Name: 클래스 1 Integrons 유전자 카세트 식품을 선별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 학습하세요 클래스 1 인테그론과 항생제 내성 유전자 카세트를 식품에서 검출하는 방법을. PCR과 DNA 시퀀싱을 활용하여 세균 종을 식별하고 유전자 특성을 분석합니다.

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미카엘라 홀, 라리사 스포 및 기술 지원에 대한 구스타보 타바레스에게 감사드립니다.

원시 먹거나 가볍게 조리 식품은 인간의 건강에 가장 관심사이다. 예를 들면 샐러드 야채, 과일, 어패류와 갑각류를 포함한다. 1. 샘플 컬렉션 <ol><li> 오염을 최소화 조건에서 샘플을 수집 및 전송시 별도의 청소 가방에 저장된다. 수집되면, 샘플은 4 ℃에서 보관하고 24 시간 이내에 처리해야한다. </li></ol> 2. 농축 문화 준비 <ol><li> 과일과 야채 : <ol><li> 튼튼한 비닐 봉지에 재료의 약 10g을 놓습니다. 큰 재료를 처리하는 경우, 청과물의 피부에 집중한다. 30 초 동안 패들 블렌더에 90 ml의 0.1 M 인산 나트륨 완충액, pH가 7.0 및 프로세스를 추가한다. 패들 믹서를 사용할 수없는 경우, 대안 적으로, 재료는 수동으로 교반 할 수있다. </li><li> 이 50 ㎖ 팔콘 튜브에 액체를 수집합니다. 펠렛 박테리아에 7 분 동안 4,000 XG에 원심 분리기 튜브. </lI&gt; <li> 조심스럽게 멸균 루리아 베르 타니 (LB) 배지 30 ml의 펠렛 박테리아를 뜨는을 제거하고 일시 중지합니다. </li><li> 37 ° C에서 다른 25 ° C에서 하나의 튜브를 잡고, 통 O / N에 품어. 문화는 분당 200 진동 (OPM)에서 동요한다. 4 ℃에서 보관 배양 될 때까지이 필요합니다. </li></ol></li><li> 해산물 : <ol><li> 멸균 된 핀셋 및 핀셋을 사용하여 위장 (굴) 또는 소화관 (새우)를 해부하고 0.1 M 인산 나트륨 완충액, pH가 7.0의 200 μl를 함유하는 멸균 된 1.5 ㎖의 튜브에 배치했다. 균질를 만들 수있는 샘플을 담가서 부드럽게. </li><li> 이 멸균을 5 ml 튜브에 LB 배지 5 mL를 분배하고, 해산물 균질 각각 접종. </li><li> 25 ° C와 다른 37 ° C에서 하나의 튜브를 들고, 셰이커 O / N에 품어. 문화는 200 OPM에서 동요한다. 4 ℃에서 보관 배양 될 때까지이 필요합니다. </li></ol></li></ol> Integrons 3. 선별 문화 2. 필요한 경우, 로렌스 (2011) (24)는이 저널의 이전 문제에 PCR 최적화 및 문제 해결 방법을 설명하고있다. <ol><li> 삶은 DNA 준비 : <ol><li> 멸균 0.5 ㎖의 PCR 튜브에 풍부한 문화의 100 μl를 분배. 수욕 또는 열차 단을 사용하여, 10 분간 99 ° C로 샘플을 가열한다. 2 분 동안 얼음에 진정을 스냅. </li><li> 5 분 14,000 XG에 마이크로 원심은 세포 파편 펠렛합니다. 얼음으로 돌아갑니다. DNA 샘플은 요구 될 때까지 -20 ℃에서 냉동 될 수 있지만, 얼음 위에서 해동되어야한다. </li></ol></li><li> PCR을 사용하여 클래스 1 integrons 선별 : 참고 : O / N 배양에서 혼합 문화가 HS463a / HS464 PCR 프로토콜 (표 1)를 사용하여 클래스 1 integrons 상영된다. <ol><li> 잠재적 SOU에서 멀리, 얼음에 모든 PCR 시약을 녹여DNA를 오염의 경우 RCEs. 음성 대조군 (표 2)를 포함하여, 샘플 당 48 μL의 PCR mastermix을 확인합니다. 배리어 팁을 사용하여, 각각의 튜브에 PCR 마스터 믹스의 48 μl를 분배. </li><li> 장벽 팁을 사용하여 개별 PCR 튜브에 해동 DNA의 2 μl를 추가합니다. PCR의 열 순환기에 적절한 프로그램을 실행합니다. </li><li> 증폭의 결과를 평가하기 붓고 TBE 완충액 (90 mM 트리스 - 보레이트, 2 mM의 EDTA)에서 실행되는 2 % 아가 로즈 겔상에서 PCR 생성물 7 μl를 electrophorese. 100 bp의 사다리 같은 분자량 마커를 포함한다. </li><li> 포스트 DNA 얼룩 겔을 염색하고, UV 트랜스 일루미네이터를 이용하여 시각화. 음성 대조군에서 더 증폭이 없었다 있는지 확인합니다. 특정 샘플에 대한 약 470 BP에 강한 밴드가 혼합 된 문화 클래스 1 integron을 가지고 박테리아가 포함되어 있음을 나타냅니다. 