Name: 인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자의 과발현에 의해 직접 Hemogenic 내피 세포의 유도 및 혈액 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-03T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 배우세요 인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자 과발현을 이용해 조혈성 내피 세포와 다능성 조혈 전구체를 효율적으로 유도하는 방법을. 이 기술은 혈액 세포 발달과 내피에서 조혈로의 전이 연구에 활용됩니다.

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편집 도움을 주신 Matt Raymond에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institute of Health, U01HL099773, R01HL116221 및 P51 RR000167)과 샬롯 가이어 재단(Charlotte Geyer Foundation)의 기금으로 지원되었습니다.

1. 바이러스 준비 및 전사 인자 조합 <ol><li> pSIN-EF1α 렌티 바이러스 발현 플라스미드 ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 및 LMO2 (표 1)에 대한 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 솔루션을 준비합니다. </li><li> 230 나노 미터, 260 나노 미터, 그리고 280 nm에서 분광 광도계 UV 흡수를 기록하여 렌티 바이러스 생산을 위해 사용 된 플라스미드 제제의 농도 및 순도를 측정한다. 참고 : 1.8보다 큰 DNA 준비 시연 A260 / 280과 A260 / 230의 값은 일반적으로 좋은 품질로 간주됩니다. 저급 A260 / 230 값이 염 또는 일부 용제와 같은 페놀 불순물을 표시하면서 하부 A260 / 280 값은 단백질 오염을 나타낼 수있다. 권장 플라스미드 농도는 1-3 μg의 / μL이다. </li><li> 이전에 발행 된 프로토콜 (11)에 설명 된대로 transductions에 대한 렌티 바이러스를 생성합니다. 팬 골수 잠재력을 가진 그는 유도는 ETV2 및 GATA1, 또는 ETV2 및 GATA2의 공동 발현을 필요로한다.적혈구와 거핵 세포 잠재력을 가진 그는 유도는 GATA2 및 TAL1을 필요로한다. LMO2 첨가 크게 GATA2 TAL1 및 (10)의 존재하에 hPSCs 에리스로 거핵 세포에서 세포의 수율을 향상시킨다. </li></ol> 2. hPSCs 문화 프로토콜 <ol><li> 계대 배양하기 전에 70~80%의 포화 상태에 날카로운 모서리에 꽉 식민지에서 만능 줄기 세포를 성장. 마크 제거는 자발적으로 세포를 계대 전에 식민지를 차별화. </li><li> 4 ° C에서 하룻밤 제조업체의 지침과 코트 6 웰 플레이트에 따라 상업 세포 외 기질 젤 (표 2 참조) 희석, 또는 사용하기 전에 37 ° C에서 한 시간 이상. 세포를 계대 전에, 매트릭스 대기음 신선한 완전 상용 culturemedium 2 ㎖를 추가 (표 2 참조)를 37 ℃에서 플레이트를 유지 ° C는 세포까지 5 % CO 2는 파종을위한 준비가되어 있습니다. </li><li> 통로 hPSCs <ol><li> ASPIRA(0.22 μm의 필터를 통해 여과하여 멸균 DMEM / F12 2 ㎎ / ㎖) 하나의 합류 hPSCs와 6 웰 플레이트의 잘 미리 예열 스파 아제 (Dispase) II 솔루션의 1.5 ml의 추가에서 테 매체. 콜로니의 에지면으로부터 들어 올려 시작할 때까지 37 ° C, 5 % CO 2에서 5-7 분 동안 배양한다. </li><li> 기음 스파 아제 (Dispase) II 솔루션 조심스럽게 추가하고 신선한 DMEM / F12 배지 2 ㎖를 흡입에 의해 두 번 식민지를 씻는다. 다음에, 5 ㎖ 혈청 유리 피펫을 사용하여, 완전한 상용 신선한 배지 3 ㎖에 hPSCs 해리를 위아래로 수회 세포 현탁액으로 피펫 팅 (표 2 참조). </li><li> 각 웰 완전한 상용 배지 1.5 ml를 함유하는 6- 웰 플레이트에 세포 현탁액 0.5ml를 추가하기 (표 2 참조). 인큐베이터에 접시를 situating 때 균일 한 세포 분포를 확인하기 위해 앞뒤로 및 오른쪽에서 왼쪽으로 여러 번에 판을 선동. 37 ℃, 5 % CO 2 1을위한에서 세포를 유지8-24 시간. </li><li> 신선한 완전 상용 배지에 그 다음날 변화 매체 (표 2 참조) hPSCs 형태를 검토한다. hPSC 형태를 유지하는 작은, 잘 부착 식민지에서 성공적인 계대 결과. hPSCs 잘 매일 2.5-3 ml의 freshmedium 당으로 공급하고 70~80% 합류보다 더 이상 매일 4-5일를 계대해야합니다. 참고 : hiPSCs는 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)에서 유지 된 경우, 그들은 공급 장치가없는 상태로 전송하고 효율적으로 차별화를 위해 전달하기 전에 2 ~ 3 회 계대 배양 할 필요가있다. </li></ol></li></ol> hPSCs (일 0, hPSCs의 형질 도입)에서 Hematoendothelial Pprecursors 3. 