Name: 생물 액체 배지에서 확장 성, 금속 높은 가로 세로 비율 나노 복합 재료의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: 학습하세요 생물 액체 배지에서 구리 나노입자와 시스틴을 이용하여 고가로세비 나노복합체를 합성하는 확장 가능한 방법을. 이 기술은 생리학적 조건에서 암 치료 및 진단을 위한 약물 전달에 활용될 수 있습니다.

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저자는 루이지애나 공과 대학의 마이크로 제조 연구소(Institute of Micromanufacturing)에서 전자 현미경 연구를 수행한 Alfred Gunasekaran의 기술 지원과 추가 현미경 연구를 지원한 Jim McNamara 박사의 기술 지원에 감사를 표합니다. 설명된 작업은 루이지애나 이사회 PKSFI 계약 번호의 일부 지원을 받았습니다. LEQSF (2007-12)-ENH-PKSFI-PRS-04 및 루이지애나 공과 대학의 James E. Wyche III 기부 교수직 (M.D.까지).

실험 1. 계획 <ol><li> 합성에 필요한 구리 나노 복합 재료의 양을 결정합니다. 그 기준으로, 작은 볼륨 플라스크 (25cm 2), 또는 자료의 준비에 아래에 표시된 바와 같이 더 큰 플라스크의 번호를 선택합니다. </li><li> 이 합성에 대해, 5 % CO 2와 적어도 40 %의 습도와 37 ° C의 배양기를 사용한다. 이러한 보육이 가능하며 반복적으로 합성의 시간 (약 24 시간) 이상 방해되지 않습니다 있는지 확인하십시오. 주의 : 반복 열기 및 인큐베이터의 폐쇄 확실히 나노 복합 구조의 변형 합성 될 수 있습니다 온도 변화의 원인이됩니다. </li></ol> 재료 2. 준비 <ol><li> 합성을 시작하는 것입니다 직전 용매에 고체 물질을 추가하여, 실험 시작하기 전에 신선한 모든 재료를 준비합니다. 긴 시간 B에 대한 액체에 시스틴과 구리 출발 물질의 재고 솔루션을 유지는 efore 실험은 권장되지 않으며 변수의 결과가 발생할 수 있습니다. 일단 파라 필름과 용기의 상단을 포장하여 건조 원료 공급 업체에서 계속 열었다. 주 : 다음 프로토콜 시스틴 7 μL, 멸균 6643 μL 및 CNPS 350 μL를 사용하여 25cm 2 세포 배양 플라스크 내의 반응 예로서 사용된다. </li><li> CNPS의 최소 2 mg의를 무게에 의해 구리 나노 입자의 2 ㎎ / ㎖ 솔루션을 준비합니다. 피부에 CNPS 가능한 접촉을 방지하기 위해이 단계에서 일회용 장갑을 착용 할 것. 빈 멸균 16 mL 유리 병에 나노 입자를 놓습니다. <ol><li> CNPS이 들어있는 유리 병에, 2 ㎎ / ㎖ 용액을 합성 시작하기 전에 나노 입자의 분산을 제공하기 위해 20 초 동안 솔루션을 와동 적절한 볼륨에서 멸균 탈 이온수를 추가 (최소 1 ml의 총 부피 권장). 이 소용돌이로 교반하여 혼합 억제하므로 물을 유리 병의 절반 이상이 방법을 기입하지 마십시오. CNPS 줘야난 빠르게 유리 병의 바닥에 정착 (검정 회색) 색상 어두운 나타납니다. </li><li> 합성의 시작하기 전에 CNPS의 최대 분산을 제공하기 위해 실온에서 17 분 동안 CNP 솔루션을 sonicate하세요. 주기적으로 CNPS은 초음파로 인해 혼합되어 있는지 확인하십시오. 성공적인 초음파 처리 후, CNPS 적어도 30 분 동안 용액에 현탁 상태로 유지하고, 용액의 색은 어두운 것이다. </li></ol></li><li> 합성 72.9 ㎎ / ㎖ 용액을 만들기 위해 충분한 시스틴의 질량을 단다. 시스틴 물에 직접 용해하지 않기 때문에, 대전 계량 용기에 칭량 시스틴 놓는다. <ol><li> 시스틴이 완전히 용해되도록 계량 용기 포함 시스틴에, 멸균, 1 M NaOH를 충분한 볼륨을 추가합니다. 