Name: 인간 아데노 바이러스 유형 5를 기반으로 대용량 아데노 바이러스 벡터의 클로닝 및 대규모 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: 학습하세요 대용량 아데노 바이러스 벡터의 클로닝 및 대규모 생산 방법을 통해 유전자 치료에 활용하는 기술입니다. 이 기법은 최대 35kb의 외래 DNA를 전달하여 유전 질환 치료에 활용됩니다.

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이 작업은 DFG 보조금 EH 192/5-1(A.E.), EU(E-rare-2) 프로젝트 Transposmart(A.E.), UWH Forschungsförderung(E.S. 및 W.Z) 및 University Witten/Herdecke(PB)의 박사 과정의 지원을 받았습니다. J.L.은 중국 장학금 위원회(Chinese Scholarship Council)의 급여와 Else Kröner-Fresenius 재단(EKFS)의 TB 및 M.G의 지원을 받았습니다.

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에 제시된 프로토콜은 전술 한 절차에 기초 4,12 인간 아데노 바이러스 형 5에 기초 HCAdV 벡터들의 정화를 허용한다. pAdFTC 플라스미드 내의 HCAdV 게놈은 모든 아데노 바이러스 유전자의 결여 만 5&#39;- 및 3&#39;- LTR에 및 포장 신호를 전달한다. 이 전략에서 HV AdNG163R-2 (4)는 트랜스 효율적인 바이러스 생산에 필요한 모든 유전자를 제공한다. 또는 아데노 관련 바이러스 (AAV) 기반 벡터 - 이것은 명확하게 제 1 및 제 2 세대 AdVs 또는 널리 사용되는 렌티 바이러스 (LV)을 outcompetes 최대 35킬로바이트의 포장 용량을 제공합니다. 특히 생체 내 (in vivo) 적용을위한 HCAdV의 두번째 장점은 제일 - 대조적 또는 2 세대 AdVs 그들이 세포 독성의 감소 된 수준과 5-8 바이러스 단백질의 발현으로 인한 면역 부작용을 표시한다는 점이다. <p class=...

