인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자의 과발현에 의해 직접 Hemogenic 내피 세포의 유도 및 혈액

이 절차의 전반적인 목표는 전사 인자의 강제 발현을 통해 인간 만능 줄기 세포에서 적혈구 및 골수성 혈액 세포를 생성하는 것입니다. 이 방법은 내피에서 hepo로의 전이 및 hepo 발달 및 사양의 전사 조절에 대한 연구를 위해 혈액 세포에서 균질성 내피 생성에 적용 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이 방법이 인간 preport 줄기 세포에서 동질성 내피 유도의 비효율적이고 빠른 수단을 제공하고 세포 배양 접시에서 내피 헤미 전이를 관찰할 수 있다는 것입니다.

Dr.Lin의 연구실에서 연구 조교로 일하고 있는 Dr.Bruske는 매트 젤과 같은 세포외 기질로 preco six wall plates를 시작하기 전에 제조업체의 지침에 따라 희석하여 well에 붓는 절차를 시연할 것입니다. 형질도입 배지를 위해 섭씨 37도에서 30-60분 동안 플레이트를 배양합니다. 먼저, 세포에 대한 바이러스의 예상 감염 다중도 또는 MOI가 세포당 하나의 바이러스가 되도록 각 형질도입 세트에 대해 렌티바이러스 부분 표본을 준비하고 섭씨 4도로 유지합니다.

다음으로, hbsc 바이러스에 대한 완전한 무혈청 배지 폴리 브레인을 최종 농도 밀리리터당 6마이크로그램으로, 암석 억제제 Y 2 7 6 3 2를 각 형질도입 세트에 대해 총 부피 1.3 밀리리터의 최종 농도 10 마이크로몰로 결합하고 혼합물을 얼음에 올려 세포를 준비합니다. 마지막 통과 후 약 4일 후에 70% 합류점에서 만능 줄기 세포를 건강한 배치로 시작합니다. 인간 만능 줄기세포가 맵에서 유지되는 경우, 형질도입 실험 전에 2-3개의 계대를 거치고 건강한 만능 줄기세포 배양을 나타내는 무영양 상태로 전달되어야 합니다.

자발적인 차별화가 없습니다. HPSC 배지를 흡입하고 6 웰 플레이트의 웰 당 Accutane과 같은 2 밀리리터의 염 분리 용액을 첨가하여 플레이트를 섭씨 37도에서 5 %로 배양하고 5-7 분 동안 이산화탄소를 배양합니다. 그런 다음 10 마이크로몰 암석 억제제가 있는 2밀리리터의 완전한 배지를 추가하고 분리된 세포를 수집합니다.

균질한 세포 현탁액을 준비한 후 작은 부분 표본을 취하고 Trian blue exclusion 방법으로 생존 가능한 세포를 계수합니다. 다음으로, 200배 G에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 펠릿을 10마이크로몰 암석 억제제로 3.4배의 최종 농도에서 밀리리터당 6개의 살아있는 세포에 재현탁합니다. 그런 다음 이전에 제조된 1.3ml 형질도입 배지 각각에 6개의 세포에 0.68 곱하기 10을 포함하는 200마이크로리터의 세포 현탁액을 추가합니다.

매트릭스 코팅된 6개의 벽 플레이트를 섭씨 37도에서 섭씨 온도로 제거합니다. 다음으로, 매트릭스 용액을 흡인하고 각 형질도입 혼합물을 웰로 옮기고 플레이트를 소용돌이쳐 웰에 세포를 고르게 분포시킵니다. 24시간.

형질도입 후 현미경으로 웰을 시각화하여 세포의 80% 이상이 부착되었는지 확인합니다. 바이러스 용액을 버리고 성장 인자가 없는 불완전한 배지로 부착된 세포를 세척합니다. 다음으로, 3 F.Medium이라고 하는 사이토카인이 보충된 배지 3ml를 세포에 첨가합니다.

