Name: 임상 적으로 구축 전의 VIVO 모의 백내장 수술 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 배우세요 닭 배아 안구에서 수정체를 제거하고 절개하여 수술 후 상피 조직의 손상 반응과 상처 치유 메커니즘을 실시간으로 관찰하는 임상 관련 ex vivo 백내장 모의 수술 모델을 구축하는 방법을.

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이 작업은 National Institutes of Health Grant to A.S.M. (EY021784)의 지원을 받았습니다.

다음 프로토콜은 토마스 제퍼슨 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 지침 및 비전 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 방침을 준수합니다. 예 생체 상처 문화 렌즈 1. 설치 및 준비 <ol><li> 멸균, 층류 후드 세 100mm 페트리 접시를 놓습니다. 실온에서, 중간 트리스 / 우선 당 버퍼와 배양 접시 두 개를 (140 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을, 0.7 mM의 나 2 PO 4, 5 mM의 D-포도당, 8.25 mM 트리스 자료, 염산으로 pH 7.4까지 TD 버퍼)를 입력 세 번째 빈 떠나. 사전 따뜻한 배양 배지를 37 ℃로 O (미디어 (199)는, 1 % L- 글루타민 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된) 참고 : 생체 내에서 발생으로 문화 매체를 치유 표준 상처, 무 혈청이다 그러나, 상처 수복 배양 혈청 또는 다른 인자를 포함 한정 배지 조건에서 성공적으로 성장시킬 수있다. </li><li> 비옥 한 배아 D를 제거바깥 인큐베이터에서 15 화이트 레그혼 병아리 달걀 (부드러운 락과 37.7 ° C에서 개최) </li><li> 세척 병에서 층류 후드 70 % 에탄올로 쉘의 깨끗한 외부에서 선택한 달걀을 놓습니다. 멸균 솔루션과 장비를 사용하여 층류 후드에서 무균 조건 아래 모든 절차를 실시한다. </li><li> 빈 100mm 페트리 접시에 계란과 장소 내용을 균열. 표준 집게 및 미세 가위를 사용하여 배아 목을 벨. TD 버퍼를 포함하는 배양 접시에 병아리 배아의 머리를 놓고 제대로 배아의 나머지를 폐기하십시오. 선택적으로 15 분보다 더 짧은 시간에 대한 TD 버퍼 병아리 배아 헤드를 유지하지 않는다. </li><li> 페트리 접시 뚜껑에 병아리 배아 머리를 놓습니다. 고정밀 집게를 사용하여, 다음과 같은 순서로 눈로부터 부착 유리체와 함께 렌즈를 제거한다. 눈 뒤쪽의 작은 개구부를 생성하기 위해 집게 눈 뒤쪽 핀치. </li><li> 그런 다음, W 유리체 유머를 파악i 번째 집게 부드럽게 롤링 운동과 유리체에 예인선이 부착 된 렌즈 유리체는 눈에서 탈락됩니다. TD 버퍼를 포함하는 나머지 배양 접시에서 유리체 장소 렌즈 /. 렌즈는 더 이상 30 분 TD 버퍼에 남아 있도록 허용합니다. </li><li> 해부 현미경 새로운 배양 접시 뚜껑에 렌즈를 이동합니다. 이 시점부터 해부 현미경 아래의 모든 단계를 수행합니다. 고정밀 집게 조심스럽게 렌즈 조직이 손상되지 않도록주의를 복용, 집게의 가장자리를 사용하여 렌즈가 빠질 된 모든 모양체 (색소 세포)를 멀리 브러시. 참고 : 모양체 제거는 렌즈에 내생없는 종류의 세포가 상처 수리 문화에 포함되지 않도록합니다. </li><li> 후방 렌즈 캡슐과의 관계에서 유리체 몸을 곤란하게하여 고정밀 집게로 유리체 유머에서 렌즈를 분리합니다. </li><li> 높은 정밀도를 사용하여 작은 방울로 렌즈를 전송 겸자35mm 조직 배양 접시에 TD 버퍼 (약 200 μL)의. </li></ol> 2. 수행 모의 백내장 수술 <ol><li> 이 위를 향하게하여 렌즈의 전방 측면에 35mm 접시에 TD 버퍼의 드롭 렌즈의 방향을. 참고 : 렌즈의 앞쪽에 쉽게 렌즈 상피의 전방과 적도 지역의 경계를주의 조직의 밀도가 고리의 존재에 의해 식별됩니다. 