유전자 치료 응용 것이 바이러스 단백질의 발현, 유전자 자체 또는 수신 바이러스 단백질에 의한 세포 독성 및 면역 부작용을 방지하기 위해 매우 중요하다. 아데노 바이러스 벡터 (ADV)가 널리 도입 유전자 발현 1,2의 영향을 조사하기 위해 다양한 세포에 외래 DNA를 도입하기 위해 사용된다. ADV의 가장 진보 된 버전은 모든 바이러스 코딩 서열 3,4-함으로써 낮은 면역 원성 및 저독성 5-8 결합 35킬로바이트까지 패키징을 제공하는 능력이 결여 된 고용량 아데노 바이러스 벡터 (HCAdV)으로 표시된다. 때문에 높은 포장 용량 그들은 하나의 벡터 용량을 사용하여 크거나 여러 유전자의 전달을 할 수 있습니다. 따라서, 그들은 연구 지역 사회를위한 유용한 도구를 나타냅니다. 대조적으로, 제일 - 또는 VEC를 2 세대 ADV 쉽게 상업용 키트를 사용하여 제조 할 수있다 초기 유전자 E1 및 / 또는 E3 결여 할토르 HCAdV의 게놈 구조와 바이러스 생산은 더 복잡하다. HCAdV 게놈의 건설을위한 시스템은 모든 바이러스 코딩 시퀀스 및 셔틀 플라스미드 pHM5 9-12없는 HCAdV 게놈을 운반하는 플라스미드 pAdFTC을 기반으로합니다. 최대 14 킬로베이스 (KB)의 관심의 모든 유전자가 여러 복제 사이트가 인식에 의해 형벌되는 셔틀 벡터 pHM5에 복제 할 수 있습니다 / 원점 복귀 엔도 뉴 클레아의 사이트를 절단 SceI 제한 I 및 I-CEU I.를 PI- 따라서, 관심의 유전자를 클로닝 연속 PI- 및 I-SceI 제한 I- CEU I 의해 플라스미드에 함유 pAdFTC HCAdV 게놈에 존재하는 동일한 제한 부위에 관한 후속 삽입 소화 해제 될 수있다. pAdFTC에 PI- SceI 제한 I 및 I- CEU 난 부위를 절단 사이에 유전자 삽입 부위는 스터 DNA 및 5 &#39;및 3&#39;반전으로 말단 반복 게놈 패키징에 필요한 비 암호화하는 아데노 바이러스 서열 (LTR에)와 측면으로 접하고단부와 하류 5&#39;ITR 패키징 신호 모두에서. 추가 투표자 DNA는 바이러스 생산시 효율적인 포장을 보장하기 위해 27-36킬로바이트까지 최종 HCAdV 게놈의 최적 크기를 제공합니다. pAdFTC이 (삽입 된 유전자의 크기에 따라 다름)까지 45킬로바이트와 큰 플라스미드와 비교적 긴 DNA 인식 사이트와 유도 엔도 뉴 클레아의 사용을하기 때문에 결합 강한 DNA, 몇 가지 정리 단계 pHM5에서 유전자의 전송시 필요한 전시 pAdFTC에. 전단력을 피하고 취급에주의하는 것이 좋습니다. HCAdV 게놈은 LTR에 5&#39;ITR의 상류에 직접적으로 위치되고 3&#39;ITR (12)의 하류 없음 I 제한 효소 인식 부위에 의해 측면된다. 따라서, HCAdV 없음 내가 HCAdV 생산 세포주에 바이러스 게놈의 후속 형질 다이제스트에 의해 방출 될 수있다. 참고 제한 효소의 사용하지 I REL위한플라스미드 pAdFTC에서 바이러스 게놈의 용이성 삽입 유전자가 없음 I DNA 인식 부위의 결여 된 것을 의미한다. HEK293 세포 기반 생산 세포 (116 세포)를 안정적으로 Cre 호텔 재조합 효소를 표현한다. 바이러스 증폭 셀 (116)은 트랜스 -3,4-의 복제 및 패키징을 위해 필요한 모든 ADV 유전자를 제공하는 헬퍼 바이러스 (HV)와 공동 감염. HV 116 4 세포에서 발현 Cre 호텔 재조합 바이러스에 의해 증폭되는 동안 제거 floxed 포장 신호와 제 세대 ADV이다. 이것은 본래 패키징 신호를 포함 주로 HCAdV 게놈 encapsidated되도록. HCAdV의 사전 증폭 조직 배양 접시의 표면에 성장 (116) 세포에서 시리얼 계대 단계를 수행하여 수행됩니다. 각각의 통과 후 바이러스 입자는 세 개의 연속 동결 - 해동 단계를 수행하여 감염된 세포에서 방출된다. 세포의 수가 증가는 모든 통로로 감염된선행 통로에서 세포 용 해물의 1/3. 마지막 사전 증폭 단계는 대규모 증폭 스피너 플라스크에 정지에서 재배 생산 세포를 감염하는 데 사용됩니다에서 마지막으로 해물. 비리 온은 4,12 구배 염화 세슘 밀도에서 초 원심 분리를 수행하여 현탁 세포로부터 정제된다. 이 절차를 빈 입자와 완벽하게 조립 입자는 두 가지 대역으로 분리된다. 상기 HCAdV을 집중하는 제 2 비 - 점진적으로 초 원심 분리 단계가 수행되는 입자를 포함한다. 이어서 HCAdV 함유 얻어진 밴드 수거하고 생리 완충액에 대해 투석한다. 최종 제제는 벡터의 절대 바이러스 입자 감염성 입자 및 HV 오염 수준의 숫자에 대한 특징이다. 절대 바이러스 입자는 바이러스 입자를 용균 및 260 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 또는 정량적 실시간 PCR (qPCR에) (12)을 수행하여 결정될 수있다. 끝까지 마음의 감염ified하게 바이러스 입자는 감염된 세포에서 3 시간의 감염 후 내에 존재 qPCR의 측정 HCAdV 게놈에 의해 결정될 수있다.