순수한 식민지 이제 긍정적 인 PCR을 반환 된 혼합 된 문화에서 고립 될 것이다. </li></ol></li></ol><ol><li> 직렬 희석 및 확산 판 : 주 : PCR 양성 혼합 배양 물로부터 단일 콜로니를 분리는, 혼합 배양 직렬 인산 나트륨 완충액에서 10 배 희석 한 후 단일 콜로니를 복구하기 위해 도금된다. <ol><li> 0.1M 인산 나트륨 완충액, pH가 7.0 9 ml의 혼합 문화의 한 ML을 추가하고 반전에 의해 혼합. 10-8의 일련의 희석 될 때까지 인산염 버퍼의 또 9 ml의 희석 1 mL를 넣어 반복하는 것은 도달한다. </li><li> 중복, LB 한천 상 10-4 -8 10 희석액 100 ㎕를 확산. 초기의 혼합 배양에 사용 된 동일 온도에서 플레이트 O / N을 부화. 플레이트는 그러나 그것은 매우 신속하게 단일 콜로니를 처리하는 것이 가장 좋습니다, 필요한 때까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 단일 콜로니 선택과 삶은 DNA 준비 : <ol><li> 자체 직렬 희석 판에서 하나의 식민지를 선택이러한 콜로니의 크기, 모양, 색 등의 기준을 사용하여 가능한 한 많은 다른 유형의 콜로니 lecting. 확산 판에서 하나의 식민지를 선택 멸균 이쑤시개를 사용합니다. </li><li> 식민지에 이쑤시개를 터치 한 다음 멸균 물 100 μl를 포함하는 PCR 튜브에 전송할 수 있습니다. 콜로니 다수가 상영되어야하는 경우, 콜로니에서 마이크로 타이 터 트레이를 제조 할 수있다. 물에 일부 셀을 제거하는 손가락 사이 이쑤시개 스핀. </li><li> 동일한 이쑤시개를 이용하여 콜로니의 연속로 LB 플레이트에 접종. 각 연속 약 1cm 길면 큰 콜로니 번호 표지 플레이트 상에 저장 될 수있다. 당신이 분리의 적절한 수를 선택할 때까지 3 단계 1을 반복합니다. </li><li> 초기의 농축 된 배양에 사용 된 것과 동일 온도에서, LB 플레이트 O / N을 부화. 필요한까지 배양 후 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 세균 현탁액에서 DNA를 제조, OU 등의 단계를 따릅니다3.1 절에 tlined. 3.2 절에 설명 된대로 순수 배양 용 해물의 심사를 들어, HS463a / HS464 PCR을 수행합니다. 즉 양성 PCR은 게놈 DNA (5 장)의 제조에 사용하고, 또한 분석을 위해 복귀한다 분리합니다. </li></ol></li></ol> 구슬이 25 잔 사용 (5)의 게놈 DNA를 추출 Integron 양성 단일 콜로니 <ol><li> 4.2 절에 고립 된 순수 문화의 샘플 LB 배지 5 mL를 접종한다. 초기 농축 배양에 사용 된 동일한 온도에서 떨고, O / N을 품어. </li><li> 펠렛 세포는 7 분 동안 4,000 XG에서, 다음 상층 액을 제거합니다. 용균 매트릭스 E 빨리 준비 튜브에서 1 mL의 CLS-TC 용액 중에 펠렛 세포를 재현 탁. 비드 박동 기계를 사용하여, 30 초 동안 5.5 m / sec의 샘플을 처리합니다. </li><li> 원심 분리기 5 분 14,000 XG에 튜브 및 멸균 1.5 ML 튜브에 뜨는 70​​0 μl를 복구 할 수 있습니다. </li><li> 6 M의 구안과 5 : 1로 희석 결합 매트릭스의 700 μl를 추가idinium 티오 시아 네이트는 5 분 동안 실온에서 혼합한다. 1 분, 폐기 뜨는 14,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 펠렛을 완전히 재현 탁 될 때까지 800 ㎕의 염수 세척 에탄올 (70 % 에탄올, 0.1 M 아세트산 나트륨) 및 소용돌이를 추가한다. 1 분 동안 14,000 XG에 실온에서 5 분, 원심 분리기에 대한 세척하고 상층 액을 버린다. 다음 5 분 동안 공기 건조하도록 허용 필요한 경우 마이크로 피펫을 사용하여, 모든 상층 액이 제거 된 확인합니다. </li><li> 로 pipetting 아래 200 ㎕의 TE (10 mM 트리스 - 염산, 1mM의 EDTA, pH를 7.6)의 펠렛 행렬을 재현 탁. 3 분 동안 실온에서 품어. 3 분 및 멸균 튜브에 전송 용출 된 DNA의 160 μl를 14,000 XG에 원심 분리기. DNA 추출 수율 및 무결성을 확인하는 2 % w / v를 아가 로스 겔에서 게놈 DNA 추출의 분취 량을 실행. 정제 된 게놈 DNA는 -20 ° C에서 저장 및 PCR 시험을 위해 필요할 때 얼음에 해동된다. </li></ol> 6. 진단의 PCR 및 DNA 시퀀싱 참고 :섹션 5에서 제조 게놈 DNA는 모든 진단의 PCR에 사용되며, 클래스 1 integrons에 대한 양성 반응을 확인합니다. <ol><li> 간단히 20 초 동안 14,000 XG에서 DNA 샘플 및 펄스 스핀 와동, 얼음에 게놈 DNA를 녹여. 