생물 액체 배지에서 확장 성, 금속 높은 가로 세로 비율 나노 복합 재료의 생성

본 절차의 전반적인 목표는 구리 함유 출발 물질과 시스테인을 사용하여 선형의 높은 종횡비를 가진 마이크로 및 나노 복합체를 제조하는 것입니다. 이는 먼저 초음파 처리된 구리 나노입자 또는 황산구리를 시스틴 및 물과 함께 멸균된 통기성 배양 플라스크에 혼합함으로써 수행됩니다. 합성의 두 번째 단계는 혼합된 성분이 담긴 플라스크를 37 °C의 5% CO2 인큐베이터에 최소 6시간 동안 두는 것입니다.

다음으로, 플라스크를 육안과 백색광 현미경으로 관찰합니다. 선형 구조의 형성 정도를 결정하기 위한 마지막 단계는 합성 플라스크를 4 °C로 유지되는 냉장고에 넣어 합성을 종료하는 것입니다. 최종적으로, 디지털 현미경을 사용하여 합성된 구조를 분석합니다. 전극 증착과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 액체 상태에서 합성을 쉽게 확장할 수 있으며, 공정이 생체 조건에서 진행된다는 점입니다.

합성된 구조체는 세포에 의해 분해될 수 있어 잠재적으로 약물 전달 수단을 제공할 수 있으므로, 이 기술의 영향은 암과 같은 질병의 치료나 진단으로 확장될 수 있습니다. 저는 서로 다른 나노물질의 잠재적 독성을 조사하는 실험을 수행하던 중 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다. 최종 합성 단계는 습득하기 어려울 수 있으므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

절차가 부정확할 경우 구조체가 응집되거나 전혀 형성되지 않을 수 있습니다. 구리 나노입자 또는 CMP를 사용하여 자가 조립 합성을 수행하려면, CMP를 최소 2 mg 측정하여 구리 나노입자 용액을 준비하십시오. 이 단계에서는 CMP가 피부에 닿는 것을 방지하기 위해 일회용 장갑을 착용하십시오.

나노입자를 빈 멸균 16 milliliter 유리 바이알 또는 CMP가 포함된 바이알에 넣습니다. 2 mg/mL 농도의 용액이 되도록 적절한 양의 멸균 탈이온수를 추가하고, 합성을 시작하기 전 나노입자를 분산시키기 위해 용액을 20초 동안 볼텍싱합니다. 물을 바이알의 절반 이상 채우지 마십시오. 이는 합성을 저해할 수 있습니다.

볼텍싱으로 혼합하면 CMP가 바이알 바닥으로 빠르게 가라앉으며 색상이 어둡게 변합니다. 합성 시작 전 CMP의 분산도를 최대화하기 위해 CNP 용액을 실온에서 17분 동안 초음파 처리하십시오. 초음파 처리에 의해 CMP가 잘 혼합되고 있는지 주기적으로 확인하십시오. 초음파 처리가 성공적으로 완료되면 CMP는 최소 30분 동안 용액 속에 부유 상태를 유지하며, 용액의 색상은 어둡게 나타납니다.

합성을 위해 cystine 7.29 milligrams를 정밀하게 측정합니다. cystine은 물에 직접 용해되지 않으므로, 정전기 방지 칭량 용기에 담긴 cystine을 cysteine이 들어 있는 칭량 용기로 옮깁니다. cystine이 완전히 용해되어 72.9 milligram per milliliter 농도의 용액이 되도록 멸균된 1 molar sodium hydroxide를 충분한 부피로 첨가합니다.

cysteine을 100 µL의 1 M 수산화나트륨에 완전히 용해시킵니다. 그런 다음, 용해된 cysteine 7 µL를 멸균 합성 플라스크에 담긴 6,643 µL의 멸균수와 혼합합니다. 혼합 용액이 담긴 플라스크의 캡을 통기시켜 효과적으로 혼합될 수 있도록 한 상태로, 37 °C 인큐베이터에 30분 동안 보관합니다.

