Name: 포유 동물 세포에서 인간의 Granzymes의 높은 수율과 비용 효율적인 발현 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 배우세요 HEK293T 세포에서 인간 그란자임을 고수율로 발현하는 비용 효율적인 방법을. 칼슘 인산염 전염 및 크로마토그래피 정제를 통해 완전히 당화되고 효소 활성이 높은 프로테아제를 생산할 수 있습니다.

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이 연구는 노바티스 의학-생물학 연구 재단(Novartis Foundation for Medical-Biological Research)과 프리부르 대학(University of Fribourg)의 연구 풀(Research Pool)의 보조금으로 지원되었습니다. 기술 지원을 해주신 Li Zhao, Zhan Xu, Solange Kharoubi Hess, pHLsec 플라스미드를 제공해 주신 Radu Aricescu와 Yvonne Jones(영국 옥스퍼드 대학교), 유익한 토론을 해주신 Thomas Schürpf(하버드 의과대학)에게 감사드립니다.

발현 플라스미드 pHLsec-GZM 1. 생산 <ol><li> 인간 NK 세포로부터 manufacturer` 다음 적합한 RNA 분리 방법을 이용하여 첫 번째 가닥의 cDNA를 합성 키트를 사용하여 스크립트 작성 역방향 (26 또는 다섯 인간 Gzms 발현 NK 세포주 NK-92에서와 같이 제조 차 전지), 총 RNA를 준비 의 권장 사항. 23 (라두 Aricescu과 이본 존스, 옥스포드, 영국의 대학 종류의 선물)에 설명 된대로 GZM cDNA를 AgeI과 KpnI으로 절단 부위 (그림 1)를 사용하여 pHLsec으로 PCR 및 복제를 사용하여 증폭. 참고 : 표 1의 다음 프라이머를 사용합니다. </li><li> 순서에 의해 올바른 삽입을 확인합니다. DH5α 세포에서 발현 플라스미드를 확장하고 독소가없는 플라스미드 분리 키트를 사용하여 정화하고 제조업체의 지침을 따르십시오. </li><li> 된 unti -20 ° C에서 2 ㎎ / ㎖ 저장의 농도로 내 독소가없는 멸균 수에 정제 된 플라스미드를 재현 탁L 사용. </li></ol> HEK293T 세포에서 Gzms 2. 표현 <ol><li> 시약의 조제 <ol><li> 표준 배지를 준비합니다. 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 함유하는 고 글루코스 (25 mM)을 루타 (4 mM)을 위해, 피루브산 나트륨 (1 mM)을 (표준 소 태아 혈청 (FCS), 페니실린 (100 단위 / ml), 스트렙토 마이신의 10 %를 추가 100 μg의 / ㎖). </li><li> 형질 매체를 준비합니다. 페니실린 - 스트렙토 마이신이없는 배지에 25 μg의 / ㎖ 클로로퀸 (-20 ℃에서 보관 PBS에서 1000 배 주식에서 형질의 날에 갓 추가)를 추가합니다. </li><li> 무 혈청 배지를 준비 : 무 혈청 배지에 HEK293 세포 글루타민 (4 mM)을, 페니실린 (100 단위 / ml), 스트렙토 마이신 (100 μg의 / ㎖) 및 2.5 ㎎ / L의 암포 테리 B. 추가하세요 </li><li> 사용하기 전에 0.45 μm의 필터를 표 2와 필터에 설명 된 솔루션을 준비합니다 : </li></ol></li><li> HEK293T 세포 확대 <ol><li> 20 ㎖ 숭배에 HEK293T 세포를 성장150 X 25mm 조직 배양 접시를 사용하여 URE 매체. </li><li> 80 %의 포화 상태에서 분할 세포 (1 분할 비율 : 4, 일반적으로 매 3 일째). 세포는 느슨하게 그들은 기계적으로 엄격로 pipetting 아래로 트립신하지 않고 분리 할 수​​ 있습니다 연결합니다. </li><li> 플레이트 세포 형질 감염 전날은 형질 감염 (시딩 밀도 ~ 2 × 105 세포 / ml)의 날 60~70%의 생장을 얻었다. 평소 준비 크기는 20-25 배양 접시로 구성되어 있습니다. </li></ol></li><li> 칼슘 - 포스페이트 형질 <ol><li> 형질 감염 전에, 1 시간에 20 ml의 형질 감염 배지로 표준 배지를 변경. 이 1 시간 배양 단계의 끝 부분, 10.95 ML의 DDH 2 0 50 ml의 튜브 2M 염화칼슘 2의 1.55 ㎖ (1 관 / 5 요리)와 플라스미드 DNA의 400 μg의 혼합. </li><li> (1) 형질 전환 이전에 최소 2, DNA-칼슘 용액 12.5 ml의 12.5 ml의 2 배 HBS를 추가 튜브의 반전에 의해 혼합하고 실온에서 30 초 동안 품어. </li><li> 일 추가E 혼합물을 직접 세포 (접시 당 5 ㎖)에 적가 매체에 2.3.2에서 제조. 약간 오렌지 색상으로 매체를 회전, 전체 영역에 걸쳐 고르게 뿌린다. </li><li> 조직 문화 인큐베이터에서 7-11 시간 (37 ℃, 5 % 가습 공기 중 CO 2)의 배양 접시를 품어. 배양 후, 미세한 침전물을 볼 수 있습니다. 미리 예열 PBS로 조심스럽게 씻어, 형질 매체를 제거하고 2.1.3에서 제조 된 20 ml의 무 혈청 배지를 추가합니다. 조직 문화 인큐베이터에서 72 시간 동안 품어. </li><li> SDS-PAGE에 세포 상층 액의 샘플 (~ 20 μL)를 실행하고, 그랜 자임 밴드를 시각화 쿠마 브릴리언트 블루로 염색하여 형질 전환 및 발현 효율을 분석 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 니켈 IMAC에 의해 배양 상층 액에서 Gzms의 정제 <ol><li> 배양 후, 250 ml의 튜브에 세포 배양 상층 액을 가만히 따르다 및 원심 분리하여 취소합니다. 첫 번째 스핀을 수행 (400 XG, 10 분, 4 °분리 된 세포에서 매체를 취소합니다 C). 남아있는 세포 파편을 제거하기 위해 4 ° C에서 4,000 XG, 30 분에서 신선한 250 ml의 튜브와 스핀에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 5 M NaCl을 5 ㎖, 삭제 상층 액 250 ml의 당 0.25 M 니소 (4) 6.25 2 M 트리스 자료 (PH 8) ml의 1 ML을 추가합니다. 500㎖의 진공 필터 유닛 (0.45 mm)를 사용하여 상청액을 필터. </li><li> 적절한 FPLC 시스템을 사용하여 그분의 결합 버퍼를 (10 열 볼륨, CV)와 니켈 - 아이맥 열 평형. </li><li> 4 ℃에서 0.5 ㎖ / 분의 유속으로 칼럼을 평형화 클리어 상등액을 적용한다. </li><li> 상등액을 도포 한 후 UV 흡광도가 기준선 (통상 10 CV)에 도달 할 때까지, 그의 결합 완충액으로 칼럼을 세척 하였다. </li><li> 용출 Gzms 0.5 ml의 유속으로 20 ㎖의 선형 구배 (0 ~ 250 mM의 이미 다졸)로 / 분 ML-2 분획을 수집한다. SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 용출 분획을 분석한다. </li></ol></li><li> 엔테로 키나제 (EK)치료 및 양이온 교환 크로마토 그래피에 의한 최종 정리 <ol><li> ≤10와 MWCO 투석 튜브 함유 분획을 풀 GZM. 사전 EK 제어와 같은 -20 ° C에서 작은 샘플을 저장합니다. </li><li> 투석 튜브에서 직접 풀링 부분에 0.02 단위 / 초기 상층 액 50 ㎖에 EK을 추가하고 O / N EK-버퍼에 실온에서 (최소 16 시간) (4 L, 한 번 변화 버퍼를) 투석. </li><li> 다음날, EK는 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 사전 EK 제어에 비해 Gzms 처리 분석. </li><li> N 말단 처리가 완료되면 (4 L)를 버퍼 S 투석 완충액을 변경하고 다른 RT에서 4 시간 동안 투석. 필터 투석​​액 (0.45 μm의). </li><li> 4 ℃에서 0.5 ㎖ / 분의 유속으로 칼럼에 샘플을로드 S 버퍼 A. 가진 S-열 평형. </li><li> UV 흡광도 기준 (약 10 이력서)에 도달 할 때까지 샘플로드 한 후, S 버퍼와 열을 씻는다. 30 ml의 선형 구배 (150 mM의 NaCl을 1000)와 Gzms을 용출. GzmA 전자~ 750 mM의 염화나트륨에서 ~ 700 mM의 염화나트륨과 GzmM에서 ~ 650 mM의 NaCl을, GzmB에서 류트. </li><li> SDS-PAGE 및 비색 분석 (아래 참조)에 의한 용출 분수를 분석합니다. Gzms과 농축액을 함유하는 분획을 풀 (약 30 배 이상, 약 100 μM의 농도로)에서의 스핀 필터 (15 ㎖, 10 MWCO). -80 ° C에서 집중 GZM 준비 및 저장 나누어지는. </li></ol></li></ol> 3. 