예를 들어, 72.9 ㎎ / ㎖ 용액을 만들기 위해, 1 M NaOH를 100 μL 완전히 시스틴 7.29 mg을 용해. </li><li> 멸균 흐름 조직 문화 후드에서이 단계를 수행, 무균 상태를 유지합니다. 주의 : 수산화 나트륨1 M 농도가 가성이다에서, 그래서 피부에 농축 된 수산화 나트륨의 접촉을 방지하기 위해이 단계에서 일회용 장갑을 착용 </li></ol></li><li> 무균 조직 배양 후드에서 작업, 먼저 멸균 합성 플라스크에 멸균의 6643 μL과 시스틴의 7 μl를 추가하고, 플라스크 캡으로 37 ° C에서 인큐베이터에서 30 분 동안 품어 보자 효과 제공 (느슨한) 배출 혼합. CNPS는 초음파 단계 후에 정착하기 때문에, 30 초 동안 볼 텍싱하여 2 ㎎ / ㎖ 용액을 CNP 재현 탁. <ol><li> 합성을 시작하도록 25cm 2 세포 배양 플라스크에 멸균 수, 50 부 CNPS 및 949 부를 1 부품 시스틴 결합 : 다음의 성분 비율을 유지하기 위해 (무균 기술을 사용하여) 합성 플라스크에 충분한 CNP 용액을 추가한다. 예를 들어, 7 mL의 합성 볼륨, 시스틴 원액 7 μL, CNPS 350 μL, 멸균 물 6643 μL를 결합한다. 플라스크에 뚜껑을 교체하고 그래서 SECUR가 있음을 조전자. </li><li> 합성을위한 모든 구성 요소를 조합 한 후, 가볍게 4-5 회 소용돌이에 의해 플라스크에 혼합한다. CO 2 배양기에서 플라스크를 놓고와 합성 동안 플라스크 중 가스 교환이 될 수 있도록 뚜껑을 풀어 플라스크를 배출. </li></ol></li><li> 합성이 약 24 시간 동안 인큐베이터에서 실행할 수 있습니다. 합성 중 하나는, 현미경과 눈으로, 높은 선형 복합의 형성을 관찰 할 수있다. 주 : 구조체의 형성 과정은 구조가 초기에 감지하기 어려운 것을 의미에서 갑자기 발생할 수 후 외관 밀도 증가에 신속하게 진행한다. 형성은 따라서 24 시간 전에 발생할 수 있습니다. 큰 구조 및 그 밀도가 증가하게되면 프로세스는 육안으로 관찰 될 수있다. 구조물의 생성 이후 시점에서 현미경으로 눈에 의해 시간이 지남에 따라 관찰 될 수 있지만, 연속 합성 조건을 중단하고 온도 불량으로 이어질합성 결과. </li><li> 단단히 합성 플라스크 상한 및 냉장고 (4 ℃)에서 선박을 저장하여 biocomposites의 합성을 종료합니다. 한번 생성 된 구조는 1 년 이상이 형태로 안정적으로 유지. 사용되는 구성 요소, 합성의 날짜 및 종료 전에 합성의 배양 시간을 포함하여 합성 조건과 플라스크 레이블. </li></ol> 구리 황산을 사용하여 3. 합성 <ol><li> 황산구리 염 CNPS 대체하여 자기 조립 합성을 수행. 멸균 기법을 사용하여, 2 ㎎ / ㎖ 용액을 멸균 증류수 충분한 부피 황산구리 적어도 2 mg을 용해. 황산동 결정을 쉽게 농도로 용액에 들어가 있지만, 필요한 경우 바이알 와동 모든 결정체가 용해되어 육안으로 확인하기 위해 검사한다. </li><li> 전술하지만 황산구리 CNPS 대체로서 황산동의 제조 후, 합성을 수행한다. 주 : 출발 물질로서 황산 구리를 사용하여 자기 조립 된 나노 복합 재료가 CNPS 합성 구조물의 최종 형상보다 훨씬 더 일관되게 나타났다. </li><li> CNP의 복합 재료로 구리 황산 biocomposites의 합성을 종료 (2.6 단계), 4 ℃에서 그들에게 장기를 저장합니다. </li></ol> 4. 