대조적으로, 렌즈 섬유 세포가 부착되는 렌즈 캡슐의 후부에 마킹 부재가있다. </li><li> 각 손에 하나 집게로 조직을 파지하여 두 고정밀 집게는 전방 렌즈 캡슐 렌즈 조직을 둘러싸는 굵은 기저막 및 관련 전방 렌즈 상피의 중앙에 작은 절개 (약 850μm)하게 사용 부드럽게 반대 방향으로 잡아 당 겼. </li><li> 렌즈 용 티슈, dislod의 대부분을 구성하는 섬유의 균체를 분리렌즈 상피 세포에 첨부 파일에서 그것을 카 및 (그림 1A에서 모델링 고전적인 백내장 수술에 사용되는 방식) 수력 용출에 의해 수정체 낭 주변. </li><li> TD 버퍼 300 μL와 27.5 G 바늘 끝 1 ML의 주사기를 채우십시오. 앞쪽에 렌즈 캡슐에서 만든 절개로 바늘 끝을 삽입하고 대한 중간 렌즈로. </li><li> 부드럽게 렌즈 섬유 세포 덩어리로 TD 버퍼를 주입 주사기 우울. 50 ~ 200 μL의 TD, 결코 300 개 이상의 μl를 주입한다. 상피 및 렌즈 캡슐에서 자신을 풀어 섬유 세포 질량을 관찰한다. </li><li> 고정밀 집게를 사용하여, 전방 절개 부위를 통해 렌즈로부터 풀어 섬유 세포 덩어리를 제거한다. 참고 :이 절차는이 사이트에 바로 인접한 섬유 세포가 부착 된 세포의 무 결함했다되는 후방 렌즈 기저막 캡슐 및 부상 렌즈 상피 세포를 떠난다. </li></ol> 3. Preparin전의 VIVO 문화 G 부상 렌즈 <ol><li> 낭의 전방 측면에서 다섯 삭감하여, 배양 접시에 위에서 설명한 백내장 수술, 셀 사이드의 결과 렌즈 낭을 평평하게. </li><li> 렌즈의 균분 원을 통해 절개 부위에 수직으로 잘라. 아래로 배양 접시 캡슐 측에 부착 된 상피 세포 쪽이 위로 렌즈 캡슐의 결과 다섯 &quot;날개&quot;를 평평하게. 스타 또는 flowerlike 모양 (그림 1B 참조)해야 지금 생체 부상 렌즈를합니다. </li><li> 별의 각 지점에서 부드럽게 아래로 집게, 접시를 눌러 캡슐을 확보합니다. 이 이식편의 다섯 가장 바깥 끝에서 작은 들여 쓰기를하고 접시에 지속적인 첨부 파일에서 발생합니다. 주 :이 절차 중에 캡슐 손상 가능하며 그래서 FLA의 선단에 가깝게 접시에 캡슐을 고정하는 것이 중요가능한 PS뿐만 아니라 가능한 확보 지점 최소량을 만들기 위해 (일반적으로 두 플랩 당 최대 세). </li><li> 35mm 접시에서 TD 버퍼를 제거하고 미리 예열 미디어 1.5 ㎖로 교체합니다. 인큐베이터에서 뚜껑과 장소 35mm 접시 커버 (37 ° C를, 5 % CO 2). </li></ol> 후방 캡슐의 부상 영역의 재 상피화가 정량 분석​​을위한 렌즈 상피 세포의 원래 첨부 지대 (OAZ)에서 발생 중앙 마이그레이션 지대 (CMZ), 4. 분리. 참고 : 세포 손상에 대한 응답으로 즉시 CMZ 영역으로 이동하기 시작한다. 문화의 날 하나 충분한 세포는 미세 해부 (23)에 의해 CMZ와 OAZ의 분리 다음, 분자, 생화학 적 분석을 위해 CMZ를 통해 마이그레이션. 이 프로토콜은 캡슐의 상처 영역으로부터 한 번에 하나의 플랩 (OAZ)의 제거를 수반한다. <ol><li> demar을 준수양이온과 OAZ CMZ 사이, 해부 현미경 명확하게 볼 (도 2a 참조). 두 고정밀 집게를 사용하여, 라인의 양측에, OAZ / CMZ 라인에 바로 인접한 다른 하나의 에지에서 두 집게로 잡고 (도 2A, B, 화살표 참조). </li><li> 한 손으로 / CMZ 측의 한 집게는 다른 손 / 집게로 부드럽게 OAZ / CMZ 라인을 따라 OAZ을 끌어 동안, 부상자 문화에 개최하는 것을 계속한다. CMZ 쉽게이 선을 따라 OAZ에서 분리합니다. 두 지역이 완전히 분리 될 때까지 전체 문화 주위에이 라인을 따라 계속합니다. </li><li> 이러한 웨스턴 블롯 또는 공동 면역 (23, 25)와 같은 RNA-SEQ (24) 또는 생화학 적 분석과 같은 분자 분석을위한 분리 OAZ 및 CMZ 분수를 공부한다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

