전자 분광 이미징과 결합 miniSOG 태그 DNA 복구 단백질의 시각화 (ESI)

다음 실험의 전반적인 목표는 나노 규모에서 DNA 이중 가닥 절단 부위 주변의 DNA 복구 단백질 분포를 매핑하는 것입니다. 이는 전자 분광 이미징을 사용하여 복구 과정에 있는 손상된 염색질의 초미세 구조를 연구하기 위함입니다. 이를 위해 형광 단백질과 mini SOG 태그를 사용하여 DNA 손상 응답 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 DNA 발현 구조체를 생성합니다.

두 번째 단계로, transfection을 통해 컨스트럭트를 세포 내로 도입한 후 레이저 또는 감마선을 조사하여 세포에 손상을 줍니다. 그다음, 조사 및 고정된 세포를 전자현미경 시료 준비 단계에 따라 처리하여 mini SOG가 태깅된 복구 단백질의 분포가 전자현미경에서 관찰되도록 합니다. 이를 통해 얻은 전자 분광 이미징(electron spectroscopic imaging)은 크로마틴의 초미세 구조와 특정 단백질 및 DNA 복구 초점(repair foci) 간의 관계를 분석할 수 있는 상세한 이미지를 제공합니다.

ImmunoGold 라벨링과 같은 기존의 다른 기술과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 항체 접근성에 의존하지 않으며, 관심 구조를 매우 조밀하게 라벨링한다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 광산화가 pH, 빛의 세기 및 산소 포화도에 매우 민감하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 광산화, 산소 포화도 및 조명 단계가 매우 작은 변화에도 민감하므로, 이 방법을 재현하기 위해서는 방법이 어떻게 수행되는지 시각적으로 보여주는 것이 매우 중요합니다.

제 연구실의 박사후 연구원인 Hilmar Fadden 박사가 배양 방법을 시연할 것입니다. 첨부된 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 mini SOG 및 M cherry 태그가 붙은 복구 단백질을 안정적으로 발현하는 인간 골육종 세포를 사용하십시오. 10 cm 디쉬에서 세포를 분할한 후, 세포 밀도가 80%가 될 때까지 배양하십시오.

다음으로, 세포를 형광 현미경 아래에 두고 멸균된 다이아몬드 펜을 사용하여 이소성 단백질이 발현되어 표시된 세포들이 포함된 약 1mm²의 작은 영역을 표시합니다. 그다음 용액에 herx를 첨가하여 최종 농도가 0.5µg/mL가 되도록 세포를 감작시킨 후, 37°C 인큐베이터에서 20분 동안 배양합니다. 이후 공초점 현미경의 405nm 고체 레이저를 사용하여 세포에 레이저 미세 조사를 실시함으로써 DNA 손상을 유도합니다. DNA 손상 유도 후, 암조건에서 실온의 0.1M sodium cate buffer 내 4% paraform aldehyde 1mL를 사용하여 30분 동안 세포를 고정합니다.

pH 7.4의 0.1 molar sodium Cate 완충액 4 mL로 세포를 두 번 세척합니다. 다음으로, 고정된 세포를 50 millimolar glycine, 5 millimolar amino triazole 및 10 millimolar potassium cyanide가 포함된 pH 7.4 용액 2 mL로 30분 동안 처리합니다. 완충액을 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 준비한 pH 7.4의 광산화 완충액 2 mL로 교체합니다.

그런 다음 용액에 산소를 버블링하여 산소 포화 상태를 유지하면서, 샘플을 얼음 위 암소에서 배양하십시오. 다음으로, 고정된 세포가 담긴 디쉬를 40 x 오일 침강 렌즈가 장착된 도립 형광 현미경에 조심스럽게 거치하고, 앞서 표시해 둔 관심 영역으로 이동하십시오. 녹색 형광 단백질용 필터 큐브를 사용하여 청색광으로 mini SOG 태그를 여기시키십시오.

녹색 mini SOG 형광이 완전히 사라진 후에도 조명을 계속 유지하십시오. 중합된 diaminobenzidine의 갈색 광산화 생성물이 투과광 채널에 나타날 때까지 지속합니다. 그 다음, pH 7.4의 0.1 M sodium citrate buffer에 희석된 2% glutaraldehyde 1 mL를 사용하여 세포를 30분 동안 고정하십시오.

다음으로, pH 7.4의 0.1 molar sodium Cate 완충액에 0.1~0.5% 오스뮴 테트록사이드를 사용하여 20분 동안 세포막을 고정합니다. 고정이 완료되면, 일련의 에탄올 세척 과정을 통해 세포를 탈수시킵니다. 그 후, 100% 에탄올과 아크릴 수지를 1:1 비율로 혼합한 용액에 세포를 넣고 쉐이커에서 4시간 동안 배양합니다.

다음으로, 혼합물을 제거하고 샘플에 100% acrylic resin을 추가하여 4시간 동안 더 반응시킵니다. 레진을 중합시키기 위해, 라벨이 부착된 2 mL 마이크로 원심분리 튜브의 뚜껑을 면도날로 잘라내고 테두리에 acrylic resin accelerator를 도포합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 튜브의 약 3분의 2까지 LR white resin을 조심스럽게 채웁니다.

레진이 테두리에 있는 촉진제와 접촉하지 않도록 주의하십시오. 디쉬 내의 셀로 침투한 레진을 제거하고, 튜브의 너비가 디쉬 웨이트의 유리 덮개 관찰창을 거의 완전히 채울 수 있도록 디쉬를 수직으로 세운 마이크로 원심분리 튜브 위에 뒤집어 놓으십시오. 촉진제가 튜브와 커버슬립을 밀봉하는 데 1~2분이 소요됩니다.