테스트 GZM 활동 <ol><li> 시약의 조제 <ol><li> 50 mM 트리스 - 자료, pH가 7 : 비색 분석 버퍼를 준비합니다. <ol><li> GzmA의 측정을 위해, 0.2 mM 내지 5,5&#39;- 디티 오 - 비스 (2- 니트로 벤조산)의 최종 농도로 검정 완충액에 나트륨-CBZ-L- 라이신을 thiobenzyl 에스테르 (S-BZL) (BLT)를 추가 0.22 mm의 농도 (DTNB). GzmB를 들어, 0.2 mM의 BOC-알라 - 알라 -의 ASP-S-BZL (AAD) 및 0.22 mM의 DTNB을 포함한다. GzmM 들어, 0.2 mM의 SUC 닐 -Ala-Ala-Pro-의 Leu-35㎕를 PNA () (AAPL)를 포함한다. 합성 펩티드는 DMSO에 (적절한 재고 솔루션에서 추가, STOR에드 갓 분석하기 전에 버퍼에 -20 ℃)​​에서. </li></ol></li><li> 절단 분석 완충액 준비 : 100 mM의 염화나트륨, 50 mM 트리스 - 자료, pH가 7.5 </li></ol></li><li> 비색 분석 <ol><li> 96 웰 평면 바닥 판에서 용출 분수에서 작은 GZM 샘플 (&lt;5 μL) 또는 집중 주식을 배포합니다. 양성 대조군 (GZM 시험 제제 또는 조질 NK 세포 용 해물) 및 음성 대조군 (전용의 버퍼)를 포함한다. </li><li> (멀티 채널 피펫을 사용하여) 각 웰에 분석 완충액 100 μl를 추가합니다. 37 ℃에서 10 분 동안 품어. 마이크로 플레이트 리더에서 405 nm에서 OD를 측정한다. </li></ol></li><li> 분열 분석 <ol><li> 희석액과 - 정제 된 기판을 사용하여 절단 분석법 (효율적인 GZM 기판의 몇 가지 예는이 섹션의 끝에 결과 섹션과 주에 제시 400 nM의 네이티브 또는 재조합, 100)을 단백질 기질을 공동 배양 GZM의 다양한 시간에 대한 분석 버퍼 (400 nm에서 시작).SDS-PAGE 및 쿠마 또는 실버 염색으로 분석; 또는 웨스턴하여 특정 항체를 사용하여 블 롯팅. </li><li> 세포 용 해물을 사용하여 절단 분석법, 37 ° C 세번에서 에탄올 / 드라이 아이스 배스 융해에서 동결 세이 버퍼를 Lyse 1 ㎖에서 106 HeLa 세포 (또는 가능한 종양 세포주)를 일시. (4 ° C에서 10 분 동안 15,000 XG)을 원심 분리하여 세포 파편을 제거합니다. </li><li> 위와 같이 다양한 농도와 시간에 Gzms와 클리어 해물을 공동-품어. 쪼개짐은 적절한 항체를 사용하여 면역 블에 의해 검출된다. 참고 : 선의의 기판의 몇 가지 예하는 상업 항체가 사용할 수 있습니다 입찰 (BH3-상호 작용 도메인 죽음 작용제)와 GzmB 27,28에 의해 절단 카스파 제 3; GzmA (29)에 의해 절단 여러 이기종 핵 리보 (hnRNPA1, A2 및 U); GzmM (30)에 의해 거대 세포 바이러스 인 단백질 (71). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Chowdhury, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+by+a+thousand+cuts%3A+granzyme+pathways+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death.</a> Annu Rev Immunol. 26, 389-420 (2008).</li>
<li>Thiery, J., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin%3A+a+key+pore-forming+protein+for+immune+control+of+viruses+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Perforin: a key pore-forming protein for immune control of viruses and cancer.</a> Subcell Biochem. 80, 197-220 (2014).</li>
<li>Krensky, A. M., Clayberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+clinical+relevance+of+granulysin%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Biology and clinical relevance of granulysin.</a> Tissue Antigens. 73, 193-198 (2009).</li>
<li>Bovenschen, N., Kummer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orphan+granzymes+find+a+home%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Orphan granzymes find a home.</a> Immunol Rev. 235, 117-127 (2010).</li>
<li>Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+A+activates+another+way+to+die%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Granzyme A activates another way to die.</a> Immunol Rev. 235, 93-104 (2010).</li>
<li>Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quarter+century+of+granzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+and+differentiation%22%5BJournal%5D)">A quarter century of granzymes.</a> Cell death and differentiation. 19, 28-35 (2012).</li>
<li>Hiebert, P. R., Granville, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B+in+injury%2C+inflammation%2C+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Granzyme B in injury, inflammation, and repair.</a> Trends Mol Med. 18, 732-741 (2012).</li>
<li>Afonina, I. S., Cullen, S. P., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+and+non-cytotoxic+roles+of+the+CTL%2FNK+protease+granzyme%5BTitle%5D)+AND+%22B.+Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme.</a> B. Immunol Rev. 235, 105-116 (2010).</li>
<li>Walch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+cells+kill+intracellular+bacteria+through+granulysin-mediated+delivery+of+granzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes.</a> Cell. 157, 1309-1323 (2014).</li>
<li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells+act+as+an+extravascular+cytotoxic+barrier+for+joint-invading+Lyme+Borrelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells act as an extravascular cytotoxic barrier for joint-invading Lyme Borrelia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).</li>
<li>Kapelski, S., de Almeida, M., Fischer, R., Barth, S., Fendel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimalarial+activity+of+granzyme+B+and+its+targeted+delivery+by+a+granzyme+B-scFv+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Antimalarial activity of granzyme B and its targeted delivery by a granzyme B-scFv fusion protein.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2014).</li>