특성화 및 Biocomposites 후 합성 처리 <ol><li> CNPS에서 흰색 빛 현미경 (9)에 의해 구리 황산에서와 전자 현미경 (9)에 의해 유도 된 biocomposites을 특성화. <ol><li> 합성 플라스크 평 누워의 몇 분 이내에 플라스크의 바닥 표면에 정착하는 바와 같이 특성화 및 biocomposites 백색광 현미경으로 합성 후 검사를 들어, 거꾸로 현미경을 사용하여, 다음 포커스하게 할 수있다. biocomposites 및 액체 매질 사이의 대비를 극대화하기 위해 현미경의 시야 설정을 사용합니다. CNPS과 경찰에서 파생 된 복합황산 당 모두 색상의 불투명 분명 나타날 것입니다 만, 미 반응 CNP 집계 색상에 매우 어두운 나타납니다. <ol><li> 복합 이미지를 캡처하기 위해 현미경에 연결된 디지털 카메라를 사용한다. 개별 구조물의 길이의 범위가 관찰됩니다. </li></ol></li><li> 특성화 및 biocomposites 합성 후 검사의 경우 4 ℃에서 저장 한 후, 플라스크 현미경 이미징을 수행하는 동안 집중 효과가 모호합니다 냉장고에서 제거에 처음 응축을 형성하므로 플라스크 적어도 15 분 동안 실온으로 올 수 있습니다. RT로 평형을 허용 한 후, 현미경 이미징 품질을 최대화하기 위해 깨끗한 종이 타월로 플라스크의 상부 및 하부 표면을 닦아. </li><li> 냉장고에있는 동안 형성 복합 재료의 덩어리를 떼어 놓다 30 초 동안 장기 저장되어있는 또는 영상 복합, 소용돌이 플라스크를 작업 할 때. 텍싱 후, 반전 마이크와 구조를 검사roscope는 집계가 해리했는지 확인하고 필요 텍싱 반복합니다. </li><li> CNPS를 사용하여 주어진 실험 합성의 효능을 평가하기 위해 반전 된 백색광 현미경을 사용한다. 예를 들어, 합성시와 같은 다른 파라미터를 가지는 플라스크에서 CNP 유래 biocomposites 사용 합성 플라스크 CNPS 미 반응의 유무를 기록. 개별 CNPS는 광학 현미경으로 관찰하기에 너무 작지만 미 CNP은 높은 종횡비, 선형 형태를 가질 것이다 성공적으로 합성 CNP 합성물 달리, 둥근 모양과 어두운 객체로 나타난다 집계 한 참고 서로 다른 길이의 범위를해야합니다. 이것이 일단 형성되면 개별 구조로 분산시키는 것이 곤란하다 고도로 분지 &quot;게&quot;형 구조물을 초래할 것 같은 종료 전에 일정 기간 너무 오랫동안 합성을 수행 피한다. </li><li> 효능을 평가하기 위해 반전 하얀 빛 현미경을 사용하여황산구리를 사용하여 주어진 실험 합성. 황산동이 프로토콜을 이용하여 용액에 완전히 나가기 때문에, 용액을 사용 CNPS 합성 용액으로부터보다 어둡게 나타날 것이다. 이러한 종료​​ 전에 합성 시간으로서 다른 합성 조건에 플라스크를 비교하여 황산구리 복합체의 크기와 정도를 문서화. 참고 : 성공적으로 합성 된 복합 재료가 서로 다른 길이의 범위를 표시합니다. 이 &quot;성게 같은&quot;구조 될 것입니다 일부 복합의 높은 분기 집계 결과 바와 같이, 종료 전에 시간의 기간이 너무 오래 합성을 수행하지 않도록하고있는 일단 형성되면 개별 구조로 분산하기가 어렵습니다 . </li></ol></li><li> biocomposites를 합성 후, 원심 분리 튜브에서 원심 복합 솔루션을 집중. 15 ㎖의 원심 분리 관에 CNP 유래 구조 또는 구리 황산 파생 구조 중 6 ML을 추가합니다. 10 분 동안 원심 분리기RT 500 XG에 펠릿을 형성 하였다. 작은 볼륨의 경우, 0.6 ml의 크기의 튜브에 솔루션 구조의 500 μl를 추가합니다. 적어도 10 분 동안 실온에서 2000 XG에 원심 펠렛을 형성 하였다. <ol><li> 충분한 시간 동안 (microfuges 적어도 10 분)을 원심 분리 한 후, 구조가 심하게 펠릿 상기 상등액을 제거하여 농축 튜브의 하단에 관찰 된 펠릿을 저장한다. 구리 황산에서 파생 Biocomposite 구조는 색상과 CNPS에서 파생 된 구조의 청색 어두운 (검정 회색)되어 나타납니다. </li><li> 이 튜브에 더 많은 복합 재료를 추가하고 필요한 경우 구조를 집중하기 위해 동일한 튜브의 과정을 반복한다. 농축 된 알약을 분산하기 위해 10 ~ 30 초 동안 원하는 튜브 용액의 부피, 소용돌이를 추가합니다. </li></ol></li><li> 초음파 처리 구조는 한번 값을 낮추는 구조의 인구 평균 크기 (길이)를 이동하도록 형성되어있다. 르 멸균 탈 이온수 및 초음파 처리에 넣어 구조AST 10 분. 시간이 지남에 따라이 공정을 이용하여, 구조가 단편화 및 평균 길이 (텍스트도 6 참조)에서 작아진다. 역 하얀 빛 현미경과 디지털 카메라를 사용하여 서로 다른 초음파 시간과 복합 크기의 문서 변경. </li></ol>