여기에서는 눈에서 제거한 후 병아리 배아 렌즈에 대해 생체 외 백내장 수술을 수행하는 상처 복구의 배양 모델을 준비하는 기술을 설명합니다. 수정체 상피는 생체 내에서 발생하는 것과 밀접하게 모방되는 복구 과정으로 이 임상적으로 관련된 상처에 반응하고 다른 상피 조직의 상처 복구와 특징을 공유합니다2,4. 프로토콜은 간단하고 따르기 쉽지만 배아 수정체로 모의 백내장 수술을 수행하려면 배아 수정체의 직경이 약 2mm에 불과하기 때문에 연습을 통해 습득할 수 있는 작은 조직을 다루는 기술을 개발해야 합니다. 백내장 수술 절차는 해부 현미경으로 수행되며, 중요한 기술 단계에는 전낭에 작은 절개를 하고, 수압 용출에 의해 섬유 세포 덩어리를 제거하고, 배양 연구를 위해 고정된 기질에 생 체 외 백내장 수술 후 수정체 조직을 평평하게 할 수 있도록 전방 상피를 추가로 절단하는 것이 포함됩니다. 미세 수술 백내장 수술 절차는 재현성이 높은 상처 부위를 생성하여 손상된 상피가...

임상 적으로, 모의 백내장 수술은, 여기에서 설명한 생체 상피 상처 치유 모델 부상에 응답하여 상피 조직의 복구를 조절 메카니즘을 조사하기위한 도구를 제공하기 위해 개발되었다. 이 모델을 창출을 목적으로 한 주요 기능은 밀접하게 복구 프로세스를 문화 설정, 2), 수리의 규제 요소를 변조의 완화에 부상에 대한 생체 반응을 복제하고 이미지 3) 기능 1) 제공하는 조건을 포함 실시간 전체에서. 과제는, 따라서, 세포의 미세 환경에서 원시 상피 상처 복구를 연구하는 것이 가능시킨 배양 모델을 생성하고 조작하는 것이었다. 이 상처 수리 모델의 유용성은 복구 프로세스를 조절하는 매트릭스 단백질, 사이토 카인 및 케모카인에서 내인성 시그널링 신호를 식별하기위한 새로운 가능성을 연다. 또한, 모델을 조사하기위한 이상적인 방법N 상피 창상 면적 2,3-을 다시 epithelialize하는 단체 시트 같이 부상 상피 4 집단 이주를 연출 기능 감긴 가장자리 간엽 리더 셀의 혈통을 결정하기위한 이동시킬 수있다. 이 모델은 또한 효과적인 상처 치유를 촉진하고 비정상적인 상처 수리 (5)을 방지 할 수 치료제를 식별하는 데 사용할 수있는 플랫폼을 제공한다. 가능한 상처 수리 모델의 수는 문화와 오늘 상처 복구 프로세스에 대해 알려진 대부분을 제공 한 생체, 모두, 이미있다. 이러한 각막 6-12 및 13-17 등 피부 손상 동물 모델에서의 기여를 포함하는 과정에 관여 할 수있는 모든 수리 매개체의 맥락에서 부상으로 조직의 반응을 연구 할 수있는 기회가있다 혈관 및 신경계. 그러나, experi 조작에 한계가있다생체 내에서의 정신적 상태 및 연속적으로 시간이 지남에 따라, 생체 내에서 수리 응답의 영상 검사를 실시 아직 가능하지 않다. 