<li>Thiery, J., Walch, M., Jensen, D. K., Martinvalet, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cytotoxic+T+cell+and+NK+granules+and+purification+of+their+effector+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of cytotoxic T cell and NK granules and purification of their effector proteins.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit3 37), (2010).</li>
<li>Shi, L., Yang, X., Froelich, C. J., Greenberg, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+use+of+granzyme+B%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification and use of granzyme B.</a> Methods Enzymol. 322, 125-143 (2000).</li>
<li>Masson, D., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+serine+esterases+in+lytic+granules+of+cytolytic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes.</a> Cell. 49, 679-685 (1987).</li>
<li>Lorentsen, R. H., Fynbo, C. H., Thogersen, H. C., Etzerodt, M., Holtet, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+refolding%2C+and+purification+of+recombinant+human+granzyme+B%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Expression, refolding, and purification of recombinant human granzyme B.</a> Protein Expr Purif. 39, 18-26 (2005).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+human+granzyme+B+from+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant human granzyme B from Pichia pastoris.</a> Biochem Biophys Res Commun. 261, 251-255 (1999).</li>
<li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+enzymatically+active+recombinant+granzyme+B+in+a+baculovirus+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of enzymatically active recombinant granzyme B in a baculovirus system.</a> Biochem Biophys Res Commun. 243, 384-389 (1998).</li>
<li>Stahnke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B-H22%28scFv%29%2C+a+human+immunotoxin+targeting+CD64+in+acute+myeloid+leukemia+of+monocytic+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes.</a> Mol Cancer Ther. 7, 2924-2932 (2008).</li>
<li>Gehrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+expression+and+purification+system+for+the+production+of+enzymatic+and+biologically+active+human+granzyme%5BTitle%5D)+AND+%22B.+J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel expression and purification system for the production of enzymatic and biologically active human granzyme.</a> B. J Immunol Methods. 371, 8-17 (2011).</li>
<li>Metkar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+cell+granule-mediated+apoptosis%3A+perforin+delivers+granzyme+B-serglycin+complexes+into+target+cells+without+plasma+membrane+pore+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore formation.</a> Immunity. 16, 417-428 (2002).</li>
<li>Motyka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mannose+6-phosphate%2Finsulin-like+growth+factor+II+receptor+is+a+death+receptor+for+granzyme+B+during+cytotoxic+T+cell-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis.</a> Cell. 103, 491-500 (2000).</li>
<li>Pinkoski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+and+trafficking+of+granzyme+B+in+target+cells+during+granzyme+B-perforin-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis.</a> Blood. 92, 1044-1054 (1998).</li>
<li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).</li>
<li>Fukuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+assays+of+nine+heterogeneous+promoters+in+neural+and+other+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Activity assays of nine heterogeneous promoters in neural and other cultured cells.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30 A, 300-305 (1994).</li>
<li>Tran, T. V., Ellis, K. A., Kam, C. M., Hudig, D., Powers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipeptidyl+peptidase+I%3A+importance+of+progranzyme+activation+sequences%2C+other+dipeptide+sequences%2C+and+the+N-terminal+amino+group+of+synthetic+substrates+for+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Dipeptidyl peptidase I: importance of progranzyme activation sequences, other dipeptide sequences, and the N-terminal amino group of synthetic substrates for enzyme activity.</a> Arch Biochem Biophys. 403, 160-170 (2002).</li>
<li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion%2C+purification%2C+and+functional+assessment+of+human+peripheral+blood+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li>