유도 <ol><li> 반응 매질 상업적 완전한 혈청 배지 1.3 ㎖의 결합 제조하려면, 바이러스, 폴리 브렌, 및 Y27632 ROCK 억제제 (표 1) (표 2 참조) : 최종 집중하고 1.3 ml의 배지에 10 밀리미터 ROCK 억제제 1.3 μL를 추가6 μg의 최종 농도 / ㎖ 내지 10 μM의 기, 및 폴리 브렌. <ol><li> 셀 당 각 바이러스의 0.5-1.0 방어의 최종 농도 (감염의 다중성)에서 바이러스 농축 (들)의 적절한 금액을 추가합니다. 단일 세포 현탁액이 준비 될 때까지 얼음 상 또는 4 ℃에서 반응 매질을 유지한다. 참고 : GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1의 각 바이러스에 대한 방어의 동일한 금액 및 GATA2 / TAL1 / LMO2 반응 혼합물은 분화 유도에 최적입니다. ETV2에 대해 GATA2에 대한 방어를 두 배로 그러나 ETV2에 / GATA2 형질 문화, 차별화를 강화한다. 따라서 이러한 문화에 대한, 비율 1 : ETV2의 관성 모멘트와 GATA2 1 MOI 2 권장 (바이러스 농축이 약 6.8 × 10 7 입자 / ㎖ 추정되는 경우, ETV2 10 μL 및 GATA2 바이러스 농축의 20 μL를 추가 예를 들어, 6 웰 플레이트의 35mm의 잘 하나 ETV2 / GATA2 반응 당 0.68 × 10 6 세포). </li></ol></li><li> 단일 세포 SUSP에 hPSCs 준비ension. <ol><li> 하루 4 일 2 항에서 기술 한 마지막 구절 다음 공급 장치가없는 상태에서 hPSCs 성장 거꾸로 현미경으로 세포의 밀도와 형태를 관찰한다. hPSCs는 전달의 날 ~ 60~70%의 포화 상태없이 자발적 분화와 날카로운 모서리에 꽉 식민지에서 성장하고 도달해야한다. </li><li> 대기음 매체는, 웰 당 세포 해리 상업적 시약 (표 1) 1.5 mL를 추가하고 5-7 분 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 상업적 완전 배지 같은 부피로 세포를 수집하고 세포를 세고 생존력을 결정 ROCK 억제제의 10 μM과 (표 2 참조). 원심 분리에 의해 펠렛 세포 5 분 200 XG에 한 다음 ml의 당 3.4-5 × 10 6 세포의 농도로 ROCK 저해제의 10 μm의 상업 완전 배지에서 세포를 재현 탁. 참고 : 세포 생존에 성공 바이러스 전달 및 후속 차별화를위한 중요합니다.전형적으로, 전달 전에 세포 생존율이 90 %를 초과한다. </li></ol></li><li> 3.1에서 제조 한 반응 매질의 1.3 ml의 X10 0.68에서 1 사이에 106 세포를 함유하는 세포 현탁액 200 μl를 추가. </li><li> 2.2 제조 밤새 코팅 된 6- 웰 플레이트에서 매트릭스 용액을 대기음., 6 웰 플레이트의 한 웰에 반응 혼합물을 전송 및 분배를 균등 세포. 24 시간 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 배양한다. 24 시간 후 세포의 적어도 80 %는 매트릭스에 부착되어야한다. </li></ol> hPSCs에서 Hematoendothelial 전구체 (4) 유도 (주 7) <ol><li> SCF 100ng의 / ㎖, TPO : 24 시간 후 형질 도입, 바이러스 - 함유 배지를 제거하고 상업적 불완전한 세포 배양 배지와 함께 첨부 된 세포를 세척 조혈 사이토킨 (표 1 참조), 그리고 상업용 불완전한 세포 배양 배지의 잘 함유 당 3 mL로 추가 50 ng를 / ㎖, bFGF를 (이하 3F 매체 라 함) 20 ng를 / ㎖. </li><li> 죽은 세포와 파편을 제거하는 일 2, 3, 4 일에 신선한 층 중간에 총 매체를 교체합니다. 부동 조혈 세포가 신흥 때 4 ml의에서 전체 볼륨을 유지하면서 4 일 후, 매일 3 층 매체의 절반을 교체합니다. 주 : pSIN EF1α-렌티 바이러스 발현 플라스미드시켜 형질 세포의 양성 선별을 허용 퓨로 마이신 내성 유전자를 통합. 퓨로 마이신의 1 μg의 / ㎖의 잔여 미분화 hPSCs을 제거 분화 제 1~2일 동안 배지에 첨가 할 수있다. </li><li> 거꾸로 현미경으로 4 일에 세포 형태를 관찰 : 전형적인 내피 형태와 세포의 꽉 클러스터가 나타나기 시작 (도 2A, 3A). 일부 지역은 hPSCs 형태를 유지할 수있는 반면 라운드 혈액 세포는 분화 일 7 일 5에서 나타납니다. 아래에 설명 된대로 그와 조혈 차별화를 분석합니다. 참고 : 성공적인 hematoendothelial 다른iation 느슨하게 기본 평면에 부착 된 내피 세포와 같은 굴절 둥근 세포 나타나는 적혈구의 생산을 초래한다. 이 세포들은 적극적으로 분리 및 플로트 (도 2A 및 3A) 결국 작은 집합체를 형성 증식합니다. 라이브 혈액 세포는 광을 반사 및 배양 조건에서 확장 할 수있는 능력에 기초하여 죽은 세포와 죽어 시각적으로 구별 될 수있다. </li></ol> 5. 