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CNPS 포함 된 나노 물질의 잠재적 인 독성을 평가하는 동안, 이것은 장기적, CNPS는 큰 응집 형태로 초기에 더 분산 미립자 분포 (도 2)로 형질 전환시키고 있음을 관찰 하였다. 일부의 경우, 생물학적 조건 하에서 세포 배양 접시에서 생산 된 이러한 고도로 응집 된 구조물은 &quot;게&quot;를 포함하는 전술 구리 연상시키는 중앙 집합체에서 높은 선형 돌기를 형성 6. 그것은 여기에 나타낸 조건, CNPS 농도 따라서 배양에서 세포의 전부 사망하지 서브 최대였다 세포에 첨가 될 수 있음을 지적한다 (도 2 참조). 이러한 초기 관찰로부터, 실험은 합성에 필요한 O 나머지 주요 구성 요소를 찾기 위해 (그 자체를 포함하여 최종적으로 세포) 세포 배양 조건의 연속 이상의 성분을 제거함으로써 계속 하였다F 선형 구리 biocomposites. 우리는 시스틴, 원래 세포 배양 물의 보충 성분...

구리는 생물학 세계에서 일부 효소 기능 1,2에 필수적인 고반응성 금속이지만 더 높은 농도에서는 나노 입자 형태 3,4를 포함하여 강력하게 독성이 있습니다. 구리 독성에 대한 우려는 나노 구조의 표면적/질량이 증가하기 때문에 CNP 및 기타 구리 기반 나노 물질이 사용됨에 따라 더욱 관련성이 높아졌습니다. 따라서 나노 입자 형태의 작은 구리 덩어리조차도 세포를 관통하고 반응성 형태로 분해되는 능력으로 인해 국소 독성을 유발할 수 있습니다. 일부 생물학적 종은 금속 이온과 복합하고 킬레이트화할 수 있으며, 해양 홍합 5에서 설명한 것처럼 금속 이온을 생물학적 구조에 통합할 수도 있습니다. 나노 물질 4의 잠재적 독성 효과를 연구하는 과정에서 시간이 지남에 따라 일반적인 세포 배양에 사용되는 생물학적 조건(37°C 및 5% CO2)에서 높은 종횡비(선형) 구조로 안정적인 구리 생체 복합체를 형성할 수 있음이 발견되었습니다.
제거 과정을 통해 완전한 세포 배양 배지에서 발생한 이러한 선형 생체 복합체의 초기 발견은 생체 복합체가 자체 조립되는 데 필요한 필수 원소의 정의된 프로토콜로 단순화되었습니다. 두 가지 유형의 고선형 생체 복합체의 자가 조립은 1) CNP 및 2) 황산구리의 두 가지 시작 금속 성분으로 가능한 것으로 밝혀졌으며, 일반적인 생물학적 성분은 시스틴입니다. 나노 스케일 및 마이크로 스케일 기능을 가진 더 복잡하고 소위 "성게"및 "나노 플라워"유형 구리 함유 구조가 이전에 보고되었지만, 이들은 100 ° C 이상의 온도 6-8과 같은 비 생물학적 조건에서 생산되었습니다. 우리가 아는 한, 생물학적 조건에서 액상으로 확장 가능한 개별적인 선형 구리 함유 나노 구조의 합성은 이전에 설명되지 않았습니다. 
나노복합체의 합성에 사용되는 출발 물질 중 하나인 CNP는 이전에 세포 4에 매우 독성이 있는 것으로 보고되었습니다. 나노 복합체가 형성 된 후, 이러한 구조는 시작 NP 9 보다 질량 기준으로 독성이 적다는 것이 최근에 보고되었습니다. 따라서, 여기에 설명 된 합성은 NP 형태를 더 큰 구조로 변형시키고 세포에 덜 독성이있는 복합체를 생성한다는 의미에서 반응성 구리 종을 안정화하는 데 유용성이 있는 생물학적 및 생화학적 반응에서 파생될 수 있습니다. 