<table><tbody><tr><td>CeuI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0699S</td><td>제한 다이제</td></tr>스트 <tr><td>PI-SceI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0696S</td><td>제한 다이제</td></tr>스트 <tr><td>T4 Ligase</td><td>New Engand Biolabs</td><td>M0202S</td><td>결찰</td></tr><tr><td>SwaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0604S</td><td>제한 다이제</td></tr>스트 <tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td>제한 다이제스트</td></tr><tr><td>송아지 장 알칼리성 인산가수분해효소 (CIP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td>소화된 플라스미드의 탈인산화</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>PAN Biotech</td><td>P02-015</td><td>116 세포를 발현하는 CRE 선택</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03590&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Hek293T 세포 배양 배지</td></tr><tr><td>최소 필수 배지 (MEM) Eagle</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-08500</td><td>116 세포 배양 배지&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>둘베코' s 인산염 완충액 식염수(DPBS)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td>세포 세척, 세포 재현탁</td></tr>액 <tr><td>250ml 저장 병</td><td>Sigma</td><td>CLS430281-24EA</td><td>현탁액에서 성장한 116개 세포의 감염</td></tr><tr><td>500ml PP 원심분리기</td><td>Sigma</td><td>CLS431123-36EA</td><td>현탁액 배양에서 세포 침</td></tr>강 <tr><td>스피너 플라스크</td><td>Bellco</td><td>1965-61030</td><td>116개 세포의 성장 서스펜션</td></tr><tr><td>울트라 클리어 초원심분리기 튜브</td><td>Beckmann Coulter</td><td>344059</td><td>밀도 구배 원심분리</td></tr><tr><td>초원심</td>분리기 <td>Beckmann Coulter</td><td></td><td>밀도 구배 원심분리</td></tr><tr><td>SW-41 로터</td><td>Beckmann Coulter</td><td></td><td>밀도 구배 원심분리</td></tr><tr><td>Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane</td><td>VWR</td><td>132129</td><td>투석 튜브</td></tr><tr><td>즉시 사용 가능한 투석 카세트&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>66383</td><td>투석</td></tr><tr><td>원샷 DH10B 전기 역량 E. coli</td><td>invitrogen</td><td>C4040-52</td><td>결찰 반응의 변환</td></tr><tr><td>PureYield Plasmid Midiprep 시스템</td><td>Promega</td><td>A2495</td><td>midiprep</td></tr><tr><td>peqGOLD 조직 DNA 미니 키트&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>12-3396-02</td><td>게놈 DNA</td></tr><tr><td>분리 SuperFection 형질주입 시약</td><td>Qiagen</td><td>301305</td><td>116개 세포의 형질전환</td></tr><tr><td>opti MEM (10% FBS)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>116개 세포의 형질전환</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>&nbsp; 170-8882</td><td>q-PCR</td></tr><tr><td>CFX 96 C1000 터치&nbsp;</td><td>Biorad</td><td></td><td>qPCR 기계</td></tr><tr><td>페놀/클로로포름/이소아밀 알코올&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>A156.1</td><td>DNA</td></tr><tr><td>정제 세슘 클로라이드</td><td>Carl Roth</td><td>8627.1</td><td>밀도 구배 원심분리</td></tr><tr><td>아세트산 나트륨 99%</td><td>Carl Roth</td><td>6773.2</td><td>DNA 침전</td></tr><tr><td>LB 매체&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X968.3</td><td>세균 성장 매체</td></tr><tr><td>에탄올&nbsp; 99.8% 순수</td><td>Carl Roth</td><td>9065.5&nbsp;</td><td>DNA 침전 및 세척</td></tr><tr><td>SDS 99.5%</td><td>Carl Roth</td><td>2326.2</td><td>용해&nbsp; 완충액</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td>용해&nbsp; 완충액</td></tr><tr><td>Tris-HCl 99%</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td>투석 완충액/ 용해&nbsp; 완충액</td></tr><tr><td>글리세롤 99.5%</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td>투석 완충액</td></tr><tr><td>MgCl2 98.5%</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.2</td><td>투석 완충액</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td>선택적 투석 완충액</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td>선택적 투석 완충액</td></tr><tr><td>자당</td><td>Carl Roth</td><td>9286.1</td><td>선택적 투석 완충액</td></tr><tr><td>Na2HPO4x2H2O</td><td>Carl Roth</td><td>4984.2</td><td>선택적 투석 버퍼</td></tr><tr><td>1.5-ml 튜브</td><td>SARSTEDT</td><td>72,730,005</td><td>-80°C에서 바이러스 제제 저장; 씨</td></tr></tbody></table>