차별화의 Hemogenic 내피 (HE) 단계의 분석. <ol><li> 내피 형태와 세포의 현미경 관찰에 의해 일 3과 분화의 4 사이의 HE의 형성을 감지합니다. 차별화의이 단계에서 문화에 부동 혈액 세포가 없습니다. HE의 존재는 면역 형광 염색에 의해 확인 및 VE-cadherin의, CD73, CD226 및 CD43 항체를 사용하여 유세포 분석을 흐르게 할 수있다. <ol><li> 3 일에 유세포 분석을 사용 세포에 의해 그는 형성을 평가하기 위해한 실험에서 하루 4. 상업적 세포 해리 시약 배양 배양하여 세포를 수집하고 37 ℃에서 50-10 분 동안 (표 1 참조), 그 다음 5 % CO 2 및 염색 반응 당 1 × 105 개의 셀을 사용 (에 기재된 염색 절차 유동 세포 계측법 12). 참고 : 카데 린을 VE + 그는 세포는 초기 조혈 마커 CD226의 발현을 취득하지만, CD73 및 CD43 (6)의 표현이 부족하다. 대조적으로, 비 - HE 세포는 CD73 (도 2B, 3B)을 표현한다. </li></ol></li><li> hPSC 파생 HE에 대한 면역 형광 염색법. <ol><li> 인산 완충 식염수 (PBS)으로 세포의 부착 단층을 세척하고,이어서 실온에서 30 분 내지 60에서 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정한다. </li><li> 세척 된 세포를 다시 PBS와 함께 실온에서 20 분 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100을 사용 Permeabilize 하시려면. </li><li> 세 번 PBS 두 세포를 세척 한 다음에 품어30~120 분간, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)과 PBS로 이루어진 차단 버퍼. </li><li> 일차 항체를 모두 포함하는 염색 액을 제조 (1 : 1000 희석) 마우스 항 - 인간 CD43의 토끼 항 - 인간 5 % FBS와 PBS에, (표 1)를 헤린 VE. </li><li> 세포로부터 블로킹 버퍼를 대기음 첨가 일차 항체로 염색 완충액 웰 당 1 ㎖의 추가; 실온에서 3 시간, 또는 밤새 4 ° C를 품어. </li><li> 5 % FBS와 PBS 2 ㎖를 첨가하여 세포를 세 번 씻으십시오. </li><li> 1 차 항체를 포함, 두 번째 염색 버퍼를 준비 : 5 % FBS와 PBS 500 희석 : 당나귀 녹색 형광 염료, 및 적색 형광 염료 (표 1)과 결합 항 - 마우스가 결합 항 - 토끼를. 이차 염색 완충액 웰 당 1 ml에 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 혈청없이 PBS로 3 회 세척 할 것. 300 nm의 DAPI는 DH에 솔루션을 작업하는 얼룩 세포10 ~ 15 분 동안 2 O. </li><li> PBS로 세포를 두 번 씻고에 잘 염색 된 세포와 PBS의 2-3 ml를 추가합니다. 녹색, 빨간색과 파란색 현미경 필터와 형광을 관찰한다. </li></ol></li></ol> 유도 조혈 전구 물질 6. 분석 <ol><li> 3.1에 ​​설명 된대로 떠있는 세포가, 3 층 중간의 절반을 변경, 10-14일까지 크게 확장 될 때까지 이틀, 차별화 문화를 유지한다. </li><li> 해리 및 상업용 세포 해리 시약으로 처리하여 세포를 세포의 단층을 구별 수집 37에서 50-10 분 동안 (표 1 참조) ° C, 5 % CO 2. </li><li> 문화 (12)의 조혈을 평가하기 위해 안티 - VE-cadherin의, CD43 및 CD45 항체를 사용하여 유동 세포 계측법을 수행합니다. 최대 ETV2 및 GATA2 형질 세포의 40 % 세포의 많은 부분이, 공동 표현은 VE-CAD 있고 CD43을합니다. 다음의 항체는 다음과 같은 예를 특정 세포 계통을 검출하는데 사용될 수있다xpansion 또는 유도 된 혈액 전구 세포의 분화 : CD235a (적혈구 세포), CD41a (거핵 세포), CD32 (골수 세포의 모든 유형), CD66b (호중구) 및 CD163 (대 식세포). </li><li> 제조업체의 지시에 따라 상용 클론 원성 배지 (표 1)을 사용하여 CFC-분석을 수행한다. <ol><li> 상업적 클론 원성 배지 3 ㎖에 1-2 × 104 세포를 전송 콜로니 형성 세포 및 조혈 콜로니의 종류의 수를 평가하기 (표 3 참조). 최적의 시딩 밀도는 서로 별개로의 성장과 겹치지 않는 단일 콜로니의 동정 및 분리 가능하다. 시드 밀도는 분화 효율에 따라 실험에 따라 다를 수 있지만, 상업 클론 원성 배지 1 ㎖ 당 1 × 104 세포를 초과하지 않아야합니다. </li><li> 부드러운 텍싱에 의해 상업 클론 원성 배지에서 세포를 혼합, 2 개의 35mm 매우 낮은 첨부 요리에 정지 3 ㎖를 전송CFC 분석, 각각의 접시에 서스펜션의 1.5 ml를합니다. 균등 매체를 배포하고 14 일 동안 37 ℃, 5 % CO 2에서 품어. 요리를 방해하지 마십시오; 7 일 및 분석의 날 (10)에 콜로니 형성을 관찰합니다. </li><li> 14 일에 자신의 형태학에 따라 조혈 식민지를 확인하고 계산합니다. </li></ol></li></ol>