생물학적 액체 매체와의 상호 작용 시 응집되거나 응집되는 것으로 알려진 다른 많은 나노 물질 형태와 대조적으로, 10,11, 일단 형성되면, 여기에 설명된 고선형 복합체는 이전에 보고된 전하의 재분포로 인해 응집을 피합니다 9. 본 연구에서 상세히 기술된 바와 같이, 이러한 응집의 회피는 적어도 3가지 이유로 한 번 형성된 구조로 작업하는 목적에 편리하다: 1) 일단 형성된 복합 구조는 원심분리를 사용하여 농축될 수 있고 와류 혼합을 사용하여 다시 쉽게 분산될 수 있다. 2) 형성된 구조는 다른 기간 동안 초음파 처리에 의해 평균 크기를 줄일 수 있습니다. 및 3) 형성된 선형 구조체는 최근에 기술된 "커피 링 효과"(12)를 피하기 위한 추가 도구를 제공할 수 있으며, 따라서 재료, 특히 구형 미립자를 포함하는 재료의 보다 균일하게 분포된 코팅을 생성하기 위한 도펀트를 제공할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>Mini Vortexer</td><td>VWR (https://us.vwr.com)</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터 모델 # 2425-2</td><td>VWR (https://us.vwr.com)</td><td>판매자에게 문의</td><td>현재 모델 calalog # 98000-360</td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge)</td><td>Labnet (http://labnetinternational.com/)</td><td>C2500-R</td><td>모델 Prism R</td></tr><tr><td>세포 배양 원심분리기 모델 Z323K</td><td>Labnet (http://labnetinternational.com/)</td><td>판매자 연락처</td><td>현재 모델 Z206A 카탈로그 # C0206-A</td></tr><tr><td>초음파 발생기 (초음파 세척기)</td><td>Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/)</td><td>1510R-MTH</td><td></td></tr><tr><td>밸런스</td><td>Sartorius (http://dataweigh.com)</td><td></td><td>모델 CP225D 유사한 모델</td></tr><tr><td>CPA225D Olympus IX51 도립 광 현미경</td><td>Olympus ( http://olympusamerica.com</td><td>공급 업체</td><td></td>에 문의</tr><tr><td>Olympus DP71 현미경 디지털 카메라</td><td>Olympus (http://olympusamerica.com</td><td>공급 업체</td><td></td>에 문의</tr><tr><td>외부 전원 공급 장치 - Olympus 현미경 용 백색광</td><td>Olympus (http://olympusamerica.com</td><td>TH4-100</td><td></td></tr><tr><td>10X, 20X 및 40X 현미경 대물렌즈</td><td>Olympus (http://olympusamerica.com</td><td>공급 업체</td><td></td>에 문의</tr><tr><td>주사 전자 현미경</td><td>Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html)</td><td>모델 S-4800</td><td></td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html)</td><td>모델 Libra 120</td><td></td></tr><tr><td>테이블 탑 워크 스테이션 단방향 흐름 클린 벤치</td><td>Envirco (http://envirco-hvac.com)</td><td>모델 PNG62675</td><td>멸균 세포 배양에 사용 기술</td></tr></tbody></table>

생물 액체 배지에서 확장 성, 금속 높은 가로 세로 비율 나노 복합 재료의 생성

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

이 프로토콜의 목적은 높은 종횡비 구조를 갖는 두 개의 신규 biocomposites의 합성을 설명하는 것이다. biocomposites 구리 나노 입자 (CNPS) 또는 금속 성분을 기여 황산구리 중 하나와, 구리 및 시스틴 이루어져있다. 합성 생물학적 조건 (37 ° C)와 24 시간 후의 자기 조립 복합 형태 하에서 액상에서 수행된다. 형성되면, 이러한 복합 재료는 모두 액체 매체와 건조 폼에서 매우 안정적이다. 복합 길이 범위를 마이크로 -하는 나노에서 확장, 몇 미크론에서 직경 25 nm의. 에너지 분산 형 X 선 분광법 (EDX)을 전계 방출 주사 전자 현미경은 따라서 최종 나노 복합 재료에서의 황 원으로서 시스테인을 확인, 출발 CNP 재료 결석 동안 황, NP 유래의 선형 구조 내에 존재하는 것을 입증 . 이러한 선형 나노 및 마이크로 복합 재료의 합성, STR의 길이의 다양한 중uctures는 합성 용기 내에서 형성된다. 합성 후 액상 혼합물의 초음파 처리는 초음파 처리 시간 증가로 평균 길이를 감소하여 구조물의 평균 크기를 제어하는​​데 도움이 입증되었다. 형성된 구조는 고도로 응집하지 않는 안정한 액상이 형성되어 있기 때문에, 원심 분리는 또한 집중 형성된 복합체 편석을 돕기 위해 사용될 수있다.