분리가 471 bp의 증폭 물 (3.2 절)에 대한 긍정적 인 것을 확인한 HS463a / HS464 (표 1)를 사용하여 클래스 1 integron - 인테그라 유전자에 대한 PCR을 반복합니다. </li><li> 종 양성 문화 수준의 식별 작은 소단위 rRNA 유전자 (16S rDNA 염기)를 분석함으로써 달성된다. 프라이머 F27 / r1492 (표 1)를 사용하여 유전자를 증폭 16S. 전기를 사용하여 PCR 제품을 확인합니다. 모든 박테리아 타겟은 약 1,450 BP의 16S 증폭 물을 생성한다. </li><li> 시퀀스 16S rRNA 유전자 증폭 물은 종의 신분을 확인하는,하지만 같은 종의 박테리아 수 있습니다 단계 6.2에서 여러 긍정적 인 PCR들을 될 가능성, 이러한 긍정적 많은 있기 때문에, 우리는 먼저저기서 다른 종을 구별한다16S PCR 생성물 g 제한 소화. <ol><li> 제한 효소 Hinf 1 16S PCR의 분취 다이제스트. 상관 4 BP 절단 부위는 인식 할 것이다 효소하지만 Hinf 1 16S 타겟으로부터 양호한 다이버 시티를 생성하고, 신뢰성, 저렴 효소이다. </li></ol></li><li> 30 μL 제한은 멸균 튜브에 mastermix (표 2) 소화되지 않은 purfied 16S PCR 산물 20 μL를 추가 설정합니다. 37 ° C의 물을 욕조의 O / N에 품어. 2 % 아가 로스 겔에 다이제스트를 확인합니다. </li><li> Hinf 일 소화에 의해 생성 된 패턴 점수. 동일한 16S 제한 프로파일과 균주 같은 종 될 가능성이 높다. 오히려 각 Hinf 1 제한 패턴의 가장 세 대표에 모든 16S PCR 제품, 순서를 시퀀싱보다. </li><li> 상업용 키트를 사용하여 PCR (16S)의 제품을 정제. 단일 가닥 엑소 뉴 클레아 키트를 사용할 수 있지만, 열 기반 또는 석출 방법도 uninc 제거 잘 작동orporated 프라이머 및 단일 가닥 DNA를. 서열 프라이머 R910 (표 1)를 이용하여 시퀀싱 기능에 의해 지정된대로 반응을 설정 16S 증폭. </li><li> BLASTN 기능 (함께 NCBI의 DNA 데이터베이스를 심문 얻어진 DNA 서열을 사용 <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). 보다 큰 97 %의 염기 ID는 보통 종의 신분으로한다. </li></ol> 7. 매핑 및 Integrons 및 카세트 배열의 특성 참고 : 인간이 지배하는 생태계에서 나오는 1 급 integrons은 모든 시료에서 가장 흔한 integrons 될 가능성이 있습니다. 이러한 integrons 모든 최근 단일 기점을 가지며, 따라서 고도로 보존 된 DNA 서열 (5)를 갖는다. <ol><li> 클래스 사이에 한 사람의 소스에서 나오는 integrons과를 수행하여 환경 시료에서 자연적으로 발생하는 것과 차별화프라이머와 PCR을 intI1F165 / intI1R476 10 (표 1)을 설정합니다. 참고 : 환경 클래스 1 integrons이 제품을 생성하지 않습니다 동안 임상 또는 공생 박테리아에서 1 등급 integrons는 ~ 300 bp의 제품을 생성합니다. </li><li> 프라이머 세트 HS458 / HS459와 카세트 배열을 증폭하여 임상 integrons을 특성화. 이 PCR은 가장 카세트 배열 intI1 말단과 3 &#39;보존 된 세그먼트 사이의 영역을 증폭한다. 카세트의 번호 및 ID가 가변이기 때문에, PCR 산물의 크기도 달라진다. </li><li> 증폭 산물을 정제하고 증폭 프라이머를 이용하여 각 DNA 시퀀싱. BLASTN 기능 (사용의 DNA 데이터베이스 심문 시퀀스를 사용 <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi을</a> ). </li><li> integron 유전자 카세트에 대한 많은 데이터 침착하기 때문에, 표준화 된 명칭 (9)에 따라 카세트의 이름을 확인합니다S는 일관성이 없거나 모호한 이름을 사용합니다. 이러한 전달률, 병원성 또는 독성 8,21 증가하는 유전자를 포함, 새로운 표현형을 인코딩 할 수 있기 때문에, 새로운 유전자 카세트에 특히주의를주십시오. 참고 : 클래스 1 integron의 전임상 형태는 여전히 자연 환경에 순환. 특히, 활성 테네시 (402) 트랜스포존에 링크 된 것을 가장 관심 (26)의이다. 이러한 integrons의 카세트 배열 프라이머 세트 HS458 / HS459으로 증폭되지 않지만 카세트 콘텐츠에 종속 변수 크기의 증폭 물을 생성 MRG284 / MRG285 프라이머 세트 (표 1)로 증폭 될 수있다. PCR 제품은 정제 및 7.2에 설명 된대로 DNA는 염기 서열을해야합니다. </li></ol>