<li>Barry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B+short-circuits+the+need+for+caspase+8+activity+during+granule-mediated+cytotoxic+T-lymphocyte+killing+by+directly+cleaving+Bid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid.</a> Mol Cell Biol. 20, 3781-3794 (2000).</li>
<li>Darmon, A. J., Nicholson, D. W., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+apoptotic+protease+CPP32+by+cytotoxic+T-cell-derived+granzyme+B.+%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. </a> Nature. 377, 446-448 (1995).</li>
<li>Rajani, D. K., Walch, M., Martinvalet, D., Thomas, M. P., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+RNA+processing+during+immune-mediated+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Alterations in RNA processing during immune-mediated programmed cell death.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8688-8693 (2012).</li>
<li>Domselaar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncytotoxic+inhibition+of+cytomegalovirus+replication+through+NK+cell+protease+granzyme+M-mediated+cleavage+of+viral+phosphoprotein+71%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Noncytotoxic inhibition of cytomegalovirus replication through NK cell protease granzyme M-mediated cleavage of viral phosphoprotein 71.</a> J Immunol. 185, 7605-7613 (2010).</li>
<li>Thiery, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin+activates+clathrin-+and+dynamin-dependent+endocytosis%2C+which+is+required+for+plasma+membrane+repair+and+delivery+of+granzyme+B+for+granzyme-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Perforin activates clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, which is required for plasma membrane repair and delivery of granzyme B for granzyme-mediated apoptosis.</a> Blood. 115, 1582-1593 (2010).</li>
<li>Thiery, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin+pores+in+the+endosomal+membrane+trigger+the+release+of+endocytosed+granzyme+B+into+the+cytosol+of+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells.</a> Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).</li>
<li>Thomas, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+protease+binding+to+nucleic+acids+promotes+nuclear+localization+and+cleavage+of+nucleic+acid+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins.</a> J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).</li>
<li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B-induced+mitochondrial+ROS+are+required+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+and+differentiation%22%5BJournal%5D)">Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis.</a> Cell death and differentiation. , (2014).</li>
<li>Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+recombinant+granzyme+A+zymogen+and+its+activation+by+the+cysteine+proteinase+cathepsin+C%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C.</a> The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).</li>
<li>Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+assay+that+specifically+measures+Granzyme+B+proteolytic+activity%3A+hydrolysis+of+Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419(2014).</li>
<li>Huang, M. T., Gorman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervening+sequences+increase+efficiency+of+RNA+3%27+processing+and+accumulation+of+cytoplasmic+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Intervening sequences increase efficiency of RNA 3' processing and accumulation of cytoplasmic RNA.</a> Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).</li>
<li>Luthman, H., Magnusson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+polyoma+DNA+transfection+of+chloroquine+treated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).</li>
<li>Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+one-stage+method+for+assay+of+enterokinase+activity+by+release+of+radiolabelled+activation+peptides+from+alpha-N-%5B3H%5Dacetyl-trypsinogen+and+the+effect+of+calcium+ions+on+the+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity.</a> Biochem J. 197, 239-244 (1981).</li>
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GzmA 및 GzmB의 고전과 광범위하게 연구 역할은 기공 형성 단백질 PFN 1로 그들의 세포질 배달 후 포유 동물 세포에서 세포 사멸의 유도이다. 최근 Gzms의 세포 독성 스펙트럼 세균 9,10뿐만 아니라 특정 기생충 (11)에 포유류 세포에서 현저하게 확대시켰다. 또한, GzmA 및 GzmB의 비 고전적, 세포 외 기능뿐만 아니라 다양한 고아 Gzms의 생물학적 중요성은 여전히​​ 불분명하다. 이 프로토콜에 의해 제공 따라서, Gzms의 강력한 시간과 비용 효율적인 표현과 정화 ​​시스템은 이러한 미래 연구에 큰 도움이 될 것입니다. 이 방법의 강도는 특히 이러한 시스템에서 사용되는 발현 벡터 pHLsec 23에 기초한다. 이 플라스미드는 E.의 높은 사본 번호가 콜라이, 따라서 효율적인 DNA 생산을 가능하게한다. 그 인핸서 / 프로모터 요소를 제공다양한 세...