도 1은 본 연구에서 설명한 선형 biocomposites을 형성하는 합성 단계의 흐름도의 개략을 나타낸다. 출발 원료로 CNPS 또는 황산구리는 2 ㎎ / ㎖ 용액을 형성하기 위해 멸균 수와 함께,이 용액을 혼합하고 균일 혼합을 제공하는 초음파 처리하고,이 구리 용액을 합성에 대해 다음과 같은 비율로 혼합되어있다 : 949 부 멸균 물 : 50 부 구리 혼합물 : 1 부 시스틴 원액. 실제 볼륨은 확장 또는 최종 합성 수율을 확장 할 수있는 이러한 비율에 따라 증가 또는 감소 할 수있다. 시간이 지남에 따라 모양이 액체 용액 변화에 따라 정상 백색광 또는 현미경 하에서 육안으로 관찰 할 수있는 표시, 선형 biocomposite 구조가 형성된 적어도 2 시간 동안 배양 한 후. 도 2는 전체 세포 배양 매체 O 이러한 선형 구조물의 초기 탐색에서 대표적인 결과를 나타낸다82 시간의 기간을 VER. 우리의 실험은 세...

여기서 우리는 생물학적 조건하에 액체 배지에서 신규 한 고 종횡비 biocomposites를 합성 프로토콜을 제시한다. biocomposites 각각의 직경 및 길이에서 마이크로 나노 미터 스케일. 시스틴 결합 구리 나노 입자 (CNPS) 및 황산구리는 합성 용 핵심 부품이다.

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

본 절차의 전반적인 목표는 구리 함유 출발 물질과 시스테인을 사용하여 선형의 높은 종횡비를 가진 마이크로 및 나노 복합체를 제조하는 것입니다. 이는 먼저 초음파 처리된 구리 나노입자 또는 황산구리를 시스틴 및 물과 함께 멸균된 통기성 배양 플라스크에 혼합함으로써 수행됩니다. 합성의 두 번째 단계는 혼합된 성분이 담긴 플라스크를 37 °C의 5% CO2 인큐베이터에 최소 6시간 동안 두는 것입니다.다음으로, 플라스크를 육안과 백색광 현미경으로 관찰합니다. 선형 구조의 형성 정도를 결정하기 위한 마지막 단계는 합성 플라스크를 4 °C로 유지되는 냉장고에 넣어 합성을 종료하는 것입니다. 최종적으로, 디지털 현미경을 사용하여 합성된 구조를 분석합니다. 전극 증착과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 액체 상태에서 합성을 쉽게 확장할 수 있으며, 공정이 생체 조건에서 진행된다는 점입니다.합성된 구조체는 세포에 의해 분해될 수 있어 잠재적으로 약물 전달 수단을 제공할 수 있으므로, 이 기술의 영향은 암과 같은 질병의 치료나 진단으로 확장될 수 있습니다. 저는 서로 다른 나노물질의 잠재적 독성을 조사하는 실험을 수행하던 중 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다. 최종 합성 단계는 습득하기 어려울 수 있으므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.절차가 부정확할 경우 구조체가 응집되거나 전혀 형성되지 않을 수 있습니다. 구리 나노입자 또는 CMP를 사용하여 자가 조립 합성을 수행하려면, CMP를 최소 2 mg 측정하여 구리 나노입자 용액을 준비하십시오. 이 단계에서는 CMP가 피부에 닿는 것을 방지하기 위해 일회용 장갑을 착용하십시오.나노입자를 빈 멸균 16 milliliter 유리 바이알 또는 CMP가 포함된 바이알에 넣습니다. 2 mg/mL 농도의 용액이 되도록 적절한 양의 멸균 탈이온수를 추가하고, 합성을 시작하기 전 나노입자를 분산시키기 위해 용액을 20초 동안 볼텍싱합니다. 물을 바이알의 절반 이상 채우지 마십시오. 이는 합성을 저해할 수 있습니다.볼텍싱으로 혼합하면 CMP가 바이알 바닥으로 빠르게 가라앉으며 색상이 어둡게 변합니다. 합성 시작 전 CMP의 분산도를 최대화하기 위해 CNP 용액을 실온에서 17분 동안 초음파 처리하십시오. 초음파 처리에 의해 CMP가 잘 혼합되고 있는지 주기적으로 확인하십시오. 