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<li>Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+in+the+environment%3A+A+link+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opinion+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic.</a> Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).</li>
<li>Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+1+integrons+predating+the+association+with+Tn402.-like+transposition+genes+are+present+in+a+sediment+microbial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community.</a> Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).</li>
<li>Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+DJ+%22Nucleic+Acid+Techniques+in+Bacterial+Systematics%22">Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics</a>. , John Wiley &Sons, Inc. 115-175 (1991).</li>
<li>Holmes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+activity+of+a+distinctive+integron-gene+cassette+system+associated+with+stutzeri.+populations+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil.</a> Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).</li>
</ol>

저자는 공개 관련 아무것도 없다.

integrons과 연관된 유전자 카세트의 식별은 잠재적으로 새로운 기회 병원체의 출현을 예측 인간 먹이 사슬에 병원체에 대한 경로를 추적 및 식별하는 새로운 저항에 중요한 단계이며 독성이 8,21,26를 결정. 이 논문의 목적은, 클래스 1 integrons에 대한 샘플을 선별 자신의 카세트 배열을 특성화하고 상주하는 세균의 종을 식별하기위한 효율적인 방법을 설명했다. 프로토콜의 중요한 단계는 좋은 미생물 연습을 포함하고, PCR 오염을 방지하는 오탐 (false positive)을 생성 할 것이라고. 여기에 설명 된 프로토콜을 용이하게 또한 인간 병원체에서 발견되는 클래스 2 및 클래스 3 integrons 포함한 다른 임상 적 integrons을 검출하도록 변경 될 수있다. 또한 물, 바이오 필름, 토양, 퇴적물에서 미생물 군집에 integrons을 감지 수정할 수 있습니다. 일부 limitatio이 있습니다박테리아 세포의 배양에 의존에서 발생이 기술...