그 다음 튜브를 뒤집어 튜브 안의 레진이 세포를 덮도록 합니다. 튜브가 담긴 디쉬를 60 °C 오븐에 넣고 12시간 동안 경화시킵니다. 블록이 경화되면, 레진이 채워진 마이크로 원심분리 튜브가 부착된 디쉬를 오븐에서 꺼내 마이크로 원심분리 튜브를 디쉬에서 분리합니다.

글라스 바텀 디쉬를 폐기하고, 면도날을 사용하여 마이크로 원심분리 튜브를 조심스럽게 절개하여 블록을 꺼냅니다. 면도날을 사용하여 다이아몬드 펜 또는 텅스텐 펜으로 이전에 표시해 둔 영역이 포함된 1mm² 부위만 남도록 블록을 다듬습니다. 다음으로, 블록을 울트라 마이크로톰(ultra microtome)에 장착하고 트리밍 나이프(trimming knife)를 사용하여 세포층에 도달할 때까지 블록을 다듬습니다.

그 다음 다이아몬드 나이프로 교체하여 세포를 가로지르는 약 50 nanometers 두께의 초박절편을 절단합니다. 절편을 고투과 300 mesh 그리드로 수집합니다. 그런 다음 그리드를 카본 코어에 넣고 절편에 약 0.2 to 0.4 nanometers 두께의 카본을 코팅하여 투과전자현미경의 전자빔 하에서 안정성을 높입니다.

에너지 필터가 장착된 투과전자현미경에 그리드를 로딩합니다. 저배율 일반 투과 모드를 사용하여 섹션 상의 세포를 검사하고, 이전에 촬영한 형광 이미지와 비교합니다. DNA 손상 궤적이나 DNA 복구 foci가 있는 핵이 발견되면, 에너지 필터링 모드로 전환하고 두께 맵(thickness map)과 함께 샘플을 기록합니다.

다음으로, 슬릿 폭 20 electron volts 조건에서 175 electron energy loss의 인(phosphorus) 맵 post edge 이미지를 기록합니다. 또한 질소(nitrogen) 맵 기록을 위해 슬릿 폭 20 electron volts 조건에서 120 electron volts energy loss의 pre-edge 이미지를 기록합니다. 슬릿 폭 35 electron volts 조건에서 447 electron volts의 post edge 이미지와 358 electron volts의 pre-edge 이미지를 기록합니다.

또한 슬릿 폭을 35 electron volts로 설정합니다. 이와 같은 이미지 처리 소프트웨어에서 원소 비율 맵을 엽니다. 질소 맵을 RGB 이미지의 red 채널에, 인 맵을 green 채널에 복사합니다.

그런 다음 맵들을 중첩하고 정렬합니다. 합성된 이미지를 TIFF(tagged image file format) 파일로 내보낸 후, 레이어 기능을 사용할 수 있는 이미지 처리 소프트웨어에서 해당 이미지를 엽니다. 다음으로, 이미지의 최소값과 최대값을 8비트 데이터 세트로 재조정하여 각 채널의 동적 범위(dynamic range)를 조정합니다.

그런 다음 레이어 창 내에서 질소 맵에서 인 함량을 뺍니다. 이미지를 인덱스 색상으로 변환하고, 핵산 분포를 보여주는 맵에는 CMYK 색 공간의 노란색 룩업 테이블을, 비크로마틴 단백질 맵에는 시안색 룩업 테이블을 생성합니다. 그 후 새 이미지를 생성하고 인과 비크로마틴 단백질의 분포를 보여주는 맵들을 서로 다른 레이어로 가져옵니다.

두 층을 서로 겹쳐서 보기 위해 화면 투명도 모드를 사용하십시오. 여기에는 RGB 색 공간에서 두 비율 맵을 서로 겹쳤을 때 세포 핵 내부의 인과 질소의 위치를 나타내는 전자 분광 비율 맵이 표시되어 있습니다. 이 이미지와 같은 이미지가 이 과정에서 얻어집니다.

노란색 구조는 인과 질소의 존재를 나타내는 핵 단백질을 의미합니다. 여기서는 U2 OS 세포에 감마선을 조사한 후 초점 구조의 변화를 관찰하기 위해 전자 분광 이미징이 사용되었습니다. 첫 번째 줄의 M cherry 태그가 부착된 복구 단백질을 안정적으로 발현하는 세포들은 조사되지 않은 세포들의 이미지입니다.

두 번째 행은 방사선 조사 3시간 후에 고정된 세포를 보여줍니다. 세 번째 행은 방사선 조사 6시간 후에 고정된 세포를 보여줍니다. 전자 분광 이미징 결과, 질소 신호의 증가로 나타나는 foci 내 53 BP1 단백질의 상대적 양은 증가하는 반면, 인 신호로 나타나는 염색질은 더 주변부로 위치하게 됨으로써 foci의 구조가 시간이 지남에 따라 재구성되는 것으로 나타납니다.

본 영상을 시청한 후, 전자 분광 이미징을 이용하여 DNA 복구 초점 내 크로마틴의 초미세 구조를 분석하기 위해, DNA 복구 단백질을 발현하는 조사된 세포를 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. sodium cacodylate 완충액, potassium cyanide 및 osmium oxide를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안 항상 흄 후드 내에서 작업하고 장갑을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.