이것이 시스테인 작업 용액이 됩니다. 7 mL의 총 합성 부피에 대해, 초음파 처리 단계 이후 CMP가 가라앉았을 것이므로 2 mg/mL CNP 용액을 30초 동안 Vortexing하여 재현탁하십시오. 시스테인 작업 용액을 25 cm² 세포 배양 플라스크로 옮기고 재현탁된 CMP 350 µL를 추가하십시오.

플라스크의 캡을 닫고 단단히 조입니다. 합성에 필요한 모든 성분을 혼합한 후, 플라스크를 4~5회 부드럽게 회전시켜 섞어줍니다. 플라스크를 이산화탄소 배양기에 넣고, 캡을 약간 풀어 플라스크 내부와 외부 사이에 가스 교환이 이루어지도록 통기시킵니다.

합성 과정 동안, 인큐베이터에서 약 24시간 동안 합성을 진행하십시오. 합성 중에 현미경 관찰 및 육안을 통해 고도로 선형인 복합체의 형성을 확인할 수 있습니다. 이 단계는 일부 구조가 형성되고 있는지 확인하고, 자기 조립 과정이 너무 오래 지속되지 않도록 하는 데 매우 중요합니다.

플라스크 내에 선형 구조가 관찰되면 합성 플라스크의 캡을 단단히 닫아 바이오 복합체 합성을 종료하고, 합성 및 배양에 사용된 날짜와 종료 전 합성 시간을 포함한 합성 조건을 플라스크에 라벨링합니다. 이후 생성된 구조가 이 형태로 최소 1년 동안 안정적으로 유지되므로 용기를 냉장고에 보관합니다. 또는 황산구리를 사용하여 자기 조립 합성을 수행하려면, 멸균 기술을 사용하여 CMPs를 황산구리염으로 교체하고, 최소 2 mg의 황산구리를 충분한 부피의 멸균 탈이온수에 녹여 2 mg/mL 용액을 제조합니다.

이 농도에서 황산구리 결정은 쉽게 용해되지만, 필요한 경우 바이알을 볼텍싱하고 황산구리 조제 후 모든 결정이 용해되었는지 육안으로 확인하십시오. 방금 시연한 것과 동일하게 합성을 수행하되, CMP를 황산구리로 대체하십시오. 백색광 현미경과 전자 현미경을 사용하여 CMP 유래 바이오 복합체와 황산구리 유래 바이오 복합체의 특성을 분석하고 검사하십시오.

백색광 현미경을 이용한 Parasynthesis 관찰에는 도립 현미경을 사용합니다. 플라스크를 평평하게 눕히면 몇 분 내에 복합체가 플라스크 바닥면으로 가라앉으며, 이후 초점을 맞출 수 있습니다. 바이오 복합체와 액체 배지 사이의 대비를 최대화하기 위해 현미경의 명시야 설정을 사용하십시오. CMP와 황산구리에서 유래한 복합체는 모두 투명하거나 불투명한 색으로 나타나지만, 반응하지 않은 CNP 응집체는 매우 어두운 색으로 나타납니다.

도립 백색광 현미경을 사용하여 주어진 실험의 합성 효율을 평가하십시오. 예를 들어, 합성 과정에서 미반응 CMP의 존재 여부를 기록하십시오. 배양 시간이나 초음파 처리 시간과 같은 서로 다른 매개변수가 적용된 플라스크에서 CNP 유래 바이오 복합체를 얻은 플라스크들을 분석하십시오.

개별 CMP는 광학 현미경으로 관찰하기에는 너무 작지만, 반응하지 않은 CNP 응집체는 둥근 모양의 어두운 물체로 나타납니다. 이는 높은 종횡비와 선형 형태를 가지며 길이가 다양하게 나타나는 성공적으로 합성된 CNP 복합체와 대조적입니다. 반응 종결 전 합성 시간을 너무 길게 유지하지 마십시오. 합성 시간이 너무 길어지면 매우 분지된 성게 모양의 구조가 형성되며, 일단 형성된 이러한 구조는 개별 구조로 분산시키기 어렵습니다.

