용 후 다음을 이해할 수 있습니다.