인간 아데노 바이러스 유형 5를 기반으로 대용량 아데노 바이러스 벡터의 클로닝 및 대규모 생산

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

모든 바이러스 코딩 염기서열이 없는 고용량 아데노바이러스 벡터(HCAdV)는 높은 패키징 용량(최대 35kb), 낮은 면역원성 및 낮은 독성으로 인해 가장 진보된 유전자 전달 벡터 중 하나입니다. 그러나 많은 실험실에서 HCAdV의 사용은 벡터 게놈 구성 및 바이러스 생산을 위한 복잡한 절차로 인해 방해를 받고 있습니다. 여기에서는 HCAdV 게놈을 포함하는 플라스미드 pAdFTC를 기반으로 HCAdV의 효율적인 클로닝 및 생산을 위한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. HCAdV 게놈의 구축은 호밍 엔도뉴클레아제(I-CeuI 및 PI-SceI)를 활용하는 클로닝 벡터 시스템을 기반으로 합니다. 최대 14kb의 관심 유전자는 I-CeuI 및 PI-SceI의 측면에 있는 다중 클로닝 부위를 포함하는 셔틀 벡터 pHM5에 subclone할 수 있습니다. 셔틀 벡터로부터 전이유전자의 I-CeuI 및 PI-SceI-매개 방출 후, 전이유전자를 HCAdV 클로닝 벡터 pAdFTC에 삽입할 수 있습니다. pAdFTC 플라스미드의 크기가 크고 강력한 DNA 결합과 관련된 사용된 효소의 인식 부위가 길기 때문에 클로닝 단편을 신중하게 처리해야 합니다. 바이러스 생산을 위해 HCAdV 게놈은 NotI digest에 의해 방출되어 Cre 재조합효소를 안정적으로 발현하는 HEK293 기반 생산자 세포주에 transfection됩니다. 아데노바이러스 증폭을 위한 모든 아데노바이러스 유전자를 제공하려면 loxP 부위 옆에 있는 패킹 신호를 포함하는 도우미 바이러스와의 동시 감염이 필요합니다. 벡터의 사전 증폭은 표면에서 성장한 생산자 세포에서 수행되고 벡터의 대규모 증폭은 현탁액에서 성장한 생산자 세포가 있는 스피너 플라스크에서 수행됩니다. 바이러스 정제를 위해 염화세슘 구배를 기반으로 하는 두 가지 초원심분리 단계를 수행한 후 투석을 수행합니다. 여기에서는 이 HCAdV 벡터 시스템으로 지난 몇 년 동안 개발된 팁, 요령 및 바로 가기를 소개합니다.

복제, 증폭 및 HCAdV 준비 정화용 여기에 대표적인 예는 표시됩니다. 효소 소화 제한에 의해 복제 전략의 개요 (그림 1)과 복제에 대한 대표적인 예와 HCAdV 게놈의 릴리스는 (그림 2)이 제공된다. 소화 나는 PI- SceI 제한 I 및 I-CEU에 의해 pHM5에서 GOI-발현 카세트 및 후속 페놀 - 클로로포름 추출 및 EtOH로 침전의 출시 후 일반적인 제한 패턴 (그림 2A)를 표시된다 (도 1.2 ~ 1.5 단계). 일반적 pHM5 플라스미드 백본 및 GOI의 발현 카세트에 대응하는 제 2 대역에 대응 ~ 3킬로바이트 밴드를 관찰 할 수있다. GOI 발현 카세트를 함유하는 밴드이어서, 아가 로스 겔로부터 정제한다. 정제 된 GOI-발현 카세트는 정제, 탈 인산화 pAdVFTC와 함께 아가 로스 젤에 분석 W 그정확한 크기를 확인하...