초음파 처리가 성공적으로 완료되면 CMP는 최소 30분 동안 용액 속에 부유 상태를 유지하며, 용액의 색상은 어둡게 나타납니다.합성을 위해 cystine 7.29 milligrams를 정밀하게 측정합니다. cystine은 물에 직접 용해되지 않으므로, 정전기 방지 칭량 용기에 담긴 cystine을 cysteine이 들어 있는 칭량 용기로 옮깁니다. cystine이 완전히 용해되어 72.9 milligram per milliliter 농도의 용액이 되도록 멸균된 1 molar sodium hydroxide를 충분한 부피로 첨가합니다.cysteine을 100 µL의 1 M 수산화나트륨에 완전히 용해시킵니다. 그런 다음, 용해된 cysteine 7 µL를 멸균 합성 플라스크에 담긴 6,643 µL의 멸균수와 혼합합니다. 혼합 용액이 담긴 플라스크의 캡을 통기시켜 효과적으로 혼합될 수 있도록 한 상태로, 37 °C 인큐베이터에 30분 동안 보관합니다.이것이 시스테인 작업 용액이 됩니다. 7 mL의 총 합성 부피에 대해, 초음파 처리 단계 이후 CMP가 가라앉았을 것이므로 2 mg/mL CNP 용액을 30초 동안 Vortexing하여 재현탁하십시오. 시스테인 작업 용액을 25 cm² 세포 배양 플라스크로 옮기고 재현탁된 CMP 350 µL를 추가하십시오.플라스크의 캡을 닫고 단단히 조입니다. 합성에 필요한 모든 성분을 혼합한 후, 플라스크를 4~5회 부드럽게 회전시켜 섞어줍니다. 플라스크를 이산화탄소 배양기에 넣고, 캡을 약간 풀어 플라스크 내부와 외부 사이에 가스 교환이 이루어지도록 통기시킵니다.합성 과정 동안, 인큐베이터에서 약 24시간 동안 합성을 진행하십시오. 합성 중에 현미경 관찰 및 육안을 통해 고도로 선형인 복합체의 형성을 확인할 수 있습니다. 이 단계는 일부 구조가 형성되고 있는지 확인하고, 자기 조립 과정이 너무 오래 지속되지 않도록 하는 데 매우 중요합니다.플라스크 내에 선형 구조가 관찰되면 합성 플라스크의 캡을 단단히 닫아 바이오 복합체 합성을 종료하고, 합성 및 배양에 사용된 날짜와 종료 전 합성 시간을 포함한 합성 조건을 플라스크에 라벨링합니다. 이후 생성된 구조가 이 형태로 최소 1년 동안 안정적으로 유지되므로 용기를 냉장고에 보관합니다. 또는 황산구리를 사용하여 자기 조립 합성을 수행하려면, 멸균 기술을 사용하여 CMPs를 황산구리염으로 교체하고, 최소 2 mg의 황산구리를 충분한 부피의 멸균 탈이온수에 녹여 2 mg/mL 용액을 제조합니다.이 농도에서 황산구리 결정은 쉽게 용해되지만, 필요한 경우 바이알을 볼텍싱하고 황산구리 조제 후 모든 결정이 용해되었는지 육안으로 확인하십시오. 방금 시연한 것과 동일하게 합성을 수행하되, CMP를 황산구리로 대체하십시오. 백색광 현미경과 전자 현미경을 사용하여 CMP 유래 바이오 복합체와 황산구리 유래 바이오 복합체의 특성을 분석하고 검사하십시오.백색광 현미경을 이용한 Parasynthesis 관찰에는 도립 현미경을 사용합니다. 플라스크를 평평하게 눕히면 몇 분 내에 복합체가 플라스크 바닥면으로 가라앉으며, 이후 초점을 맞출 수 있습니다. 바이오 복합체와 액체 배지 사이의 대비를 최대화하기 위해 현미경의 명시야 설정을 사용하십시오. CMP와 황산구리에서 유래한 복합체는 모두 투명하거나 불투명한 색으로 나타나지만, 반응하지 않은 CNP 응집체는 매우 어두운 색으로 나타납니다.도립 백색광 현미경을 사용하여 주어진 실험의 합성 효율을 평가하십시오. 예를 들어, 합성 과정에서 미반응 CMP의 존재 여부를 기록하십시오. 배양 시간이나 초음파 처리 시간과 같은 서로 다른 매개변수가 적용된 플라스크에서 CNP 유래 바이오 복합체를 얻은 플라스크들을 분석하십시오.개별 CMP는 광학 현미경으로 관찰하기에는 너무 작지만, 반응하지 않은 CNP 응집체는 둥근 모양의 어두운 물체로 나타납니다. 이는 높은 종횡비와 선형 형태를 가지며 길이가 다양하게 나타나는 성공적으로 합성된 CNP 복합체와 대조적입니다. 반응 종결 전 합성 시간을 너무 길게 유지하지 마십시오. 