Gzms 전문 CTL의 리소좀과 NK 세포 1 지역화 높은 상동 세린 프로테아제의 가족입니다. 이러한 킬러 세포의 세포 독성 과립은 제거 2,3 향하는 표적 세포의 인식에 Gzms와 동시에 출시되는 막 방해 단백질 PFN 및 GNLY가 포함되어 있습니다. (- G, K, M과 N GzmA) 인간 (GzmA, B, H, K와 M)에서 다섯 Gzms 및 마우스에서 10 Gzms이 있습니다. GzmA과 GzmB이 가장 풍부하고 광범위하게 인간과 생쥐 한 연구이다. 그러나, 최근의 연구들은 세포 사멸 경로뿐만 아니라 건강과 질환 4 다른, 소위 고아 Gzms에 의해 매개되는 생물학적 효과를 추가로 조사하기 시작했다. 5,6- PFN에 의해 표적 세포 내로 전달 된 경우 Gzms의 가장 잘 알려진 함수와 GzmA GzmB의 특히 포유 동물 세포에서 프로그래밍 된 세포 사멸을 유도한다. 그러나더 최근의 연구는 또한 PFN 7,8 독립적으로 세포질 전달, 면역 조절 및 염증에 깊은 영향을 Gzms의 세포 외 효과를 보여 주었다. Gzms의 세포질 기입 한 후 효율적으로 살해 세포의 스펙트럼은 최근 박테리아 9, 10, 심지어 특정 기생충 (11) 포유 동물 세포에서 확대되었다. 이러한 최근의 발견은 GZM 연구원에 대한 완전히 새로운 분야를 열었다. 따라서, 비용 효율적인, 고 수율 포유 동물 발현 시스템은 크게 그 미래 연구에 대한 방법을 완화합니다. 네이티브 인간, 마우스 및 래트 Gzms 성공적 CTL 및 NK 세포 라인 12-14의 과립 분획으로부터 정제 하였다. 그러나, 우리의 손에 이러한 정제 기술의 수율은 0.1 ㎎ / ℓ, 세포 배양 (미공개 관측 및 12)의 범위이다. 또한, 인접하여 오염이없는 단일의 GZM 크로마토 해상도R Gzms 및 / 또는 과립 형태로도 존재하는 단백질 (게시되지 않은 데이터와 12, 14)에 도전하고있다. 재조합 Gzms 심지어 이러한 HEK 293 18,19 같은 포유 동물 세포에서 세균 15, 16, 효모, 곤충 세포 및 17에서 제조 하였다. 만 포유류 발현 시스템은 원시 세포 독성 단백질과 동일한 번역 후 변형으로 재조합 효소를 생산할 수있는 가능성을 부담. 번역 후 변형은 엔도 사이토 시스에 의해 특정 흡수 및 표적 세포 20-22 내의 단백질 분해 효소의 세포 내 현지화에 연루되어있다. 따라서, pHLsec (23)를 사용하여 GZM 발현 플라스미드 백본 (라두 Aricescu과 이본 존스, 옥스포드, 영국의 대학의 일종 선물), 우리는 높은 수율 단백질 생산을위한 간단하고, 시간과 비용 효율적인 시스템을 구축 HEK293T 세포. pHLsec는 닭 Β-액틴 프로모터와 CMV 증강을 결합; 함께, 이러한 요소는 demonstra테드 다양한 세포 라인 (24)에서 가장 강력한 프로모터 활성. 또한, 플라스미드는 토끼 Β-글로빈 인트론, 최적화 된 코작과 분비 신호리스 - 6xHis 태그 및 폴리 신호가 포함되어 있습니다. 삽입이 분비 신호와 적절한 N- 말단 도메인을 부족한 단백질에 대한 최적의 발현과 분비 효율을 보장리스 - 6xHis 태그 (그림 1) 사이에 편리하게 복제 할 수 있습니다. Gzms의 발현을 위해, 우리는되도록 EK 치료 분비 Gzms는 (활성 Gzms는 N - 말단으로 시작 활성화 된 엔테로 키나제 (EK) 사이트 (DDDDK) 뒤에 벡터에 의해 제공 분비 신호 내인성 분비 신호 서열로 대체 아미노산 서열 IIGG 25). 또한이 방법에 대한 찬성, HEK293T 세포는 둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM)로, 저가의 매체에 빠른 속도로 성장하고, 비용 효율적인 칼슘 포스페이트 형질 전환 방법에 적합하다.