항생제의 발견은 20 세기의 가장 위대한 과학적 업적 중 하나였다. 그러나, 항생제의 사용 및 남용 항생제 내성균의 급속한 발전을 주도하고 있으며, 이들은 지금 21 세기 공중 보건에 심각한 위협. 대부분의 치료 옵션에 대한 내성 균주의 증가는 우리가 항균 약물이 더 이상 1,2 효과적 시대를 입력 할 수있는 가능성을 제기한다. 항생제 내성을 부여 유전 기계 년 3 수백만의 인간과 항생제 선택 압력을 낳은, 고대 시스템입니다. 이러한 플라스미드, 트랜스포존, 게놈 섬, 통합 공역 요소와 integrons 모바일 유전 적 요소, 내 세균 종 4 사이에 모두 항생제 내성 유전자 (ARG)를 배포 할 수 있습니다. 이들 중에서는 integrons 불구 ARG의 확산에 중요한 역할을 해왔다그들은 박테리아 게놈 5에 플라스미드 및 동원 및 삽입 트랜스포존에 의존한다는 사실. Integrons는 integron-인테그라를 이용한 유전자 카세트를 캡처하고 인코딩 integron -6,7- 프로모터 (도 1)를 이용하여 카세트를 표현한다. 유전자 Integron 카세트는 누구의 제품 항생제 나 소독제 (8)에 대한 내성을 부여 할 수 있습니다 단일 오픈 리딩 프레임 (ORF)로 구성된 소형 모바일 요소입니다. 클래스 1 integrons은 가장 일반적으로 그들이 집단적으로 (130) 다른 항생제 내성 유전자 카세트 (9)을 통해 획득 한 임상 분리 5에서 회복 integrons 있습니다. 인간 관련된 공생과 병원성 세균에 클래스 1 integrons의 확산은 이러한 유전 적 요소 (10)의 큰 숫자를 포함하는 인간의 폐기물을 생성합니다. 클래스 1 integrons를 포함 약 10 (19) 박테리아는 하수 슬러지 매년 전을 통해 출시n은 영국 (11). 그것은 항생제 저항을 부여 클래스 1 integrons 지금은 야생 조류, 물고기, 그리고 다른 나라의 야생 동물 12-14의 미생물 검출되고 있다는 것을 따라서 놀라운 일이 아니다. 새로운 유전자 카세트 및 기타 모바일 요소와 복잡한 재 배열의 인수는 특히 하수 처리장 및 기타 수역 15-18에서 계속 발생 이후 다시 환경으로 integrons을 떼면, 중요한 공중 보건 위협. 자연 환경은 새로운 저항의 결정 요인과 기회 병원균 (19, 20)를위한 비옥 한 모집 땅이된다. 소설 integron 함유 세균과 새로운 인수는 오염 된 물과 음식 (21, 22)을 통해 인간 사회에 다시 동그라미를 할 수 있습니다. 환경 감시 인수의 이해와 미래 23 항생제 내성을 관리하는 키 전략이다. 특히,주의 원 먹거나되는 식품에 지불해야한다이러한 새로운 모바일 요소와 병원체의 전송을위한 가장 큰 위협이 있기 때문에 가볍게 요리. 이 프로토콜, 1 integrons 및 식품에 연관된 유전자 카세트, 탐지 식별하고 클래스의 특성에 대한 효율적인 접근 방법 (그림 2) 설명되어 있습니다. 배양 및 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)의 조합을 사용하여, 신속 integrons 복잡한 세균 공동체 및 개별 분리 물에서 검출 될 수있다. 박테리아와 integron 관련 유전자 카세트의 형태와 정체성의 종류를 식별하기위한 방법이 제공됩니다. 방법은 식물과 동물 식품 광범위한 적합하고, 통상적 인 작업 흐름의 예는 이들 식품 유형마다 주어진다.

<table><tbody><tr><td>GoTaq 무색 Mastermix</td><td>Promega</td><td>M7132</td><td>모든 PCR에 사용</td></tr><tr><td>RNAse (소 췌장에서 추출한 리보뉴클레아제 A)</td><td>Sigma</td><td>R6513-10MG</td><td>모든 PCR에 사용</td></tr><tr><td>HinFI 제한 효소</td><td>Promega</td><td>R6201</td><td>16S rDNA PCR poducts를 소화하는 데 사용됩니다. 효소는 최적의 완충액과 BSA</td></tr><tr><td>100 bp 사다리</td>와 함께 제공됩니다 <td>GE Healthcare</td><td>27400701</td><td>모든 아가로 스 젤의 크기 표준으로 사용됩니다</td></tr><tr><td>GelRed DNA 염색</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>주의 : 이 물질을 취급 할 때는 개인 보호구를 착용해야합니다</td></tr><tr><td>Guanidinium thiocyanate</td><td>Life Technologies</td><td>AM9422</td><td>주의 :이 물질을 취급 할 때는 개인 보호구를 착용해야합니다</td></tr><tr><td>CLS-TC 솔루션</td>: <td>MP Biomedicals</td><td>6540409</td><td>게놈 DNA 추출 시작 부분에 사용되는 재현탁 솔루션</td></tr>, <tr><td>Lysing Matrix E, FastPrep 튜브</td>, <td>MP Biomedicals</td>, <td>116914500</td><td>Tube, 박테리아 세포벽의 기계적 파괴에 필요. 이 코드는 500개의 튜브 팩에 사용되며 더 적은 수량을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>결합 매트릭스</td><td>MP Biomedicals</td><td>116540408</td><td>6M 구아니디늄 티오시아네이트로 1:5로 희석하여 게놈 DNA 추출 방법에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>패스트 프렙 기계</td><td>MP Biomedicals</td><td>사용 가능한 옵션 수</td><td>MP Biomedicals에는 여러 FastPrep 기계를 구입할 수 있습니다. 자세한 내용은 <a href="http://www.mpbio.com" target="_blank">http://www.mpbio.com</a>를 참조하십시오</td></tr></tbody></table>.