합성 시간이 너무 길어지면 매우 분지된 성게 모양의 구조가 형성되며, 일단 형성된 이러한 구조는 개별 구조로 분산시키기 어렵습니다.또한 황산구리를 사용한 특정 실험에서 합성 효율을 평가하기 위해 도립 백색광 현미경을 사용하십시오. 본 프로토콜을 사용하면 황산구리가 완전히 용해되므로, 용액이 CMP를 이용한 합성 용액보다 덜 어둡게 보일 것입니다.종료 전 합성 시간과 같은 서로 다른 합성 조건의 플라스크들을 비교하여 황산구리 복합체의 크기와 범위를 기록하십시오. 바이오 복합체를 먼저 농축하려면, CNP 유래 구조체 또는 황산구리 유래 구조체 6 mL를 15 mL 원심분리 튜브에 넣으십시오. 소량의 부피에서 펠렛을 형성하기 위해 실온에서 500 ×g로 10분 동안 원심분리하십시오.용액 상태의 구조체 500 µL를 0.6 mL 튜브에 넣고, 2000 ×g의 원심력과 상온에서 최소 10분 동안 원심분리하여 펠릿을 형성합니다. 구조체를 멸균된 탈이온수에 넣고 최소 10분 동안 초음파 처리하여 재부유시킵니다. 이 과정을 반복하면 구조체가 단편화되어 평균 길이가 짧아집니다.정립 백색광 현미경과 디지털 카메라를 사용하여 서로 다른 초음파 처리 시간에 따른 복합체 크기의 변화를 기록하였습니다. 세포 배양 배지 내 바이오 복합체 발견에 대한 대표적인 결과에 따르면, 초기 82시간 동안 CMP의 균일한 분산 상태가 미세 구조로 응집되는 것이 확인되었습니다. 시간이 지남에 따라 입자들이 제거되고 더 큰 응집체가 형성됩니다. 최종적으로 선형 구조를 가진 더 큰 응집체들이 나타나며 성게 모양의 구조를 형성합니다.CMP의 선형 바이오 복합체로의 전환 과정이 제시되어 있습니다. CMP를 초기 균일 분산 상태에서 시스테인 및 물과 결합시켰습니다. 3시간 후 응집체가 미세 구조를 형성하며, 6시간 후에는 중간 구조가 형성됩니다.전자 현미경을 통해 높은 종횡비 구조가 형성됩니다. 합성된 바이오 복합체의 특성 분석 결과, 투과 전자 현미경(TEM)에서는 CNP 출발 물질이 선형 복합체를 형성하며 시작되는 것이 확인되었으며, 주사 전자 현미경(SEM)에서는 CMPs 출발 물질이 원형임을 보여줍니다. CMPs와 시스테인으로 형성된 복합체의 나노 및 마이크로 특징이 SEM을 통해 나타나 있습니다.황산구리와 시스테인으로 형성된 복합체의 특징 또한 SEM 에너지 분산형 X선 분광법으로 묘사되었습니다. 출발 물질과 합성된 선형 성분의 원소 분석 결과가 나타나 있습니다. 출발 CMP는 황이 없는 뚜렷한 구리 피크를 보여줍니다.CMP와 시스틴으로 제조한 바이오 복합체는 시스틴 기반의 황산구리로부터 기인한 황 및 탄소 피크의 출현을 보여줍니다. 해당 재료는 구리와 황의 피크를 나타냅니다. 황산구리와 시스틴으로 제조한 바이오 복합체는 시스틴으로 인한 탄소 피크의 출현을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면, 12~24시간 내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 합성된 구조체가 과도하게 응집되지 않도록 육안과 현미경 모두로 합성 진행 상황을 모니터링하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 합성된 구조체가 세포에 결합하는지 여부와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 구조체의 형광 표지와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 합성을 위한 시약 준비 방법, 시약의 올바른 혼합 방법, 합성 진행 상황 모니터링 방법, 그리고 합성 후 구조체의 농축 및 변형 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Bioengineering

생명공학

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