대조적으로, 이러한 스크래치 상처와 같은 대부분의 시험 관내 상처 수복 배양 모델들은 쉽게 조작 될 수 있고, 시간이 지남에 따라하지만 생체 조직에 상처 치유 공부의 환경 문맥이 부족하다. 생체 외 모델이 프로세스의 모든 시점에서 수리 분자 조절기를 조절하는 능력과 결합 된 세포의 미세 환경의 콘텍스트에서 시간에 걸쳐 연속적으로 부상 복구 프로세스를 연구하는 이점을 제공하지만, 이들에 맞 몇몇 모델이 있습니다 매개 변수를 설정합니다. 여기에 생리 상처 상피 조직의 반응을 재현 배양 치유 재현성 높은 생체 상피의 상처를 생성하는 절차를 설명한다. 조직 공급원, 생체 MOC으로 병아리 배아 렌즈 사용K 백내장 수술이 행해진 다. 렌즈는 무 혈관, 신경 지배, 및 관련 기질 (18,19)의 자유되지는 자체 포함 두꺼운 기저막 캡슐 내에 있기 때문에이 연구에 사용하는 이상적인 조직이다. 인간의 질환, 백내장 수술로 인해 렌즈의 혼탁으로 시력 상실을 해결하고, 렌즈의 대부분을 포함하는 렌즈 섬유 세포 덩어리의 제거를 포함한다. 다음은 백내장 수술의 비전은 인공 수정체의 삽입을 통해 복원됩니다. 백내장 수술 절차, 섬유 세포의 제거를 통해, 섬유 세포에 의해 점유되었던 렌즈 캡슐의 후방 영역의 재 상피화함으로써 응답 인접한 렌즈 상피의 상처 반응을 유도한다. 백내장 수술에서 가장 상처 복구 응답 같이 때때로 렌즈 후방 Capsu로 알려져 근육 섬유 모세포의 출현과 관련된 창상 치유 반응을 비정상적 섬유화 결과,이 발생제작 혼탁 20-22. 백내장 수술 상처 치유 모델을 생성하기 위해, 백내장 수술 절차는 생리 부상을 생성 병아리 배아로부터 제거 눈 렌즈에 모방한다. 렌즈 상피 세포에 의해 둘러싸인 매우 일관된 원형 상처 영역에서 렌즈 섬유 세포 결과 미세 수술 제거. 이 세포 집단 단단히 렌즈 기저막에 부착 된 캡슐 유지되며 외과 적 절차에 의해 부상한다. 상피 세포는 리더 셀 1로 복구 프로세스에 공지 멘틴 풍부한 간엽 세포 집단 이끄는 상처를 치유하는 내인성 기저막의 무 결함 영역으로 이동한다. 이 모델 부상 상피의 응답 쉽게 시각화 할 수 있고, 세포의 미세 환경의 콘텍스트에서 시간에 따라. 세포 발현 또는 상처 복구하는 역할을 할 것으로 기대 분자의 활성화의 변형에 용이하게 접근 할 수있다. 일의 강력한 기능모델 분리 및 상처 치유의 틀에서 마이그레이션 별 변화를 연구 할 수있는 기능입니다. 연구를 위해 세 유사한 생체 상처 치유 배양 다수를 준비하는 능력은이 모델의 다른 이점이다. 따라서,이 모델 시스템은 상처 치유 과정에 미치는 영향에 대한 상처 수리의 메커니즘과 테스트 치료제 떨어져 애타게 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 생체 모의 백내장 수술 모델은 손상 복구 메커니즘의 연구를위한 중요한 자원을 제공하는, 다양한 적용 가능성을 가질 것으로 기대된다.