<table><tbody><tr><td>TRIzol 시약</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Total RNA isolation kit</td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>EX-CELL 293 HEK 293 Cells용 무혈청 배지</td><td>Sigma</td><td>14571C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, GlutaMAX 보충제, 피루브산</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin 투석 튜브, 10K MWCO</td><td>Thermo Scientific</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>소 장에서 추출한 엔테로키나제</td><td>Sigma</td><td>E4906</td><td>재조합, &ge; 20&nbsp; 단위/mg 단백질</td></tr><tr><td>HisTrap Excel 5ml 컬럼</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-3712-06&nbsp;</td><td>니켈 IMAC</td></tr><tr><td>HiTrap SP HP 5 ml 칼럼</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-1152-01&nbsp;</td><td>S 열</td></tr><tr><td>N-&alpha;-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT)</td><td>Sigma</td><td>C3647</td><td>GzmA 기판</td></tr><tr><td>Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)</td><td>MP Biomedicals</td><td>2193608 _10mg</td><td>GzmB 기판</td></tr><tr><td>Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL)</td><td>Bachem</td><td></td><td>GzmM 기판</td></tr><tr><td>5,5&prime;-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)</td><td>Sigma</td><td>D8130</td><td>Ellman의 시약</td></tr></tbody></table>

포유 동물 세포에서 인간의 granzymes의 높은 수율과 비용 효율적인 발현 시스템

A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

세포독성 T 림프구(CTL) 또는 자연살해(NK) 세포가 종양 세포 또는 세포 내 병원체에 감염된 세포를 인식할 때, 세포 독성 과립 함량을 방출하여 표적 세포와 세포 내 병원체를 제거합니다. 숙주 세포와 세포 내 병원체의 사멸은 공극 형성 단백질 퍼포린(PFN)에 의해 숙주 세포 세포질로 전달되고 원핵생물 파괴 단백질 과립신(GNLY)에 의해 박테리아 병원체로 전달되는 과립 세린 프로테아제, 그랜자임(Gzms)에 의해 유발됩니다. 실험적인 체외 환경에서 Gzms에 의해 매개되는 표적 세포 사멸의 분자 메커니즘을 조사하기 위해서는 다량의 활성 효소를 생산하는 단백질 발현 및 정제 시스템이 필요합니다. 포유류의 분비 단백질 발현 시스템은 당화(glycosylation)와 같은 번역 후 변형(posttranslational modification)을 지닌 올바르게 접힌 완전한 기능을 갖춘 단백질을 생산할 수 있는 잠재력을 내포하고 있습니다. 따라서 우리는 발현 플라스미드 pHLsec로 복제된 인간 Gzms를 사용하여 HEK293T 세포의 일시적인 transfection을 위해 비용 효율적인 칼슘 침전 방법을 사용했습니다. 배양 상등액으로부터의 Gzm 정제는 벡터에 의해 제공된 C-말단 폴리히스티딘 태그를 사용하여 고정된 니켈 친화성 크로마토그래피에 의해 달성되었습니다. 단백질의 N 말단에 enterokinase 위치의 삽입은 양이온 교환 착색인쇄기에 의해 최종적으로 순화되는 활동적인 프로테아제의 발생을 허용했습니다. 이 시스템은 높은 수준의 세포 독성 인간 Gzm A, B 및 M을 생산하여 테스트되었으며 인체의 거의 모든 효소를 높은 수율로 생산할 수 있어야 합니다.

다음 섹션에서 우리는 방법을 조명 GzmA 준비의 전체​​ 문서를 발표 할 예정이다. 또한 성공적으로 정화 효율 및 작동에 대해서는 유사한 결과를 생성하고 GzmB GzmM 정제. 그러나, 그 후 준비에서 우리는 데이터의 몇 선택한 조각을 보여줍니다. 현재 프로토콜 다음 293T 세포로부터 GzmB 제제는 다양한 생물학적 분석 시스템 9,29,31-34 그들의 활동을 강조 여러 발표 된 연구에 사용 하였다. 전형적인 GzmA 정화는 그림 2A에 표시됩니다. ~ GzmA에 대한 34분의 60 kDa의를 아래에 72 시간은 환원 조건 하에서 배양 상청 GzmB 및 GzmM에 대한 (~ 37 kDa의 더 농도없이 쿠마 묻은 SDS-PAGE 젤에 감지 GZM 밴드로 표시하고 효율적인 형질 전환 및 발현 후 ) 환원 조건 / 비 환원성. 아이맥 정화 후 샘플을 입력 처리 하였다okinase (EK). EK의 눈에 보이는 변화는 샘플 (...

여기에서는 순수하고 완전히 글리코실화되었으며 효소 활성 프로테아제를 높은 수율로 생산하는 HEK293T 세포를 사용하는 비용 효율적인 그랜자임 발현 시스템을 설명합니다.