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TF가의 과발현 hPSCs의 조혈 분화 상기 방법은 인간 배아 줄기 세포 및 이에 최대 30 수백만 혈액 세포의 생산에서 허용 iPSCs로부터 HE 및 골수와 erytho-magakaryocytic 전구 세포의 생성을위한 빠르고 효과적인 방법을 나타낸다 백만 만능 줄기 세포 (10). 이 방법은 다수의 hESC iPSCs 및 라인 (10)에 일관된 분화를 나타내었다. ETV2 및 GATA2로 분화하는 동안, GATA1 요인뿐만 아니라 GATA2 및 TAL1 요인, 세포, 그는 혈액 생산 내피 세포를 형성하고 조혈 전환에 내피를 받다. HE의 형성은 일반적으로 3 일 및 분화 (4) 사이에 관찰된다. 그는 무대가 현저하게 축소 된 반면 LMO2, TAL1의 전사 보조 인자를 첨가, GATA2 및 TAL1 조합에 크게 분화의 견고성을 증가했다. 감독 differentia의 성공전사 인자에 의해 hPSCs 기의 중심 (I)의 세포 내로 핵산의...

자기 갱신과 혈액을 포함한 세 가지 배엽의 세포로 분화하는 조혈 개발의 역학적 연구에 그들에게 가치있는 도구를 만들어, 혈액 질환의 모델링, 약물 검사에 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)의 독특한 능력, 독성 연구 및 세포 요법의 개발. 내피 조혈 전환 1, 2를 통해 (HE) hemogenic 내피 세포에서 배아 진행 혈액 형성, 문화 HE의 발생 조혈 전환 및 조혈 사양 내피 조절 분자 메커니즘을 연구하는 것이 필수적 것 때문에. 그는 연구에 대한 현재의 방법은 조혈-지지 기질 세포 6,7 또는 세포 외 두 개의 차원 문화 hPSCs의 조혈 사이토 카인 3-5의 추가와 골재 (사채)에서 hematoendothelial 분화 유도 및 공 배양을 기반으로 행렬과 C8,9 ytokines. 이러한 고전 분화 방법은 세포 표면에서 작용하는 결국 hematoendothelial 개발을 유도 전사 프로그램의 활성화로 이어질 분자 경로 캐스케이드를 개시하는 외부 신호의 도입에 기초한다. 따라서, 이러한 시스템에서의 분화 hPSCs의 효율은 그 신호의 효과적인 유도 핵 신호 전달 및 특정 전사 레귤레이터 얻어진 활성화에 의존한다. 또한, 기존의 분화 배양 년의 연구는 세포 정렬을 사용하여 HE에게 세포를 분리하는 추가 단계가 필요합니다. 여기, 우리는 조혈 전사 인자의 과발현에 의해 그와 혈액의 직접 유도를위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 복잡 셀 정렬 절차를 사용하여 HE의 분리를위한 필요없이 요리와 조혈 전환에 내피의 직접 관찰 년의 효율적인 유도 할 수 있습니다. 인간 만능 줄기 세포에서 HE의 형성과 혈액을 효율적으로 몇 전사 인자 (TFS)를 과발현에 의해 유도 될 수있다. hPSCs에서 강력한 팬 골수 조혈을 유도 할 수있는과 TF의 최적 조합은 ETV2 및 GATA1 또는 GATA2을 포함한다. 대조적으로, GATA2 및 TAL1의 조합 erythromegakaryocytopoiesis 10을 유도한다. CD73 - - 점차적으로 초기 조혈 마커 CD43 (7)의 발현에 의해 정의 된 조혈 표현형을 획득 그는 세포 이러한 요소의 과발현을 통해 hPSCs를 프로그래밍 직접에 hPSCs가 VE-CAD + CD43을 구별합니다. 인간 다 능성 줄기 세포에있어서의 직접 프로그래밍이 렌티 기반 방법은 역학적 연구 조혈 전이 내피에 대한 연구, 개발 및 조혈 및 명세서의 전사 조절을위한 HE 및 혈액 세포의 생성에 적용 할 수있다. C 있지만urrent 프로토콜은 유사한 결과가 수정 10의 mRNA를 사용하여 얻을 수 있었다 유전자의 구성 적 발현을 이용한 혈액 생산을 설명한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">표 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61061</td><td>렌티바이러스 벡터</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61063</td><td>렌티바이러스 벡터</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61062</td><td>렌티바이러스 벡터</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61062</td><td>렌티바이러스 벡터</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61064</td><td>렌티바이러스 벡터</td></tr><tr><td>헥사디메트린 브로마이드(폴리브레네)&nbsp;</td><td>감염 효율을 높이기 위해 사용되는</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td> 양이온 성 고분자</tr><tr><td>Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK 억제제</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td>RHO / ROCK 경로 억제제</td></tr><tr><td>ROCK StemPro Accutase 세포 해리 시약</td><td><a href = http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/ stempro-accutase.html">Life Technologies</A></td><td>11105-01</td><td>세포 해리 시약</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>불완전(성장 인자 없음) 배양 배지&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; mTeSR1 맞춤형 제형&nbsp;</td><td>WiCell Research Institute(위스콘신주 매디슨)</td><td>MCF</td><td><a name="RANGE! bFGF 및 TGFb가 없는 D12">무혈청 mTeSR1 매체; </a></td></tr><tr><td>human SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td>프리미엄 등급</td></tr><tr><td>human TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>연구 등급</td></tr><tr><td>human FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>프리미엄 등급</td></tr><tr><td>CD144 (VE-cad) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>560411</td><td>Endothelial marker (FACS)</td></tr><tr><td>CD226 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>338305</td><td>Hematopoietic ( FACS)</td></tr><tr><td>CD43 