<table><tbody><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td> TD 버퍼 염화칼륨(KCl)<td>에서 140mM에서 사용</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>TD 버퍼</td></tr> 인<tr><td>산나트륨(Na2HPO4)</td><td>Sigma</td><td>S0876</td> TD 버퍼 D-포도당(덱스트로오스<td>)에서 0.7mM에서 사용</td></tr><tr><td>Fisher Scientific</td> D<td>-포도당(덱스트로오스)</td>Fisher Scientific <td>D16-500</td><td>TD 버퍼 트리스 베이스에서 0.5mM에서 사용</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>TD 버퍼 염산에서 8.25mM에서 사용</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>TD 버퍼를 7.4로 pH 사용</td></tr><tr><td>Media 199</td><td>GIBCO</td><td>11150-059</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Corning/CellGro</td><td>25-005-CI</td><td>Media199</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Corning/에서 1%로 사용 CellGro</td><td>30-002-CI</td><td>Media199</td></tr><tr><td>100mm 페트리 접시</td>에서 1%로 사용 <td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711Z</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 필터 유닛</td><td>Millipore</td><td>SCGPU01RE</td><td>살균 여과에 사용</td></tr><tr><td>Dumont #5 겸자(2개 필요)</td> <td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>35mm 세포 배양 접시</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>27G 1ml SlipTip 포함 정밀 글라이드 바늘</td><td>BD</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>파인 가위</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>표준 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>91100-12</td><td></td></tr><tr><td>기타 필요한 항목: 일반 해부 기구,&nbsp; 비옥한 흰 다리뿔 닭 알, 체크 알 인큐베이터 (가습, 37.7&deg; C), 층류 후드, 쌍안 스테레오비전 해부 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

임상 적으로 구축<em&gt; 전의 vivo</em기본 미세 환경에서 상피 상처 복구 조사를위한&gt; 모의 백내장 수술 모델

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

상피 조직이 상처 복구를 수행하는 방법을 이해하는 데 가장 큰 장애물은 생체 내 상피 조직 손상과 밀접하게 모방된 환경에서 생체 외 상처 반응을 추적하고 조작할 수 있는 모델의 가용성이 제한되어 있다는 것입니다. 이 문제는 백내장 수술을 기반으로 임상적으로 관련된 상피 체외 손상 복구 모델을 만들어 해결되었습니다. 이 배양 모델에서는 상처에 대한 수정체 상피의 반응을 세포의 고유 미세환경에서 실시간으로 추적할 수 있으며, 상처 복구의 분자 매개체는 복구 과정에서 쉽게 조작할 수 있습니다. 배양을 준비하기 위해 눈에서 수정체를 제거하고 수정체 앞쪽을 작게 절개하여 수정체 섬유 세포의 내부 덩어리를 제거합니다. 이 절차는 수정체를 둘러싸고 있는 두꺼운 기저막인 수정체 후낭에 원형 상처를 만듭니다. 섬유 세포가 부착된 이 상처 부위는 수술 중에 수정체 캡슐에 연결된 상태로 남아 있는 수정체 상피 세포의 연속적인 단층 바로 옆에 위치합니다. 발달 과정에서 섬유 세포가 파생되는 세포 유형인 상처 입은 상피는 중간엽 전구세포가 수정체1에 내인성인 비멘틴이 풍부한 복구 세포 집단에 의해 상처 부위를 가로질러 집단적으로 이동함으로써 섬유 세포 제거의 손상에 반응합니다. 이러한 특성은 정상적인 상피 상처 치유 반응의 전형입니다. 이 모델에서는 생체 내에서와 마찬가지로 상처 복구는 이 생체 외 배양 시스템에서 고유하게 유지되는 내인성 환경에서 공급되는 신호에 의존하며, 이는 상처 후 상피의 복구를 조절하는 메커니즘을 발견할 수 있는 이상적인 기회를 제공합니다.

예 생체 내 모델은 세포의 기본 미세 환경에서 상처 치유 과정을 연구하기 위해 만들어 세포의 기본 미세 환경 내에서 상피의 상처 치유 조절에 관여하는 메커니즘을 조사하기 위해, 임상 적으로 생체 모의 백내장 수술 모델을 만들었습니다. 이 모델은 그의 고유 특성 때문에 많은 이점을 제공 렌즈 조직으로부터 생성된다 : 1) 렌즈 수정체 낭 불리는 두꺼운 기저막으로 둘러싸여 독립적 기관이다; 2)는 무 혈관성, 3)의 지배를하지 4) 관련 기질 무료입니다. 따라서, 검사 보수 프로세스가 적절한 렌즈 타고난 세포로 제한된다. 이 모델을 만들려면, 렌즈는 배아 (E) 하루 15 병아리 배아 (그림 1A)에서 제거됩니다. 작은 절개 렌즈 섬유 균체가 제거되는 전방 렌즈 캡슐과 연관된 렌즈 상피 세포에서 이루어진다하이드로 용출, 생리 학적으로 관련 상처 (그림 1A)를 생성하는 고전적인 백내장 절...

