구현 체외 약물 저항 분석법 : 임상 적 저항 메커니즘을 폭로 가능성을 극대화

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 종류의 치료법에 대한 내성을 기능적으로 유도할 수 있는 임상적으로 관련된 단일 뉴클레오티드 변이체의 전임상 발견을 촉진하는 것입니다. 이 방법은 어떤 유전자 돌연변이가 임상에서 치료법에 대한 기능적 내성에 기여할 수 있는지와 같은 종양학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 궁극적으로 약물 내성 환자를 위한 치료법 및 대체 임상 관리 전략의 개선을 안내할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 자발적 돌연변이의 출현을 촉진하고 내성 클론에 편향되지 않은 스크리닝 기술을 적용하기 때문에 이러한 변이가 임상에서 재발 표적 치료를 주도할 가능성이 더 크다는 것입니다.

절차를 시연하는 것은 제 실험실의 매우 재능 있는 연구자가 GI 50의 세포주를 평가하는 것입니다. 투명하지 않은 투명하게 세포를 파종하여 분석 플레이트를 준비합니다. 여기에 표시된 지도에 따라 100마이크로리터의 세포 배지에 있는 96개의 웰 플레이트를 바닥

유사한 방식으로 대조판을 준비하여 파란색 웰에 세포를 추가하고 흰색 웰에는 배지만 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양한 후 발광 세포 생존율 시약을 실온으로 평형을 이루고 반전하여 부드럽게 혼합합니다. 균일한 용액을 얻으려면 제어판의 웰에 80마이크로리터의 시약을 넣고 내용물을 30분 동안 흔듭니다.

세포 용해를 유도합니다. 0.1초에서 1.0초의 노출과 560나노미터의 감지 파장을 가진 광도계를 사용하여 발광을 기록합니다. 다음으로, 테스트 화합물을 분석 플레이트에 추가하려면 DMSO에서 화합물을 2000 마이크로 몰 농도로 시작하여 총 10 회 희석하는 일련의 희석을 만듭니다.

그런 다음 연속적으로 희석된 화합물을 배지에 첨가하여 10 x 최종 농도에서 화합물 배지 혼합물을 만듭니다. 복합 플레이트를 섭씨 영하 20도에서 보관하여 분석 3일차에 사용합니다. 다음으로, 10 마이크로 리터의 희석 된 화합물을 최대 용량이 10 마이크로 몰이 되도록 3 회 세포에 첨가합니다.

접시를 섭씨 37도에서 3일 동안 배양합니다. 3일차에는 3일 전에 준비된 복합 플레이트를 사용하여 400마이크로리터 1X 복합 배지 믹스를 준비합니다. 분석 플레이트를 뒤집어 매체를 제거하고 오토클레이브 종이 타월로 두드려 건조시킵니다.

파란색 음영 우물에 1 x 화합물을 첨가하고 증발을 방지하기 위해 100 마이크로 리터의 매체 우물을 주변 우물에 첨가하십시오. 6일차에는 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 발광 판독을 통해 생존 가능한 세포의 상대적 수를 평가합니다. 그런 다음 계산된 GI 50 값을 사용하여 PRISM과 같은 소프트웨어를 사용하여 GI 50 값을 계산하고 약물 내성 분석을 위해 세포를 설정합니다.

세포증식제와 함께 작업하는 경우, 150mm 정사각형 배양 접시에 30-40% 합류 세포를 종자화합니다. 독성 물질로 작업하는 경우 70-80% 합류점에서 세포를 확인하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 초기 화합물 농도를 측정한 후, 6일간의 생존율 분석에서 세포 사멸을 유발하는 고독성 화합물에 대한 테스트 화합물로 세포를 처리합니다.

GI 50으로 시작하여 강력한 내성이 관찰될 때까지 2-3주마다 농도를 점진적으로 높이십시오. 단일 세포 클론을 분리하려면 40배 배율에서 위상차 현미경을 사용하여 배양 접시를 검사하고 접시 바닥에 있는 생존 가능한 세포 클러스터를 식별합니다. 펜을 사용하여 평균 크기이고 다른 콜로니와 잘 격리된 클론을 표시한 후 P 200 파이펫터를 사용하여 클론을 선택합니다.

접시에서 성장 배지를 제거하고 하나의 XPBS를 사용하여 떠 있는 세포를 헹굽니다. 피펫 팁을 사용하여 클론을 들어 올리고 50마이크로리터의 0.25% 트립신이 포함된 48웰 플레이트의 웰로 옮기고 섭씨 37도에서 1-2분 동안 배양합니다. 그런 다음 화합물 농도의 절반으로 200마이크로리터의 새 배지를 첨가하여 세포를 최적으로 회수할 수 있습니다.

3mm 클로닝 디스크를 사용하여 클론을 분리하려면 5밀리리터의 0.25% 트립신 EDTA가 들어 있는 10cm 조직 배양 접시에 디스크를 2분 동안 넣습니다. 다음으로, 저항성 클론을 포함하는 접시에서 배지를 흡인하고 클론을 트립 및 담근 클로닝 디스크와 오버레이합니다. 섭씨 37도에서 1-2분 동안 배양하면 클론이 플레이트에서 얼마나 쉽게 들어 올릴 수 있는지에 따라 다릅니다.

다음 메마른 겸자를 사용하여, 클로닝 원판을 줍고 신선한 매체의 200 마이크로리터를 가진 48의 좋은 판으로 옮기고, 합성 원판에서 세포를 몰아내기 위하여 여기저기 온화하게 피펫을 삐걱거리게 하고, 다음 날 37 도에 밤새 배양하고, 클로닝 원판을 제거하고, 세포를 배양하십시오, 그런 다음 약물 내성을 평가합니다. 텍스트 프로토콜에 따르면, 여기에 나타난 바와 같이, HCT one 16 세포는 세포독성으로 장기간 처리되었다. 1번 화합물은 치료 중에 계속 성장하는 내성 클론의 자발적인 출현으로 이어졌습니다.

클론은 피펫맨을 사용하여 골라냈습니다. 이 그림에서 내성 클론 1에서 3은 모두 화합물 번호 1 및 가까운 아날로그 화합물 번호 2에 대해 상당한 내성을 보인 반면, 모든 클론은 관련이 없는 세포독성 화합물에 대한 민감성을 보여주었습니다. 벨케이드. 표현형 저항성이 확인된 후, GDNA를 분리하여 전체 엑솜 염기서열분석 분석을 위해 제출했습니다.

재발적이고 기능적 영향을 미칠 가능성이 있는 구조적 변형은 Sanger 염기서열분석과 같은 독립적인 염기서열분석 도구에 의해 확인되었습니다. 여기에 표시된 예는 이형접합 미센스 돌연변이를 가지고 있으며, 부모 세포주는 이후에 돌연변이된 CDNA를 발현하도록 조작되었습니다. 반면 야생형 CDNA의 과발현은 약물 내성을 부여하지 못했습니다.

돌연변이 CD NA는 화합물 번호 1에 표현형 저항성을 유의하게 부여하여 저항성의 동인으로서 구조적 변이의 기능적 역할을 확인했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 암세포의 약물 내성을 담당하는 유전자를 스크리닝하기 위해 자발적 내성 성장을 발달시키는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 종양학 분야의 연구자들이 암 세포주와 동물 모델 모두에서 편견 없는 방식으로 약물 내성 메커니즘을 탐구할 수 있는 방법을 제공합니다.