클래스 1 integrons 유전자 카세트 식품을 선별

Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

항생제 내성은 21세기의 건강을 위협하는 가장 큰 요인 중 하나입니다. 측면 유전자 전달을 통한 내성 유전자의 획득은 다양한 내성 기전을 확산시키는 주요 요인입니다. 측면 전달을 촉진하는 DNA 요소 중 1등급 인테그론은 그람 음성 병원체에 항생제 내성 결정 요인을 퍼뜨리는 데 크게 기여했습니다. 이러한 인테그론은 총 130개 이상의 다양한 항생제 내성 유전자를 획득하고 전파했습니다. 지속적인 항생제 사용으로 1등급 인테그론은 인간과 가축화된 동물의 공생체와 병원체에서 유비쿼터스가 되었습니다. 그 결과, 그들은 이제 모든 인간 배설물에서 발견될 수 있으며, 그곳에서 그들은 계속해서 새로운 유전자를 획득하고 먹이 사슬을 통해 인간에게 다시 순환할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이 프로토콜은 배양 및 PCR을 사용하여 식품에서 클래스 1 인테그론 및 관련 저항성 유전자 카세트를 검출하기 위한 간소화된 접근 방식을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여 연구자는 다음을 수행할 수 있어야 합니다.농축 배양을 만들고 클래스 1 인테그론을 스크리닝하기 위해 샘플을 수집 및 준비합니다. integron 양성 분리물을 식별하기 위해 단일 박테리아 군집을 격리합니다. Class 1 Integron을 포함하는 박테리아 종을 식별합니다. 이러한 인테그론 및 관련 유전자 카세트를 특성화합니다.

혼합 문화와 intI1에 대한 박테리아 균주의 선별 프라이머 세트 HS463a / HS464 PCR은 클래스 1 integron-인테그라 유전자 intI1 (도 1)의 존재를 검출하는데 사용될 수있다. 이 프라이머 세트는 혼합 된 문화에서 intI1을 검출 잘 작동하고, 또한 확산 판 (그림 2)에서 수확 박테리아 콜로니를 선별하는 데 사용됩니다. 긍정적 인 균주는이 프라이머 세트 (그림 3A)를 사용하여 471 BP에 하나의 강한 밴드를 생성해야합니다. 긍정적 인 균주의 대부분은 인간 또는 농업과 가축에서 유래했다 intI1을 수행한다. 이 균주는 311 bp의 증폭 물 (그림 1)를 생성한다 PCR을 이용하여 프라이머 F165 / R476, 긍정적 인 것입니다. intI1의 환경 소스는 일반적으...

이 프로토콜은 식품에서 클래스 1 인테그론 및 관련 유전자 카세트의 검출을 설명합니다.