포유 동물 세포에서 인간의 Granzymes의 높은 수율과 비용 효율적인 발현 시스템

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their ...

본 절차의 전반적인 목표는 인간 배아 신장 293 T 세포에서 고수율의 당화 및 효소 활성을 가진 그랜자임(granzymes)을 생산하는 것입니다. 이는 먼저 적절한 조직 배양 접시에서 HEK 293 T 세포를 증식시킴으로써 달성됩니다. 증식 후 일반적인 준비 규모는 20~25개의 배양 접시로 구성됩니다.두 번째 단계는 효율적인 인산칼슘법을 사용하여 확장된 세포에 그랜자임 발현 플라스미드를 일시적으로 형질전환하는 것입니다. 다음으로, 세포 상층액을 수확하고 고정 금속 친화성 크로마토그래피를 통해 분비된 그랜자임을 정제합니다. 마지막 단계는 엔테로키나아제 처리로 그랜자임을 활성화하고 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 프로테아제를 추가로 정제하는 것입니다.최종적으로, 활성 프로테아제를 충분한 양으로 확보하는 것이 그랜자임 연구의 제한 요인이 되므로, 빠르고 신뢰할 수 있는 콜로메트릭 분석법(chole metric assay)을 사용하여 효소 활성을 테스트합니다. 이 방법은 서로 다른 생물체에서의 새로운 세포 사멸 경로의 특성 규명이나 전체 프로테옴 접근 방식에서의 새로운 프로테아제 기질 식별과 같이 해당 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그랜자임 효소를 발현시키기 위해, 먼저 150x25 mm 조직 배양 접시를 사용하여 HEC 293 T 세포를 20 mL의 배지에서 배양합니다. 세포 밀도가 80%에 도달했을 때 세포를 분할합니다. 세포는 느슨하게 부착되어 있어, 트립신 없이 피펫팅을 세게 반복하는 것만으로도 기계적으로 떼어낼 수 있습니다.형질전환 당일에 60~70%의 합류도(confluency)가 되도록 전날 밤에 세포를 분주합니다. 일반적인 준비 규모는 20~25개의 배양 접시로 구성됩니다. 형질전환 1시간 전에 표준 배양 배지를 20 mL의 형질전환 배지로 교체합니다. 1시간의 배양 단계가 끝나기 직전, 형질전환 1~2분 전에 50 mL 튜브에서 400 µg의 플라스미드 DNA를 10.95 mL의 2중 증류수 및 1.55 mL의 2 M 염화칼슘과 혼합합니다.2x HEPES 완충 식염수 12.5 milliliters를 DNA 칼슘 용액 12.5 milliliters에 가한 후, 튜브를 반전시켜 혼합하고 30초 동안 배양합니다. 실온에서 이 혼합물을 디시당 5 milliliters씩 세포에 직접 한 방울씩 떨어뜨려 전체 영역에 고르게 뿌리면, 배지가 약간 오렌지색으로 변합니다. 조직 배양 인큐베이터에서 배양 디시를 7~11시간 동안 배양합니다.배양 후 미세한 침전물이 보입니다. 형질전환 배지를 제거합니다. 미리 데워둔 PBS로 조심스럽게 헹구고, 20 milliliters의 무혈청 배양 배지를 추가한 다음 조직 배양 인큐베이터에서 72시간 동안 배양합니다. 이후 세포 상층액 샘플을 SDS page로 전기영동하고 kumasi로 염색하여 형질전환 및 발현 효율을 분석합니다.브릴리언트 블루. 그랜자임 밴드를 시각화하기 위함입니다. 배양 후 세포 배양 상층액을 250 milliliter 튜브에 붓고 원심분리를 통해 불순물을 제거합니다.분리된 세포로부터 배지를 제거하기 위해 1차 원심분리를 수행합니다. 상층액을 새로운 250 milliliter 튜브로 옮기고 4 °C에서 4,000 Gs로 30분 동안 원심분리하여 남아 있는 세포 파편을 제거합니다. 다음으로, 정제된 상층액 250 milliliter에 sodium chloride 5 milliliter, tris base 6.25 milliliter 및 nickel sulfate 1 milliliter를 추가합니다.500 milliliter 진공 여과 장치를 사용하여 상층액을 여과합니다. 적절한 FPLC 시스템을 사용하여 니켈 고정 금속 이온 친화성 크로마토그래피 컬럼을 his 결합 버퍼로 평형화합니다.그 다음, 4°C에서 0.5 mL/min의 유속으로 평형화된 컬럼에 맑은 상층액을 적용합니다. 상층액 적용이 끝나면, 자외선(UV) 흡광 베이스라인에 도달할 때까지 His 결합 버퍼로 컬럼을 세척합니다. 0.5 mL/min의 유속으로 20 mL의 선형 ILE 기울기를 사용하여 그랜자임을 용출시키며, 이때 2 mL씩 분획하여 수집합니다.SDS-PAGE와 Coomassie 염색으로 용출 분획을 분석하십시오. 그랜자임(granzyme)이 포함된 분획을 원심분리관에 수집하십시오. 소량의 샘플을 -20 °C에 보관하여 entero kinase 처리 전 대조군으로 사용하십시오.투석 튜브 내의 통합 분획에 초기 상층액 50 milliliters당 0.02 units의 엔테로 키나제(entero kinase)를 직접 첨가하고, 엔테로 키나제 완충액 내에서 실온으로 하룻밤 동안 투석합니다. 다음 날, SDS page 및 쿠마시 블루(kumasi blue) 염색을 통해 키나제가 처리된 군을 엔테로 키나제 처리 전 대조군과 비교 분석합니다. 말단 가공이 완료되면.투석 완충액을 S buffer A로 교체하고, DIALATE eight를 여과하기 전 실온에서 4시간 동안 추가로 투석합니다. 그다음, S column을 S buffer A로 평형화합니다. 시료 로딩 후, 4°C에서 분당 0.5 mL의 유속으로 시료를 컬럼에 로딩합니다.UV 흡광도 기선(baseline)에 도달할 때까지 S 버퍼 A로 컬럼을 세척합니다. 30 mL의 선형 염화나트륨 기울기를 사용하여 그랜자임(granzyme)을 용출시키며, granzyme A는 약 650 mM 염화나트륨에서, granzyme B는 약 700 mM 염화나트륨에서, 그리고 granzyme M은 약 750 mM 염화나트륨에서 용출됩니다. 그랜자임이 포함된 분획들을 모아 스핀 필터로 약 100 µM까지 농축한 후, 농축된 그랜자임 제제들을 소분하여 -80 °C에서 보관합니다.다음으로, SDS page 및 콜로리메트릭 분석(colorimetric assay)을 통해 용출 분획을 분석하십시오. 콜로리메트릭 분석을 수행하려면 용출 분획 또는 농축 스톡에서 소량의 그랜자임(granzyme) 샘플을 96-웰 평저 플레이트에 분주하십시오. 이때 양성 대조군과 음성 대조군을 포함해야 합니다. 각 웰에 분석 버퍼 100 µL를 첨가하십시오.플레이트를 37°C에서 10분 동안 배양합니다. 마지막으로, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 405 nm에서 광학 밀도를 측정합니다. 이 프로토콜은 S 컬럼의 granzyme BE를 보여주는 이 대표적인 kumasi 염색 SDS page 겔에서 입증된 바와 같이, 고순도의 granzyme을 높은 수율로 생산할 것입니다.재조합 그랜자임은 재조합 그랜자임 B와 천연 그랜자임 B의 활성을 비교하는 이 컬러 메트릭 분석에서 나타난 바와 같이 천연 프로테아제 제제와 유사한 활성을 보입니다. 중요한 점은, endo H 처리를 통해 HEC 2 93 T 세포에서 생산된 그랜자임이 완전히 당화되었음을 확인했다는 것입니다. 재조합 그랜자임 효소는 박테리아 단백질 기질과 UOCD를 사용한 이 대표적인 그랜자임 a 절단 분석에서 입증된 것처럼 고분자 단백질 기질을 절단할 수 있습니다.여기에서 절단된 N-O-U-C-D를 나타내는 밴드는 그랜자임 농도가 증가함에 따라 서서히 사라집니다. 이 영상을 시청한 후, HK 2 93 T 세포에서 고수율로 완전히 당쇄화된 프로 활성 그랜자임 효소를 생산하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이후 인간 게놈 시대에 원시 conformations에서 재조합 단백질의 가용성은 구조적 기능적 및 치료 연구와 개발에 매우​​ 중요합니다. 여기서는 테스트 및 재조합 단백질의 다양한 생산하는 데 사용할 수있는 인간의 배아 신장 293T 세포에 대규모 단백질 발현 시스템을 설명합니다.