여기에 설명된 것은 본래의 미세환경 내에서 상피 조직의 손상 반응 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있는 임상적으로 관련된 생체 외 모의 백내장 수술 모델의 확립입니다.

임상 적으로 구축<em&gt; 전의 VIVO</em기본 미세 환경에서 상피 상처 복구 조사를위한&gt; 모의 백내장 수술 모델

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

이 절차의 전반적인 목적은 상처 치유 과정을 고유한 미세환경에서 관찰할 수 있는 임상적으로 유의미한 모델을 제작하는 것입니다. 이는 먼저 병아리 배아의 눈에서 수정체를 제거함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 수정체 전면에 작은 절개를 만드는 것입니다.그런 다음 렌즈 섬유 세포 덩어리를 수압으로 용출합니다. 다음으로, 전낭에 추가적인 절개를 가하여 상피가 포함된 렌즈 낭을 평평하게 폅니다. 마지막 단계로, 상처 치유 과정을 관찰하기 위해 손상된 배양물을 조직 배양 접시에 고정합니다.최종적으로, 타임랩스 현미경 관찰, 공초점 현미경 관찰 및 생화학적 분석을 통해 생체 내 환경을 밀접하게 재현한 모델에서 상처 치유 기전을 규명합니다. 이 방법은 세포들이 어떻게 협력하여 이동하며 상처를 폐쇄하는지와 같은 상처 치유 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 방법은 상처 치유 과정에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.이는 ABER 상처 치유, 특히 섬유화 및 흉터 연구에도 적용될 수 있습니다. 우선 멸균 라미나 플로우 후드에 100 millimeter 페트리 접시 3개를 놓습니다. 페트리 접시 중 2개에는 실온의 tris dextrose buffer를 절반 정도 채우고, 나머지 하나는 비운 상태로 둡니다.그런 다음 37.7 °C 인큐베이터에서 수정된 배아 15일 차 화이트 레그혼 병아리 알을 꺼내고, 껍질 외부를 70% ethanol로 닦아 멸균합니다. 이어서 알을 조심스럽게 깨뜨려 내용물을 빈 100 mm 페트리 접시에 담습니다. 표준 핀셋과 미세 가위를 사용하여 배아의 머리를 절단한 후, TST 덱스트로스 완충액이 담긴 접시 중 하나에 머리를 넣습니다.15분 이내에 병아리 배아의 머리를 페트리 접시 뚜껑 위로 옮깁니다. 고정밀 핀셋을 사용하여 안구의 후면을 집어 안구 뒷부분에 작은 구멍을 냅니다. 그런 다음 핀셋으로 유리체를 잡고 굴리는 동작으로 유리체를 부드럽게 잡아당깁니다.수정체가 붙은 유리체가 안구에서 떨어져 나옵니다. 수정체와 유리체를 Tex extras Buffer가 들어 있는 나머지 페트리 접시에 넣으십시오. 해부를 계속하기 전, 수정체를 버퍼 내에 30분 이상 두지 마십시오.다음으로, 정밀 핀셋을 사용하여 실체 현미경 하에서 수정체를 새로운 페트리 접시 뚜껑으로 옮기고, 수정체와 함께 떨어져 나온 모양체 세포들을 핀셋의 끝을 이용해 조심스럽게 털어냅니다. 그런 다음, 수정체 후낭과 연결된 유리체를 집어내어 수정체와 유리체를 분리합니다. 분리가 완료되면, 35 mm 조직 배양 접시에 담긴 200 µL의 tris dextrose 완충액 방울 속으로 수정체를 옮기고, 수정체의 전면이 위를 향하도록 배치합니다.수정체 상피의 내부와 적도 부위 사이의 경계를 나타내는 조직 내의 조밀한 고리를 통해 수정체 전면을 쉽게 식별할 수 있습니다. 