PE</td><td>BD 생명과학</td><td>560199</td><td>조혈(FACS)</td></tr><tr><td>CD73 APC</td><td>R& D 시스템</td><td>FAB5795A</td><td>내피 마커 (FACS)</td></tr><tr><td>CD45 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555485</td><td>Hematopoietic (FACS)</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Life Technologies</td><td>A1310</td><td>Live/Dead assay (FACS)</td></tr><tr><td>파라포름알데히드&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6148-500G</td><td>세포 고정&nbsp;</td></tr><tr><td>트리톤 X-100&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>T9284-500ML&nbsp;</td><td>투과성&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003</td><td>소 태아 혈청</td></tr><tr><td>마우스 anti-human CD43</td><td>BD Biosciences</td><td>551457</td><td>순수, 면역형광(IF) 염색을 위한 1차 항체</td></tr><tr><td>Rabbit anti-human VE-cadherin</td><td>BenderMedSystem</td><td>BMS158</td><td>Primary (IF)</td></tr><tr><td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated</td><td>JacksonResearch</td><td>715-486-152</td><td>Secondary (IF)</td></tr><tr><td>안티-마우스 Alexa Fluor 594-conjugated</td><td>JacksonResearch</td><td>715-516-150&nbsp;</td><td>보조(IF)</td></tr><tr><td>DAPI 핵산 염색</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>D1306&nbsp;</td><td>Live/Dead 분석(IF)</td></tr><tr><td>클론 생성 매체 MethoCult H4435 Enriched</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>4435</td><td>CFC-assay</td></tr><tr><td>Wright 염색 용액</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>32857</td><td>염색 cytospins</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">표 2. hPSCs culture.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인간 만능 줄기세포(hPSC)&nbsp;</td><td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td><td>hESCs (WA01, WA09) 인간 배아 줄기 세포; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) 유전자 전이 없는 유도 만능 줄기 세포</td><td>hPSCs는 자가 재생이 가능하고 세 개의 배아층의 세포로 분화할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>hPSCs의 배양을 위한 완전한 무혈청 매체; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; mTeSR1 미디어&nbsp; &nbsp;</td><td>WiCell 연구소(위스콘신주 매디슨)</td><td>M500&nbsp;</td><td>무혈청&nbsp; ESC/iPSC의 무급유 배양을 위한 성장 인자를 가진 배지</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences/ 코닝&nbsp;</td><td></td><td>인간 ESC/iPSCs</td></tr><tr><td>DMEM/F-12의 유지를 위한 356234 매트릭스, 분말&nbsp;</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>12500-062</td><td>기초 매체&nbsp;</td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's PBS powder</td><td>Fisher Scientific</td><td>dSH30013.04</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Dispase II, powder</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>17105-041</td><td>중성 프로테아제, 세포 해리</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">표 3. 바이러스 게놈 통합 검출을 위한 프라이머.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>프라이머 이름</td><td><스트롱>포워드(Fwd)&nbsp; 5' -->3' </td><td>Reverse (Rev) 5'-->3' </td><td>Discription&nbsp; </td></tr><tr><td>pSIN EF1a Fwd</td><td>TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA-</td><td>-</td><td>EF1a 프로모터 서열</td></tr><tr><td>GATA1 Rev</td><td>-</td><td>-TCC CTG 태그 태그 GCC AGT GC</td><td>&nbsp; 코딩 영역&nbsp;</td></tr><tr><td>GATA2 Rev</td><td>--</td><td>GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG&</td><td>NBSP; 코딩 영역&nbsp;</td></tr><tr><td>TAL1 Rev</td><td>--</td><td>AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT</td><td>&nbsp; 코딩 영역&nbsp;</td></tr><tr><td>LMO2 Rev</td><td>--</td><td>GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC</td><td>&NBSP; 코딩 영역&nbsp;</td></tr><tr><td>ETV2 개정판</td><td>--</td><td>GAA CTT CTG GGT GGA GTA AC&nbsp;</td><td>&nbsp; 코딩 영역&nbsp;</td></tr></tbody></table>