모든 바이러스 코딩 염기서열이 결여된 고용량 아데노바이러스 벡터를 생성하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 벡터 게놈에 포함된 전이유전자의 클로닝은 homing endonucleases를 기반으로 합니다. 부착 세포로 성장하고 현탁액에서 생산자 세포의 바이러스 증폭은 트랜스에 바이러스 유전자를 제공하는 보조 바이러스에 의존합니다.

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 세포 또는 생체 내에서 치료용 트랜스유전자를 전달하고 발현시키기 위해 유전자가 결손된 고용량 아데노바이러스 벡터를 제작하는 것입니다. 이 방법은 다른 바이러스 벡터에 담기 어려운 거대 트랜스유전자를 전달함으로써 유전자 치료 분야에 기여할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고용량 아데노바이러스에 바이러스 유전자가 포함되어 있지 않다는 점입니다.이러한 벡터를 사용하면 최대 35 kb의 외래 DNA를 전달할 수 있습니다. 이 기술의 응용 범위는 유전 교정 또는 유전자 추가를 위한 치료용 벡터 전달을 가능하게 하므로, 유전 질환 치료까지 확장됩니다. 이 방법은 치료용 트랜스제인의 생체 내 전달을 위한 고급 도구를 제공하며, 세포 배양뿐만 아니라 살아있는 생물체에도 적용될 수 있습니다.벡터 증폭 및 벡터 정제에는 어느 정도의 숙련도가 필요하므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 벡터 정제 과정에서는 적절한 세심한 조작이 필요합니다. 10배 희석한 선형화된 고용량 아데노바이러스 게놈 발현 플라스미드 일부를 젤 전기영동으로 확인하십시오.pAd-FTC 플라스미드 백본을 위한 9 kb 단편과 고용량 아데노바이러스 게놈 및 표적 유전자를 위한 두 번째 28~36 kb DNA 단편이 검출되어야 합니다. 다음으로, 표준 절차에 따라 50~80% 합류도(confluency)의 116 세포가 배양된 60 mm 디시에 선형화된 고용량 아데노바이러스 게놈 5 µg을 형질전환합니다. 형질전환 16~18시간 후, 배지를 조심스럽게 제거하고 신선한 배지 3 mL를 첨가합니다.그런 다음, 세포당 5 transducing units를 적용하여 헬퍼 바이러스 AdNG 163R2로 세포를 감염시킵니다. 37 °C 및 5% CO2 조건의 조직 배양 인큐베이터에서 배양하십시오. 또한, 배양 첫 1시간 동안에는 20분마다 플레이트를 흔들어 헬퍼 바이러스가 모든 세포에 균일하게 분포되도록 합니다.감염 48시간 후, 배양액을 사용하여 배양 접시에서 세포를 세척하여 수확합니다. 게놈 DNA 분리를 위해 계대 0세대 세포 0.5 milliliter 분취액을 따로 보관합니다. 그 다음, 계대 0세대 세포 2.5 milliliter 분취액을 액체 질소에 담가 반복적으로 동결/융해시킵니다.또는 세포를 -80 °C 냉동고에 넣었다가 37 °C 항온수조로 옮기는 과정을 3~4회 반복합니다. 2.5 mL의 용해물(lysate)을 1 mL의 신선한 배지와 혼합하고, 세포당 2 transforming unit의 헬퍼 바이러스를 첨가합니다. 