두 개의 고정밀 핀셋을 사용하여, 양손에 핀셋을 하나씩 쥐고 조직을 잡은 뒤 서로 반대 방향으로 부드럽게 당겨 수정체 전낭 중심부에 약 850 microns 길이의 작은 절개를 만듭니다. 다음으로, 27.5 gauge 바늘 팁이 장착된 1 milliliter 주사기에 300 microliters의 TST dextrose buffer를 채웁니다.바늘 끝을 전낭의 절개창에 삽입하고 수정체의 중간 정도까지 밀어 넣습니다. 그런 다음 시린지를 천천히 눌러 TST dextrose buffer를 수정체 내로 주입합니다. 섬유 세포 덩어리.주변 상피와 수정체 낭으로부터 섬유 세포 덩어리를 분리하기 위해 50에서 200 µL의 완충액을 주입합니다. 300 µL 이상을 주입하지 마십시오. 고정밀 포셉을 사용하여 분리된 섬유 세포 덩어리를 전방 절개 부위를 통해 수정체에서 제거합니다.후낭의 부착 부위에서 섬유세포 덩어리를 제거하면, 손상된 상피로 둘러싸인 기저막에 매우 재현성 높은 상처 부위가 생성됩니다. 수정체 낭에서 시작하여, 수정체의 전면에서 적도 방향으로 다섯 번 절개합니다. 이렇게 생성된 상피가 부착된 다섯 개의 수정체 낭 플랩을 배양 접시에 낭 쪽이 아래로, 세포 쪽이 위로 향하게 하여 평평하게 폅니다.포셉으로 별 모양의 각 지점을 살짝 눌러 캡슐을 디쉬에 고정합니다. 이렇게 하면 x explan의 가장 바깥쪽 다섯 끝부분에 작은 함몰이 생겨 디쉬에 지속적으로 부착됩니다. 그런 다음 35 millimeter 디쉬에서 tris dextrose buffer를 제거하고 이를 1.5 milliliters의 예열된 M1 99로 교체합니다.L-glutamine과 페니실린-스트렙토마이신을 각각 1%씩 첨가한 배지를 사용합니다. 배양 접지의 뚜껑을 닫고 인큐베이터에 넣습니다. 배양 접지를 해부 현미경 아래에 두고, 상피 세포의 중앙 이동 구역과 원래의 부착 구역 사이의 경계선을 관찰합니다.그 다음, 두 개의 고정밀 핀셋을 사용하여 두 구역 사이의 경계선 양측 가장자리를 잡습니다. 경계선을 따라 원래의 부착 구역을 부드럽게 당겨 두 구역을 쉽게 분리합니다. 두 영역이 완전히 분리될 때까지 배양 전체 영역을 따라 계속해서 두 구역을 분리합니다.표준 분자 또는 생화학적 분석 기술을 사용하여 두 분획을 연구하십시오. 섬유 세포 덩어리를 제거한 직후, 중간엽 복구 세포가 풍부한 하위 집단이 활성화되어 상피의 상처 가장자리로 이동합니다. 이 세포들은 치유를 시작하기 위해 내인성 기저막 캡슐의 세포가 없는 영역인 중앙 이동 구역으로 빠르게 이동합니다.상처의 경우, 여기 설명된 기술은 현미경이나 비디오 카메라로 이 과정을 관찰하기 위해 이 모델 시스템을 완벽하게 준비합니다. 상처 치유는 배양 1일 차에 상처의 상당한 영역을 덮으며 빠르게 진행됩니다. 3일 차가 되면 일반적으로 중앙 이동 구역과 원래 부착 구역이 분리되면서 상처 치유 과정이 완료됩니다. 본 연구에서는 이러한 서로 다른 구역 간의 분자적 차이를 분석하였습니다.두 구역에서 focal adhesion kinase의 수치를 측정하였으며, 인산화된 focal adhesion kinase의 양은 이동 특이적 중심 이동 구역에서 증가한 것으로 나타났습니다. 일단 숙달되면, 이 모의 백내장 수술 기법은 적절히 수행될 경우 3분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 천연 미세환경에서의 상처 치유를 밀접하게 모방하는 모의 백내장 수술 모델을 만드는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