또한 황산구리를 사용한 특정 실험에서 합성 효율을 평가하기 위해 도립 백색광 현미경을 사용하십시오. 본 프로토콜을 사용하면 황산구리가 완전히 용해되므로, 용액이 CMP를 이용한 합성 용액보다 덜 어둡게 보일 것입니다.

종료 전 합성 시간과 같은 서로 다른 합성 조건의 플라스크들을 비교하여 황산구리 복합체의 크기와 범위를 기록하십시오. 바이오 복합체를 먼저 농축하려면, CNP 유래 구조체 또는 황산구리 유래 구조체 6 mL를 15 mL 원심분리 튜브에 넣으십시오. 소량의 부피에서 펠렛을 형성하기 위해 실온에서 500 ×g로 10분 동안 원심분리하십시오.

용액 상태의 구조체 500 µL를 0.6 mL 튜브에 넣고, 2000 ×g의 원심력과 상온에서 최소 10분 동안 원심분리하여 펠릿을 형성합니다. 구조체를 멸균된 탈이온수에 넣고 최소 10분 동안 초음파 처리하여 재부유시킵니다. 이 과정을 반복하면 구조체가 단편화되어 평균 길이가 짧아집니다.

정립 백색광 현미경과 디지털 카메라를 사용하여 서로 다른 초음파 처리 시간에 따른 복합체 크기의 변화를 기록하였습니다. 세포 배양 배지 내 바이오 복합체 발견에 대한 대표적인 결과에 따르면, 초기 82시간 동안 CMP의 균일한 분산 상태가 미세 구조로 응집되는 것이 확인되었습니다. 시간이 지남에 따라 입자들이 제거되고 더 큰 응집체가 형성됩니다. 최종적으로 선형 구조를 가진 더 큰 응집체들이 나타나며 성게 모양의 구조를 형성합니다.

CMP의 선형 바이오 복합체로의 전환 과정이 제시되어 있습니다. CMP를 초기 균일 분산 상태에서 시스테인 및 물과 결합시켰습니다. 3시간 후 응집체가 미세 구조를 형성하며, 6시간 후에는 중간 구조가 형성됩니다.

전자 현미경을 통해 높은 종횡비 구조가 형성됩니다. 합성된 바이오 복합체의 특성 분석 결과, 투과 전자 현미경(TEM)에서는 CNP 출발 물질이 선형 복합체를 형성하며 시작되는 것이 확인되었으며, 주사 전자 현미경(SEM)에서는 CMPs 출발 물질이 원형임을 보여줍니다. CMPs와 시스테인으로 형성된 복합체의 나노 및 마이크로 특징이 SEM을 통해 나타나 있습니다.

황산구리와 시스테인으로 형성된 복합체의 특징 또한 SEM 에너지 분산형 X선 분광법으로 묘사되었습니다. 출발 물질과 합성된 선형 성분의 원소 분석 결과가 나타나 있습니다. 출발 CMP는 황이 없는 뚜렷한 구리 피크를 보여줍니다.

CMP와 시스틴으로 제조한 바이오 복합체는 시스틴 기반의 황산구리로부터 기인한 황 및 탄소 피크의 출현을 보여줍니다. 해당 재료는 구리와 황의 피크를 나타냅니다. 황산구리와 시스틴으로 제조한 바이오 복합체는 시스틴으로 인한 탄소 피크의 출현을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면, 12~24시간 내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, 합성된 구조체가 과도하게 응집되지 않도록 육안과 현미경 모두로 합성 진행 상황을 모니터링하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 합성된 구조체가 세포에 결합하는지 여부와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 구조체의 형광 표지와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 합성을 위한 시약 준비 방법, 시약의 올바른 혼합 방법, 합성 진행 상황 모니터링 방법, 그리고 합성 후 구조체의 농축 및 변형 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.