90~95% 밀도로 성장한 60 mm 디쉬의 116 세포에서 배지를 흡입하여 제거한 후, 세포에 바이러스 혼합물을 첨가합니다.이전과 동일하게 세포를 48시간 동안 배양합니다. 그런 다음, 세포를 수확하고 동결/해동 및 감염 절차를 두 번 반복하여 1차 계대 및 2차 계대 용해물을 얻습니다. 2차 계대 용해물을 얻은 후, 용해물 2.5 milliliters를 신선한 배지 17.5 milliliters와 혼합하고 세포당 2 transforming units의 헬퍼 바이러스를 첨가합니다.80~100% 합류(confluent)된 116 세포의 150 millimeter 디쉬에서 배지를 흡입하여 제거하고, 바이러스 혼합물로 세포를 감염시킵니다. 감염 48시간 후, 방금 보여드린 절차를 사용하여 계대 3회 용해물을 수확합니다. 이 단계를 시작하려면, 3리터 스피너 배양 플라스크에 미리 데워둔 배지 900 milliliters를 추가합니다.90~100% 밀도로 성장한 116 세포가 담긴 150 mm 디쉬 최소 10개에서 배지를 제거합니다. 그리고 10 mL의 신선하고 미리 데워진 배지를 넣어 세포를 씻어냅니다. 피펫으로 여러 번 흡입 및 분출하여 균질한 세포 현탁액을 만듭니다.그런 다음 세포를 스피너 플라스크로 직접 옮깁니다. 조직 배양 인큐베이터 내의 마그네틱 교반기 위에서 스피너 플라스크를 37 °C, 5% CO2 조건으로 24시간 동안 배양합니다. 세포가 유리 표면에 부착되는 것을 방지하기 위해 마그네틱 교반기를 70 RPM으로 조정합니다.스피너 배양 플라스크를 설정한 지 24시간 후에 신선한 배지 500 milliliters를 추가합니다. 24시간 후에 이 단계를 다시 반복합니다. 배양 설정 72시간 후에 플라스크에 신선한 배지 1 liter를 추가하여, 세포 현탁액의 총 부피가 3 liters가 되도록 합니다.24시간 후, 실온에서 500 ×g로 10분간 원심분리하여 1x10⁶ 현탁 세포를 수확합니다. 상층액을 버리고 펠릿을 150 mL 배지에 넣은 뒤 피펫팅을 8~10회 정도 반복하여 재현탁합니다. 세포를 멸균된 마그네틱 스터 바가 들어 있는 250 mL 보관 병으로 옮깁니다.그다음, 3대 계대 배양된 용해물과 세포당 2 TU(transforming units)의 헬퍼 바이러스를 세포에 함께 감염시킵니다. 여기서 총 세포 수는 약 9 × 10⁸개이므로, 1.8 × 10⁹ TU를 첨가합니다. 조직 배양 인큐베이터 내의 마그네틱 교반기를 사용하여 세포-바이러스 혼합물을 60 RPM으로 2시간 동안 교반합니다.공기 순환이 가능하도록 보관 병을 완전히 닫지 마십시오. 감염 2시간 후, 세포-바이러스 혼합물 전체 부피를 3리터 스피너 배양 플라스크로 다시 옮깁니다. 미리 데워둔 신선한 배지 1850 milliliters를 추가하고, 조직 배양 인큐베이터에서 70 RPM으로 48시간 동안 배양합니다.48시간 후, 세포 바이러스 현탁액을 500 milliliter 원심분리관으로 옮깁니다. 그런 다음, 실온에서 890 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 배지를 제거하고 펠렛 형태의 세포를 총 28 milliliters의 DPBS에 재현탁합니다.