인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자의 과발현에 의해 직접 hemogenic 내피 세포의 유도 및 혈액

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

개발하는 동안, 조혈 세포가 혈관 내피 세포의 전문 집합에서 발생, hemogenic 내피 (HE). 체외에서 모델링 HE 개발은 내피 - 조혈 전환 및 조혈 사양의 기계 론적 연구에 필수적이다. 여기서, 우리는 전사 인자의 다른 세트의 과발현로서 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)로부터 HE의 효율적인 유도하는 방법을 설명한다. GATA2 TAL1 및 전사 인자의 결합은 적혈구 및 거핵 세포 가능성 HE의 생성을 허용하면서 ETV2 및 GATA1 또는 GATA2과 TF들의 조합은 팬 - 골수 가능성 HE를 유도하기 위해 사용된다. GATA2 및 TAL1 조합에 LMO2의 추가는 실질적으로 차별화를 가속화하고 적혈구와 거핵 세포 세포의 생산을 증가시킨다. 이 방법에서 hPSCs HE 유도 효율적이고 빠른 방법을 제공하고 내피 hematopoieti의 관찰을 허용배양 접시에서 C 전환. 이 프로토콜은 hPSCs 전달 절차 및 HE의 후 전달 분석 및 혈액 전구 세포를 포함한다.

GATA2가, TAL1는 +/- LMO2 조합은 주로 에리스로 거핵 세포 조혈을 유도하면서 그와 전사 인자의 과발현에 의해 hPSCs에서 혈액 유도의 개략도는 팬 골수 조혈을 유도 GATA1 또는 GATA2 조합 그림 1. ETV2에 표시됩니다. 두 TF 조합 직접적이어서 조혈 분화 구별 스펙트럼 혈액 선조로 변환 HE 세포를 유도. 혈액 만능 상태에서 hPSCs의 차별화 그는 평균 사일 취 생산. 둥근 혈액 세포의 분화는 제 5 일에 의해 등장. 그 후, 다수의 부동 혈액 세포가 표시와 문화에 확장합니다. 혈액 세포를 부동의 수를 최대화하기 위해, 포스트 - 형질 배양 10-14 일 동안 연장 될 수있다. 세포 계보 원하는 조혈 사이토킨의 적절한 조합으로 둘러 접착 조건으로 확장 될 수있다.도 2의 DEMonstrates ETV2을 사용 hPSCs 및 GATA1 또는 GATA2과 TF에서 혈액의 유도. ETV2과 GATA2와 전달에 이어, 세포 분화의 날 (4)에 ...

이 프로토콜은 전사 인자의 강제 발현을 통해 인간 만능 줄기 세포에서 혈구 내피 및 다중전위 조혈 전구 세포의 효율적인 유도를 설명합니다.

인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자의 과발현에 의해 직접 Hemogenic 내피 세포의 유도 및 혈액