클래스 1 Integrons 유전자 카세트 식품을 선별

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

이 절차의 전반적인 목표는 식품에서 1형 통합 인테그론(class one inter grounds)과 그와 관련된 유전자 카세트를 검출하기 위한 효율적인 접근 방식을 제공하는 것입니다. 이는 먼저 선택한 식품 항목으로부터 농축된 박테리아 배양물을 만드는 것으로 수행됩니다. 두 번째 단계는 PCR을 사용하여 배양물 내 1형 인테그론의 존재 여부를 스크리닝하고, 인테그론 양성 혼합 배양물에서 단일 콜로니를 분리하는 것입니다.단일 콜로니에서 인테그론의 존재 여부를 스크리닝한 후, 박테리아 종을 구분하고 유전자 카세트의 존재를 검출하기 위한 진단 PCR을 위해 단일 콜로니로부터 게놈 DNA를 준비합니다. 마지막 단계는 PCR 산물을 정제하여 DNA 서열 분석을 위해 제출하는 것입니다. 최종적으로 DNA 서열 분석을 통해 클래스 1 인테그론 내의 유전자 카세트를 특성화하고 해당 카세트가 존재하는 종을 식별합니다.항생제 내성은 21세기 의료 치료가 직면한 주요 문제 중 하나입니다. 항생제 내성을 관리하는 방법의 하나는 인간에서 환경으로, 그리고 다시 환경에서 인간으로 이어지는 항생제 내성 유전자를 환경 내에서 검출하고 추적하는 것입니다. 본 프로토콜에서는 항생제 내성을 검출하는 방법을 설명합니다.생으로 또는 최소한의 가공으로 섭취할 수 있는 식품 내의 유전자들입니다. 본 절차는 제 실험실의 박사후 연구원인 Leet Waldron이 시연할 예정입니다. 과일, 채소, 패류와 같이 생으로 또는 가볍게 익혀 먹는 식품들이 인체 건강에 가장 큰 우려가 됩니다.여기서는 해산물로부터의 농축 배양액 준비 방법만 시연합니다. 과일 및 채소로부터의 배양액 준비 방법은 프로토콜 본문을 참조하십시오. 해산물로부터 농축 배양액을 준비하려면, 먼저 멸균 핀셋과 포셉을 사용하여 새우의 소화관을 분리합니다.분리한 시료를 200 µL의 인산나트륨 완충액이 들어 있는 멸균된 1.5 mL 튜브에 넣습니다. 페스틀을 사용하여 시료를 마쇄하여 균질물을 만들고 볼텍싱합니다. 두 개의 멸균된 5 mL 튜브에 LB 배지 5 mL를 각각 짧게 분주한 후, 각 튜브에 해산물 균질물을 접종합니다.두 튜브를 200 OPM에서 하룻밤 동안 흔들어 섞으며, 한 튜브는 25 °C에서, 다른 튜브는 37 °C에서 배양합니다. 다음 날, PCR 양성 혼합 배양액에서 단일 콜로니를 회수할 때까지 배양물을 4 °C에 보관하십시오. 먼저, 혼합 배양액 1 mL를 9 mL의 인산나트륨 완충액에 넣고 볼텍싱하여 섞음으로써 배양액을 인산나트륨 완충액으로 10배 연속 희석합니다.희석액 1 mL를 추가로 9 mL의 인산나트륨 완충액에 넣고 10⁻⁸ 희석배수에 도달할 때까지 연속 희석을 반복합니다. 10⁻⁴에서 10⁻⁸까지 희석된 배양액 100 µL를 LB 한천 배지에 도말합니다. 이를 이중으로 수행하여, 다음 날까지 초기 혼합 배양에 사용했던 것과 동일한 온도에서 플레이트를 하룻밤 동안 배양합니다.연쇄 희석 플레이트에서 단일 콜로니를 선택할 수 있습니다. DNA 준비를 위해, 시작 전 모든 플레이트와 샘플 튜브에 라벨이 명확하게 부착되어 있는지 확인하십시오. 멸균된 이쑤시개로 단일 콜로니를 살짝 건드린 후, 100 µL의 멸균수가 들어 있는 PCR 튜브로 옮깁니다.이쑤시개를 손가락 사이에서 회전시켜 세포 일부를 물속으로 떨어뜨린 후, 동일한 이쑤시개를 사용하여 선택한 각 콜로니를 LB 플레이트에 스트리킹하여 접종합니다. 다수의 콜로니는 라벨이 부착된 플레이트에 보관할 수 있습니다. 각 스트리크의 길이가 약 1cm 정도 되면, 샘플 간의 오염을 줄이기 위해 즉시 뚜껑을 닫습니다.군락의 크기, 모양, 색상과 같은 기준을 사용하여 가능한 한 다양한 유형의 군락을 선택하십시오. LB 플레이트를 초기 증식 배양에 사용한 것과 동일한 온도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 이후 박테리아 현탁액으로부터 DNA를 준비해야 할 때까지 배양물을 4°C에서 보관할 수 있습니다.써모사이클러를 사용하여 샘플을 99 °C에서 10분 동안 가열한 후, 상온에서 14,000 ×g로 5분 동안 마이크로 원심분리하여 세포 잔해를 펠렛화하고 얼음에 보관하십시오. 이어서 프라이머 HS 4 63 A 및 HS 4 64를 이용한 PCR로 DNA를 스크리닝합니다. 프로토콜 본문에 설명된 절차에 따라, 증폭 결과를 전기영동으로 평가하기 위해 PCR을 수행할 때 DNA 오염 가능성이 있는 모든 요인을 방지하는 것이 중요합니다.DNA 염색약으로 젤을 후염색한 후, TBE 버퍼에서 제작 및 전기영동한 2% 아가로스 젤에 각 PCR 산물 7 µL를 로딩합니다. UV 트랜스일루미네이터를 사용하여 DNA를 시각화합니다. 1급 인테그론을 보유한 분리주는 471 bp에서 강한 단일 밴드를 생성합니다. PCR 양성 반응을 보인 분리주에서 준비한 게놈 DNA를 이 분석에 사용합니다. 게놈 DNA를 얼음 위에서 해동하고, 짧게 볼텍싱한 후 14,000 ×g에서 20초 동안 펄스 스핀합니다.진단 PCR에 사용된 프라이머 서열 및 PCR 조건은 원고의 표 1에 나와 있습니다. 먼저, 분리주가 471 bp 앰플리콘에 대해 양성인지 확인하기 위해 class 1 integrase 유전자에 대한 PCR을 반복합니다. 다음으로, 소단위 리보솜 RNA 유전자인 16S rDNA를 증폭하여 양성 배양균을 종 수준까지 식별합니다.많은 양성 배양물이 동일할 것이므로, 모든 세균 표적은 약 1,450 base pairs의 16 S 증폭 산물을 생성해야 합니다. 세균 종의 경우, 16 SPCR 산물의 제한 효소 절단을 통해 서로 다른 종을 구분합니다. 16 s 표적으로부터 우수한 다양성을 생성하며 신뢰할 수 있고 저렴한 제한 효소인 HIF one을 권장합니다.멸균 튜브에 30 µL의 제한효소 절단 마스터 믹스를 준비하고, 정제되지 않은 16S PCR 산물 20 µL를 첨가합니다. 37 °C 항온수조에서 하룻밤 동안 배양한 후, 다음 날 2% agarose 겔에서 절단 여부를 확인합니다. 선택된 16S PCR 산물은 상용 키트를 사용하여 정제한 뒤 DNA 서열 분석 기관으로 보내 서열 분석을 진행합니다. 얻어진 DNA 서열을 Blast N 기능을 통해 NCBI DNA 데이터베이스에서 검색하며, 일반적으로 뉴클레오타이드 일치도가 97% 이상인 경우 동일 종으로 간주합니다.혼합 배양된 항균 분리주의 1급 인테그라제 유전자 존재 여부를 PCR로 스크리닝합니다. HS 4 63 A 및 HS 4 64 프라이머를 사용했을 때, 양성 콜로니는 471 base pairs에서 강한 단일 밴드를 형성합니다. 순수 분리주에서 추출한 게놈 DNA를 사용하여 인터 카세트 어레이를 특성화하며, HS 4 58 및 HS 4 59 프라이머를 사용하여 TN 4 0 2 인테그론으로부터 카세트 어레이를 증폭하면 어레이 내 구성 카세트의 정체와 크기에 따라 다양한 크기의 산물이 생성됩니다.이러한 카세트를 식별하려면 DNA 시퀀싱이 필요합니다. 환경 1급 인테그론은 흔히 세균 염색체에 내장되어 있습니다. 이들의 카세트 배열은 각각 근위 및 원위 재조합 부위를 표적으로 하는 프라이머 MG 2 84 및 MG 2 85를 사용하여 증폭될 수 있습니다. 이 PCR은 또한 배열 내 구성 카세트의 정체와 크기에 따라 가변적인 생성물 크기를 나타냅니다.하지만 환경 어레이의 카세트는 항생제 내성을 인코딩할 가능성이 낮습니다. 박테리아 종은 16 S-R-D-N-A를 증폭하고 PCR 산물을 제한효소 절단으로 스크리닝하여 식별합니다. HIF를 통해 개별 종은 독특한 패턴을 생성하므로, 동일 종의 분리균주를 쉽게 식별하고 DNA 시퀀싱으로 확인할 수 있습니다.이 영상을 시청하신 후, 여러분은 일상 식품에서 1급 인테그론(Class one integrons)과 그 항생제 내성 카세트를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다.