바이러스 정제를 시작하기 전까지 세포 바이러스 현탁액을 -80 °C에서 보관하십시오. 세슘 클로라이드 밀도 구배 정제를 위한 바이러스 용해물을 준비하려면, 세포 바이러스 현탁액을 4회 동결 및 해동하십시오. 그 후, 바이러스 용해물을 상온에서 500 ×g로 8분 동안 원심분리하십시오.그런 다음, 고역가 아데노바이러스가 포함된 상층액을 수집합니다. 다음 순서대로 세슘 클로라이드 용액을 튜브에 조심스럽고 천천히 피펫팅하여 넣습니다: 1.5 g/cm³ 용액 0.5 mL, 1.35 g/cm³ 용액 3 mL, 그리고 1.25 g/cm³ 용액 3.5 mL. 1.25 g/cm³ 층 위에 정제된 벡터 상층액 약 4.5 mL를 겹쳐서 올립니다.고용량 아데노바이러스 게놈을 포함하는 바이러스 입자를 빈 입자 및 세포 잔해로부터 분리하기 위해, 스윙 아웃 로터가 장착된 초원심분리기를 사용하여 12 °C에서 226,000 ×g로 최소 2시간 동안 밀도 구배를 원심분리합니다. 원심분리 후, 튜브 상단에 세포 잔해의 확산 띠가 형성됩니다. 그 아래로 두 개의 흰색 띠가 관찰될 수 있습니다.상단 밴드는 빈 입자를 포함하고 있으며, 하단 밴드는 고역가 아데노바이러스입니다. 세포 파편 층과 빈 입자 층을 조심스럽게 제거하십시오. 그 다음, 각 튜브의 하단 밴드에서 1 mL를 수집하십시오.바이러스를 멸균된 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 수집된 바이러스 입자에 1.35 grams per cubic centimeter 염화세슘 용액을 최대 24 milliliters까지 첨가하고 조심스럽게 혼합합니다. 원심분리 튜브의 상단까지 1.35 grams per cubic centimeter 염화세슘 바이러스 용액으로 채웁니다.그 후, 완만한 가속 및 감속 설정의 스윙 아웃 로터가 장착된 초원심분리기를 사용하여 12 °C에서 226,000 ×g로 밤새 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다. 그런 다음, 새로운 피펫 팁을 사용하여 뚜렷한 하단 밴드에 존재하는 고역가 아데노바이러스를 수집합니다.마지막으로, 버퍼 교체를 위해 수집된 바이러스 입자를 투석합니다. 그 후, 서면 프로토콜의 상세 지침에 따라 최종 준비물의 타이터를 측정합니다. 이 히스토그램은 광학 밀도로 측정한 OD 타이터, 감염 타이터 및 qPCR로 측정한 헬퍼 바이러스 오염도 등 세 가지 서로 다른 방법으로 결정한 단일 벡터 준비물의 절대 입자 수를 보여줍니다.qPCR로 측정한 총 감염성 고용량 아데노바이러스 입자와 헬퍼 바이러스 오염 수준 사이의 비율이 여기에 표시되어 있습니다. 벡터에 형광 표지 유전자가 포함되어 있는 경우, 형광 현미경 관찰을 통해 벡터의 사전 증폭을 모니터링하고 최종 벡터 조제물의 감염성을 특성화할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 유전자가 결손된 고용량 아데노바이러스를 생산하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.특히 외래 유전자를 삽입하는 방법과 벡터를 증폭 및 정제하는 방법에 대하여 설명합니다.