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

본 절차의 전반적인 목표는 전사 인자의 강제 발현을 통해 인간 만능 줄기세포로부터 적혈구계 및 골수계 혈구 세포를 생성하는 것입니다. 이 방법은 내피세포에서 조혈모세포로의 전환(endothelial to hepo transition) 및 조혈모세포 발달과 분화의 전사 조절 연구를 위해 혈구 세포 내 동질적인 내피세포를 생성하는 데 적용 가능합니다. 이 기술의 주요 장점은 인간 전분화능 줄기세포로부터 동질적인 내피세포를 효율적이고 빠르게 유도할 수 있는 수단을 제공하며, 세포 배양 접시 내에서 내피-조혈모세포 전환 과정을 관찰할 수 있게 한다는 점입니다.Lin 박사 연구실의 연구원인 Bruske 박사가 해당 절차를 시연하겠습니다. 시작하기 전, 제조사의 지침에 따라 Matrigel과 같은 세포외 기질을 희석하여 웰에 부어 6-웰 플레이트를 코팅하십시오. 플레이트를 37°C에서 30분에서 60분 동안 배양하여 트랜스덕션 배지를 준비합니다. 먼저, 바이러스 대 세포의 추정 감염 다중도(multiplicity of infection, MOI)가 세포당 바이러스 1개가 되도록 각 트랜스덕션 세트에 사용할 렌티바이러스 분주액을 준비하여 4°C에서 보관하십시오.다음으로, 각 형질전환 세트당 총 부피 1.3 mL가 되도록 hbsc viruses poly brain용 complete serum free medium을 최종 농도 6 µg/mL가 되게 하고, rock inhibitor Y 2 7 6 3 2를 최종 농도 10 µM이 되게 혼합한 후, 세포 준비를 위해 혼합물을 얼음에 둡니다. 마지막 계대 배양 후 약 4일이 지나 70% 합류도(confluence)에 도달한 건강한 상태의 다능성 줄기세포 배치를 사용하십시오. 인간 다능성 줄기세포를 mEF 상에서 유지한 경우, 형질전환 실험 2~3회 계대 전에 feeder-free 조건으로 옮겨야 하며, 건강한 다능성 줄기세포 배양 상태를 유지해야 합니다.자발적 분화가 일어나지 않은 상태여야 합니다. 6-웰 플레이트의 웰당 HPSC 배지를 흡입하여 제거하고, Accutane과 같은 염 기반 분리 용액 2 mL를 첨가한 후 37 °C, 5% CO2 조건에서 5~7분 동안 배양합니다. 그 다음, 10 µM ROCK 억제제가 포함된 완전 배지 2 mL를 첨가하여 분리된 세포를 수집합니다.균질한 세포 현탁액을 준비한 후, 소량의 aliquot를 취해 Trypan blue 배제법으로 생존 세포 수를 측정합니다. 다음으로, 세포를 200 ×g에서 5분 동안 원심분리하고, 10 µM ROCK inhibitor가 포함된 완전 배지에 펠렛을 재현탁하여 최종 농도를 3.4 × 10⁶ cells/mL로 맞춥니다. 그런 다음, 0.68 × 10⁶ cells가 포함된 세포 현탁액 200 µL를 앞서 준비한 1.3 mL의 형질전환 배지 각각에 첨가합니다.매트릭스가 코팅된 6-웰 플레이트를 37 °C에서 꺼냅니다. 다음으로, 매트릭스 용액을 흡입하여 제거하고 각 트랜스덕션 혼합물을 웰에 옮긴 후, 플레이트를 흔들어 세포가 웰 내에 고르게 분포되도록 합니다. 24시간 동안 배양합니다.형질전환 후, 현미경으로 웰을 관찰하여 세포의 80% 이상이 부착되었는지 확인합니다. 바이러스 용액을 제거하고 성장 인자가 포함되지 않은 불완전 배지로 부착된 세포를 세척합니다. 다음으로, 3F 배지로 알려진 사이토카인이 첨가된 배지 3 mL를 세포에 첨가합니다.다음 날까지 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 형질전환되지 않은 잔여 세포를 제거하기 위해, 1 µg/mL의 puromycin이 포함된 신선한 three F 배지로 교체합니다.죽은 세포를 제거하기 위해 24시간마다 이 배지를 교체하십시오. 처리 48시간 후에는 puromycin 투여를 중단하고, 4일 차에는 신선한 three F medium만을 사용하십시오. 형질전환 후, 현미경 하에서 내피 세포 형태를 띤 세포 클러스터의 출현 여부를 관찰하여 혈관내피세포의 형성 여부를 확인하십시오.먼저 배양 접시에서 3~4일 된 세포를 세포 박리 용액과 처리합니다. 박리된 세포를 완전 배지에 수집하여 원심 분리한 후, 상온에서 max buffer로 세포를 재현탁하고 혈구 계수기(hemocytometer)로 세포 수를 측정합니다. 그다음 염색 반응당 1×10⁵개의 세포를 v catrin, CD 2 26, CD 73 및 CD 43 세포 표면 마커 검출을 위한 적절한 항체와 함께 배양합니다.유세포 분석 수행 방법은 4일 차 텍스트 프로토콜에 설명되어 있습니다. 형질전환 후, 5~7일 사이에 혈구 세포가 느슨하게 응집되어 내피세포 층 위에 떠오를 때까지 48시간마다 각 웰의 배지 절반을 교체하여 세포 분화를 계속 진행합니다. 배양물을 최대 14일 동안 유지하며, 이 기간 동안 부유 세포가 상당히 증식해야 합니다.ETV2, GATA1 및 ETV2의 유세포 분석 결과입니다. GATA2가 형질전환된 세포는 terin 양성 혈관내피세포의 형성을 보이며, 이는 분화 3~4일 차에 CD226의 발현과 CD73 발현의 부재로 확인할 수 있습니다. ETV2, GATA1 및 ETV2의 유세포 분석 결과입니다. GATA2가 형질전환된 세포는 7일 차에 CD43을 발현하는 혈구 세포의 유도를 보입니다.형질도입 후, 형질도입 14일 차에 gata two TAL one LMO two 유도 세포를 유세포 분석한 결과 CD 2 35 A 및 CD 41 A를 발현하는 혈구 세포의 형성이 확인되었습니다. gata two TAL one lmo two 유도 조혈 세포의 염색 사이토신 표본을 분석한 결과, 콜로니 형성 세포 분석에서 적혈구, 대식세포 및 거핵구 세포 형태가 나타났습니다. 인간 다능성 줄기세포의 형질도입은 형질도입 절차를 수행하는 동안 1시간 이내에 완료될 수 있습니다. 줄기세포의 생존력을 고려하는 것이 중요하므로, 항상 반응 혼합물에 rock 억제제를 포함하고 형질도입 후 첫 3일 동안 세포당 최적의 바이러스 양을 사용해야 합니다.형질 도입 후에는 분화 효율과 유도된 혈액 질환의 유형에 관한 의문을 해결하기 위해 면역 염색, 콜로니 형성 분석, 유세포 분석과 같은 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 인간 다능성 줄기세포를 어떻게 최적화하고 감염시키는지, 그리고 처음 7~10일 동안의 분화 배양에서 무엇을 기대할 수 있는지에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 전사 인자가 인간 다능성 줄기세포에 성공적으로 전달되면, 세포는 다능성을 잃고 점진적으로 조혈 운명으로 결정됩니다.따라서 연구자들은 혈관내피-조혈모세포 전환의 분자적 기전을 연구할 수 있는 편리한 in vitro 모델을 갖게 될 것입니다. 렌티바이러스 함유 영역을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 개인 보호 장구 착용 및 바이러스 함유 영역의 적절한 폐기와 같은 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.