소 각막 내피 세포의 일차 배양 각막 내피 간엽 전이의 메커니즘을 조사 하였다. 또한, 래트 각막 내피 cryoinjury 모델 생체 내 각막 내피 간엽 전환을 증명 하였다.

생체 외 및 생체 내 모델에서 각막 내피 세포 - 중간 엽 전이를 공부하기

이 원고 방법 절 개 같은 병 변 배양된 상피 세포 monolayers에 편리 하 게 모델 치료 생체 외에서이미징 confocal 의해 상처 또는 레이저 스캔 현미경, 고는 높은 품질을 제공할 수 있습니다. 공부 셀 동작 및 마이그레이션에 관련 된 메커니즘에 대 한 양적 및 질적 데이터입니다.

현미경 기반 방법을 생체 외에서 상처 치유 중 상피 세포 이동의 평가 대 한

전직에 대 한 프로토콜 vivo 막 기관 문화 모델 부상 치료 연구는 설명 하는 유용한. 이 모델 시스템 재생 치유를 촉진 하는 에이전트 또는 조직된 3D 다세포 환경에서 약물 독성의 효과 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.

Ex Vivo 막 기관 문화 모델에 대 한 상처 치유 연구

여기에서, 우리는 네오디뮴을 사용하여 Descemet의 막 (DM)에서 각막 내피 세포 (CEC)를 분리하는 프로토콜을 제시합니다:YAG (Nd:YAG) 레이저는 bullous 각화증 (BK)를 위한 전 생체 내병 모형으로.

각막 내피 세포 손실의 비 침습적, 레이저 보조 실험 모델의 개발

여기서는 전형염색 접근법과 결합된 전 생체 내 인간의 피부를 사용하여 상처 수리를 평가하기 위한 최적화된 기술을 시연합니다. 이 방법론은 잠재적인 상처 치료의 평가를 위한 전임상 플랫폼을 제공합니다.

인간 Ex 생체 내 상처 모델 및 피부 수리를 정확하게 평가하기 위한 전산 염색 접근법

여기에서, 트레핀 및 무딘 골프 클럽 스푸드를 사용하여 마우스에 중앙 각막 상피 마모 상처를 만들기 위한 프로토콜이 설명된다. 이 각막 상처 치유 모델은 재현성이 높으며 현재 질병의 맥락에서 손상된 각막 상처 치유를 평가하는 데 사용되고 있습니다.

각막 상처 치유를 연구하기위한 상피 마모 모델

여기서는 각막 상피의 기계적 및 화학적 손상을 위해 마우스와 토끼를 기반으로 한 동물 모델을 개발하여 새로운 치료법과 기본 메커니즘을 스크리닝합니다.

각막 상피의 기계적 및 화학적 손상에 대한 Ex Vivo 및 In Vivo 동물 모델

본 프로토콜은 오보에서 배아 병아리의 각막을 상처 입히는 것과 관련된 다른 단계를 보여줍니다. 재생 또는 완전히 회복된 각막은 상처 절차에 따라 다양한 세포 및 분자 기술을 사용하여 재생 전위를 분석할 수 있습니다.

배아 상처 병아리 각막의 흉터없는 조직 재생 조사

이 기사에서는 공정을 단순화하고 자가 컨디셔닝 세럼(ACS) 준비 비용을 낮추는 프로토콜에 대해 설명합니다. 특별한 주사기 또는 표면 코팅 유리 구슬이 필요하지 않습니다. 더욱이, 변형된 ACS(mACS)는 생체 외에서 쥐 눈의 각막 상처 치유에 있어서 종래의 자가 혈청에 비해 경쟁 우위를 갖는다.

변형된 자가 조절 혈청의 생산 및 쥐 각막 상피에서의 치유 가능성에 대한 생체 외 평가

본 논문은 생체 내에서 고해상도로 상처 치유를 위해 살아있는 Clytia hemisphaerica medusa의 상피에 상처를 만드는 방법을 설명 한다. 또한, 상처 치유 동안 상피 세포 및 세포 외 기질의 신호 전달 과정을 교란시키기 위해 염료 및 약물을 도입하는 기술이 제시됩니다.

Cnidarian 모델 유기체 Clytia hemisphaerica를 사용한 생체 내 상피 상처 치유 특성화

이 방법은 성체 마우스에서 수정체 섬유 세포를 제거하고 수정체 상피 세포(LEC)가 부착된 수정체 주머니를 남겨 생체 내 백내장 수술을 모델링합니다. 그런 다음 부상 반응은 분자 및 형태학적 기준을 사용하여 수술 후 여러 번 평가됩니다.

생쥐의 백내장 수술 모델링

배우세요 닭 배아 안구에서 수정체를 제거하고 절개하여 수술 후 상피 조직의 손상 반응과 상처 치유 메커니즘을 실시간으로 관찰하는 임상 관련 ex vivo 백내장 모의 수술 모델을 구축하는 방법을.

임상 적으로 구축

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