임상 적으로 구축

이 절차의 전반적인 목적은 상처 치유 과정을 고유한 미세환경에서 관찰할 수 있는 임상적으로 유의미한 모델을 제작하는 것입니다. 이는 먼저 병아리 배아의 눈에서 수정체를 제거함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 수정체 전면에 작은 절개를 만드는 것입니다.

그런 다음 렌즈 섬유 세포 덩어리를 수압으로 용출합니다. 다음으로, 전낭에 추가적인 절개를 가하여 상피가 포함된 렌즈 낭을 평평하게 폅니다. 마지막 단계로, 상처 치유 과정을 관찰하기 위해 손상된 배양물을 조직 배양 접시에 고정합니다.

최종적으로, 타임랩스 현미경 관찰, 공초점 현미경 관찰 및 생화학적 분석을 통해 생체 내 환경을 밀접하게 재현한 모델에서 상처 치유 기전을 규명합니다. 이 방법은 세포들이 어떻게 협력하여 이동하며 상처를 폐쇄하는지와 같은 상처 치유 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 방법은 상처 치유 과정에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

이는 ABER 상처 치유, 특히 섬유화 및 흉터 연구에도 적용될 수 있습니다. 우선 멸균 라미나 플로우 후드에 100 millimeter 페트리 접시 3개를 놓습니다. 페트리 접시 중 2개에는 실온의 tris dextrose buffer를 절반 정도 채우고, 나머지 하나는 비운 상태로 둡니다.

그런 다음 37.7 °C 인큐베이터에서 수정된 배아 15일 차 화이트 레그혼 병아리 알을 꺼내고, 껍질 외부를 70% ethanol로 닦아 멸균합니다. 이어서 알을 조심스럽게 깨뜨려 내용물을 빈 100 mm 페트리 접시에 담습니다. 표준 핀셋과 미세 가위를 사용하여 배아의 머리를 절단한 후, TST 덱스트로스 완충액이 담긴 접시 중 하나에 머리를 넣습니다.

15분 이내에 병아리 배아의 머리를 페트리 접시 뚜껑 위로 옮깁니다. 고정밀 핀셋을 사용하여 안구의 후면을 집어 안구 뒷부분에 작은 구멍을 냅니다. 그런 다음 핀셋으로 유리체를 잡고 굴리는 동작으로 유리체를 부드럽게 잡아당깁니다.

수정체가 붙은 유리체가 안구에서 떨어져 나옵니다. 수정체와 유리체를 Tex extras Buffer가 들어 있는 나머지 페트리 접시에 넣으십시오. 해부를 계속하기 전, 수정체를 버퍼 내에 30분 이상 두지 마십시오.

다음으로, 정밀 핀셋을 사용하여 실체 현미경 하에서 수정체를 새로운 페트리 접시 뚜껑으로 옮기고, 수정체와 함께 떨어져 나온 모양체 세포들을 핀셋의 끝을 이용해 조심스럽게 털어냅니다. 그런 다음, 수정체 후낭과 연결된 유리체를 집어내어 수정체와 유리체를 분리합니다. 분리가 완료되면, 35 mm 조직 배양 접시에 담긴 200 µL의 tris dextrose 완충액 방울 속으로 수정체를 옮기고, 수정체의 전면이 위를 향하도록 배치합니다.

수정체 상피의 내부와 적도 부위 사이의 경계를 나타내는 조직 내의 조밀한 고리를 통해 수정체 전면을 쉽게 식별할 수 있습니다. 두 개의 고정밀 핀셋을 사용하여, 양손에 핀셋을 하나씩 쥐고 조직을 잡은 뒤 서로 반대 방향으로 부드럽게 당겨 수정체 전낭 중심부에 약 850 microns 길이의 작은 절개를 만듭니다. 다음으로, 27.5 gauge 바늘 팁이 장착된 1 milliliter 주사기에 300 microliters의 TST dextrose buffer를 채웁니다.

바늘 끝을 전낭의 절개창에 삽입하고 수정체의 중간 정도까지 밀어 넣습니다. 그런 다음 시린지를 천천히 눌러 TST dextrose buffer를 수정체 내로 주입합니다. 섬유 세포 덩어리.

주변 상피와 수정체 낭으로부터 섬유 세포 덩어리를 분리하기 위해 50에서 200 µL의 완충액을 주입합니다. 300 µL 이상을 주입하지 마십시오. 고정밀 포셉을 사용하여 분리된 섬유 세포 덩어리를 전방 절개 부위를 통해 수정체에서 제거합니다.

후낭의 부착 부위에서 섬유세포 덩어리를 제거하면, 손상된 상피로 둘러싸인 기저막에 매우 재현성 높은 상처 부위가 생성됩니다. 수정체 낭에서 시작하여, 수정체의 전면에서 적도 방향으로 다섯 번 절개합니다. 이렇게 생성된 상피가 부착된 다섯 개의 수정체 낭 플랩을 배양 접시에 낭 쪽이 아래로, 세포 쪽이 위로 향하게 하여 평평하게 폅니다.

포셉으로 별 모양의 각 지점을 살짝 눌러 캡슐을 디쉬에 고정합니다. 이렇게 하면 x explan의 가장 바깥쪽 다섯 끝부분에 작은 함몰이 생겨 디쉬에 지속적으로 부착됩니다. 그런 다음 35 millimeter 디쉬에서 tris dextrose buffer를 제거하고 이를 1.5 milliliters의 예열된 M1 99로 교체합니다.

L-glutamine과 페니실린-스트렙토마이신을 각각 1%씩 첨가한 배지를 사용합니다. 배양 접지의 뚜껑을 닫고 인큐베이터에 넣습니다. 배양 접지를 해부 현미경 아래에 두고, 상피 세포의 중앙 이동 구역과 원래의 부착 구역 사이의 경계선을 관찰합니다.

그 다음, 두 개의 고정밀 핀셋을 사용하여 두 구역 사이의 경계선 양측 가장자리를 잡습니다. 경계선을 따라 원래의 부착 구역을 부드럽게 당겨 두 구역을 쉽게 분리합니다. 두 영역이 완전히 분리될 때까지 배양 전체 영역을 따라 계속해서 두 구역을 분리합니다.

표준 분자 또는 생화학적 분석 기술을 사용하여 두 분획을 연구하십시오. 섬유 세포 덩어리를 제거한 직후, 중간엽 복구 세포가 풍부한 하위 집단이 활성화되어 상피의 상처 가장자리로 이동합니다. 이 세포들은 치유를 시작하기 위해 내인성 기저막 캡슐의 세포가 없는 영역인 중앙 이동 구역으로 빠르게 이동합니다.

상처의 경우, 여기 설명된 기술은 현미경이나 비디오 카메라로 이 과정을 관찰하기 위해 이 모델 시스템을 완벽하게 준비합니다. 상처 치유는 배양 1일 차에 상처의 상당한 영역을 덮으며 빠르게 진행됩니다. 3일 차가 되면 일반적으로 중앙 이동 구역과 원래 부착 구역이 분리되면서 상처 치유 과정이 완료됩니다. 본 연구에서는 이러한 서로 다른 구역 간의 분자적 차이를 분석하였습니다.

두 구역에서 focal adhesion kinase의 수치를 측정하였으며, 인산화된 focal adhesion kinase의 양은 이동 특이적 중심 이동 구역에서 증가한 것으로 나타났습니다. 일단 숙달되면, 이 모의 백내장 수술 기법은 적절히 수행될 경우 3분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 천연 미세환경에서의 상처 치유를 밀접하게 모방하는 모의 백내장 수술 모델을 만드는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.