다음 날 밤새 세포를 배양합니다. pur mycin의 밀리리터당 1마이크로그램을 포함하는 새로운 3개의 F 배지로 배지를 변경합니다. 잔류 nont 형질도입 세포를 제거합니다.

이 배지를 24시간마다 교체하여 죽은 세포를 제거하십시오. 치료 48시간 후, pur mycin을 중단하고 4일째에는 신선한 3F 배지만 사용하십시오. 형질도입 후, 혈구 내피 세포의 형성을 결정하기 위해 내피 형태를 가진 군집 세포의 출현을 현미경으로 관찰합니다.

먼저 배양 접시에서 3일 또는 4일 사이에 세포를 세포 분리 용액과 연결합니다. 분리된 세포를 완전한 배지에 모아 원심분리하고, 실온에서 최대 완충액에 세포를 재현탁시키고 혈구 분석기에서 세포를 계수한 다음 v catrin, CD 2 26, CD 73 및 CD 43의 검출에 적합한 항체로 염색 반응당 5번째 세포까지 1회 10회 배양합니다. 셀 표면 마커.

유세포분석 수행은 4일차의 텍스트 프로토콜에 설명되어 있습니다. 형질도입 후, 각 웰에서 배지의 절반을 교체하여 세포의 분화를 계속하고, 5일에서 7일 사이에 48시간마다 둥근 혈액 세포가 느슨하게 응집되어 나타나 내피 세포층 위에 다시 줄지어 나타납니다. 최대 14일 동안 배양을 유지하며, 이 기간 동안 부유 세포가 크게 확장되어야 합니다.

ETV 2, gata 1 및 ETV 2의 유세포 분석. Gata 2 transducted cell은 terin positive hemo endothelium의 형성을 보여주며, 이는 ETV 2, gata 1 및 ETV 2의 분화 유세포 분석의 3일에서 4일째에 CD 2 26의 발현과 CD 73 발현의 결핍으로 확인할 수 있습니다. Gata 2개의 형질도입 세포는 7일째에 혈액 세포를 발현하는 CD 43의 유도를 보여줍니다.

형질도입 후 14일째에 2개의 TAL 1개의 LMO 2개의 유도 세포의 형질도입 유세포 분석은 CD 2, 35 A 및 CD 41을 발현하는 혈액 세포의 형성을 보여주며, 2개의 TAL 1개의 LMO 2개의 유도 조혈 세포의 우측 염색 시토신 제제는 콜로니 형성 세포 분석에서 적혈구 대식세포 및 메가 카리오 산성 세포 형태를 보여주었습니다. 인간 만능 줄기 세포의 형질도입은 형질도입 절차를 수행하는 동안 한 시간 이내에 완료될 수 있습니다. 줄기세포 생존 가능성을 항상 고려하고, 반응 혼합물에 암석 억제제를 포함하고, 처음 3일 후에는 세포당 최적의 바이러스 양을 사용하는 것이 중요합니다.

Post transduction은 immuno staining, colon forming assay 및 유세포 분석과 같은 방법을 사용하여 분화의 효율성과 hemato dease 유형에 대한 질문에 답할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 인간 만능 줄기 세포를 화하고 감염시키는 방법과 처음 7-10일 이내에 배양을 분화할 때 무엇을 기대할 수 있는지 잘 이해하게 될 것입니다. 전사 인자(transcription factor)가 인간 줄기세포에 성공적으로 전달된 후, 세포는 효능을 잃고 점차적으로 조혈 운명에 처하게 됩니다.

따라서 연구자들은 내피에서 조혈로의 전이의 분자 메커니즘을 연구할 수 있는 편리한 시험관 내 모델을 갖게 될 것입니다. 렌티바이러스가 함유된 부위를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 개인 보호 장비를 착용하고 바이러스가 있는 부위를 적절하게 폐기하는 등의 예방 조치를 항상 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.