cloning-large-scale-production-high-capacity-adenoviral-vectors-based

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

지난 15년 동안 개 아데노바이러스 2형(CAV2) 유래 벡터는 in vitro 및 in vivo 세포를 transduction하는 효율성이 입증되었으며 백신 접종 및 유전자 치료에 널리 사용됩니다. 여기에서는 CAV2 벡터를 생성, 생산 및 정제하여 high-titer 바이러스 현탁액을 생성하는 절차를 설명합니다.

Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 유래 벡터의 생산 및 정제

여기서는 원리 증명 가의 아데노 바이러스 타입 5 (의 Ad5) 벡터를 생성하는 프로토콜을 제시의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS HVR5-6-그의 항원 캡시드 혼입 전략을 이용하여. 이 벡터는 성적 체력을 나타내는 것으로 입증되었다, 기능은 통합 항원의 Ad5 양성 시험관 내에서 혈청 및 항원뿐만 아니라 면역 원성을 탈출.

아데노 바이러스 혈청 형 5 된 벡터 백신 접근 방법의 개발을위한 항원 캡시드-설립 전략을 활용

여기, 우리가 생산 하는 효율적이 고 재현 가능한 전략, titer, 및 품질 관리 일괄 adeno 관련 바이러스 벡터의 설명 합니다. 그것은 높은 titer로 벡터 준비를 하면 (13 벡터 게놈/10ml x ≥1)와 고 순도, 생체 외에서 또는 vivo에서 사용에 대 한 준비.

생산, 정화, 및 Adeno 관련 바이러스 기반 벡터에 대 한 품질 관리

여기서, 우리는 pAdEasy 시스템을 사용하여 아데노바이러스 생산을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 pAdTrack 및 pAdEasy-1 플라스미드의 재조합, 아데노바이러스 포장 및 증폭, 세포 용해 및 배양 배지에서 아데노바이러스 입자의 정제, 바이러스 적정, 아데노바이러스의 기능적 테스트를 포함한다.

아데노바이러스 생산을 위한 효율적인 방법

여기서 는 세포 스택 및 친화성 크로마토그래피 정제에서 자란 부착 된 HEK 293 세포를 사용하여 연구 급 AAV 벡터의 대규모 생산을위한 상세한 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 지속적으로 &gt;1 x10 13 벡터 게놈/mL을 산출하여 대규모 동물 연구에 적합한 벡터 양을 제공합니다.

대형 동물 모델의 전임상 연구를 위한 세포 스택에 있는 아데노 관련 바이러스 벡터의 생산

여기에서 현탁액 HEK293 셀 기반 AAV 생산 프로토콜이 제시되어 상용 공급업체에서 연구 목적으로 사용할 수 있는 구성 요소를 사용하여 벡터 생산에 필요한 시간과 노동력을 줄일 수 있습니다.

HEK293 부유 세포를 사용한 고수율 Adeno 관련 벡터 배치 생산

유전자 치료 분야가 계속 발전함에 따라 이러한 문제를 해결할 수 있는 혁신적인 방법에 대한 필요성이 커지고 있습니다. 여기에서는 cell factory 플랫폼을 사용하여 고수율 및 고순도 AAV 벡터를 생성하는 프로세스를 간소화하여 in vivo 연구의 품질 표준을 충족하는 고유한 방법을 제시합니다.

Cell Factory Platform을 활용하여 고역가, 고품질 아데노 관련 바이러스 벡터를 생성하기 위한 간소화되고 표준화된 절차

거미 실크 옷의 뛰어난 기계적 및 생화 학적 특성에도 불구하고,이 재료는 종래의 방법으로 대량 수확 할 수 없습니다. 여기 차세대 biomaterials 같은 거미 실크의 생산과 사용을 공부 수사관을위한 중요한 과정입니다 인공 거미 실크 섬유를 스핀하는 효율적인 전략을 설명합니다.

실험실 규모의 합성 거미의 실크 생산

전도성 고분자 (CP) 트랜스 듀서에서 생성 모든 고체 이온 선택성 전극 (ASSISEs) 액체 매체의 기능적 수명이 몇 달을 제공합니다. 여기, 우리는 실험실 - 온 - 칩 형식 ASSISEs의 제조 및 교정 과정을 설명합니다. ASSISE 복잡한 생물학적 매체에서 장기간 보관 후 가까운 따른다 Nernstian 기울기 프로파일을 유지 한 것으로 설명된다.

생리 연구를위한 모든 고체 이온 선택성 전극 (ASSISE)를 기반으로 다중 분석 바이오칩 (MAB)

학습하세요 대용량 아데노 바이러스 벡터의 클로닝 및 대규모 생산 방법을 통해 유전자 치료에 활용하는 기술입니다. 이 기법은 최대 35kb의 외래 DNA를 전달하여 유전 질환 치료에 활용됩니다.

인간 아데노 바이러스 유형 5를 기반으로 대용량 아데노 바이러스 벡터의 클로닝 및 대규모 생산

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