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Research

연구

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미리 만든 수용체의 직전 되나 상륙 패드 종자에 관심있는 외국의 DNA를 통합하는 신속하고 효율적인 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 ΦC31 integrase의 활용과 표현을 통해 주어진 변형율의 공학 상륙 패드 현장에 DNA 카세트의 특정 사이트 통합을 허용합니다.

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박테리아는 그들의 이웃들 미생물의 생리학에 영향을 미칠 가능성이 분비되는 화합물을 생성. 여기에서 우리는 고체 미디어의 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)의 형광 전사 기자 균주와 토양 미생물을 혼합하여 화학적으로 매개 종간의 상호 작용을 검출 할 수있는 공 배양 화면을 설명합니다.

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살 모 넬 라 종 /Shigella 종 설사에 기인 하는 일반적인 병원 체. 여기, 우리는 살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼을설명/Shigella 종 실시간 PCR를 사용 하 여 결합 가이드 문화.

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여기 선물이 다른 대장균 변종에 삭제 돌연변이 만들기 위한 기반으로 기존의 항생제 저항-카세트 삭제 구문을 사용 하는 프로토콜. 이러한 삭제 돌연변이 동원 고 P1 살 균 소 변환을 사용 하 여 받는 사람 긴장의 해당 장소에 삽입 될 수 있습니다.

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