direct-induction-hemogenic-endothelium-blood-overexpression

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기 하나의 lentiviral 재활 벡터를 사용하여 말초 혈 3-4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 즉시 사용할 수 혈액 세포의 재 프로그래밍하면 폭 넓은 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 활용을 촉진 것을 약속드립니다.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

직접 방법 말초 혈 세포로부터 농축 조혈 전구 세포로부터 인간 신경 줄기 세포를 유도하기 위해 개발되었다.

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

여기에 설명된 프로토콜은 최소 전사 인자 세트의 과발현을 통해 마우스 배아 섬유아세포에서 혈액 프로그램의 유도를 자세히 설명합니다. 이 기술은 조혈, 혈액 질환 및 조혈 줄기 세포 이식에 대한 향후 연구를 위한 플랫폼을 제공하기 위해 인간 시스템으로 변환될 수 있습니다.

전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

우리는 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 유도만능줄기세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 프로토콜을 제안합니다. 원심분리를 통해 형질도입된 혈액 세포를 매트릭스 코팅된 플레이트에 도금함으로써 부유 세포에서 iPSC를 성공적으로 유도할 수 있습니다. 이 기술은 PBMC 및 CBMC와 같은 셀에 대한 간단하고 효과적인 재프로그래밍 프로토콜을 제안합니다.

센다이 바이러스 원심 분리를 이용하여 혈액 세포로부터 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 인간 성인 말초 혈액 세포에서 통합이 없는 iPSC를 효율적으로 생성하기 위한 자세한 방법을 설명합니다. 재프로그래밍 인자를 발현하기 위해 KLF4, MYC, BCL-XL 또는 OCT4 및 SOX2와 같은 4개의 oriP/EBNA 기반 에피솜 벡터를 사용하여 1mL의 말초 혈액에서 수천 개의 iPSC 콜로니를 얻을 수 있습니다.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

여기, 우리는 인간의 만능 줄기 세포 (hPSC) 문화 프로토콜, hPSCs CD34로 차별화 하는 데 사용 현재+ 조 혈 창시자. 이 방법은 단계 특정 조작 정식 WNT 신호 독점적으로 프로그램 중 하나는 확실 한 또는 원시 조 혈 세포를 지정 하려면 사용 합니다.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

여기서, 우리는 피더-및 제노프리 조건에서 인간 다능성 줄기 세포로부터 혈생 내피를 정밀하게 형성하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 치료 화합물에 대한 질병 모델링 및 스크리닝에 광범위한 응용 프로그램을 가질 것이다.

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

이 프로토콜은 조혈 줄기 및 전구 세포를 생성하는 전사 인자 GATA2, GFI1B 및 FOS의 발현을 강제함으로써 인간 진피 섬유아세포에서 혈생 프로그램의 유도를 입증한다.

전사 요인의 강제 표현에 의한 인간 섬유아세포의 혈생 재프로그래밍

여기에 제시된 것은 약 1 주일 내에 인간 다 능성 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화를위한 간단한 프로토콜이다.

인간 만능 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화

이 프로토콜은 인간 만능 및 유도 만능 줄기 세포로부터 자가 조직화 혈관의 생성을 설명합니다. 이러한 혈관 네트워크는 혈관주위세포, 평활근 액틴 및 연속적인 기저막으로 둘러싸인 광범위하고 연결된 내피 네트워크를 나타냅니다.

만능줄기세포(Pluripotent Stem Cells)에서 인간 혈관 오가노이드(Human Blood Vessel Organoids)의 생성

여기에는 내피 세포와 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 간단한 워크플로우와 기계적 자극에 대한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이를 통해 내피 세포의 발달 역학을 연구할 수 있습니다. 이 접근법은 기계적 자극 후 배양 칩에서 수집된 살아있는 세포의 다운스트림 분석과 호환됩니다.

In Vitro (시험관내) 발달 기계생물학을 연구하기 위한 태아 인간 혈관 온칩 모델

배우세요 인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자 과발현을 이용해 조혈성 내피 세포와 다능성 조혈 전구체를 효율적으로 유도하는 방법을. 이 기술은 혈액 세포 발달과 내피에서 조혈로의 전이 연구에 활용됩니다.

인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자의 과발현에 의해 직접 Hemogenic 내피 세포의 유도 및 혈액

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