인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼

포유류 시스템에 의한 재조합 단백질의 발현은 구조 생물학을 위한 단백질 복합체를 생산하는 매력적인 방법이 되고 있습니다. 여기에서 우리는 구조 연구를 위해 단백질 복합체를 정제하기 위해 현탁액 성장 포유류 세포를 사용하는 간단하면서도 매우 효율적인 발현 시스템을 제시합니다.

소설 및 액세스 접근 : 구조 HEK 293F 서스펜션 세포의 생물학에 대한 재조합 단백질 발현

우리는 인간, 마우스 또는 쥐 Granzyme B (GzmB)의 단백질 분해 활성을 구체적으로 측정하는 간단하고 정량적인 비색 분석을 설명합니다. 이 프로토콜은 적절한 인식 서열을 가진 다른 합성 펩타이드 기질의 가수분해에 의해 다른 과립 세린 프로테아제의 프로테아제 활성을 측정하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다.

BOC-알라 - 알라 -의 ASP-S-BZL의 가수 분해 : 색채 특히 그랜 자임 B 단백질 분해 활동를 측정 분석

이 연구에서는 서로 다른 생산 플랫폼에서 표적 인간 재조합 단백질의 발현을 비교했습니다. 우리는 전통적인 발효기 기반 배양과 식물에 초점을 맞추고, 각 시스템의 설정을 설명하고, 보고된 결과를 기반으로 각 플랫폼의 고유한 한계와 장점을 강조했습니다.

박테리아, 곤충 세포 및 공장 시스템 : 재조합 단백질 다른 Biofactories에서 표현의 비교 분석

셀 기반 시스템에서 말라리아 단백질의 발현은 도전 남아있다. 우리는 HeLa 세포에서 말라리아 재조합 rhoptry 단백질을 표현하는 두 단계 및 (체외 번역) 한 단계 IVT 세포 무료 발현 시스템을 보여줍니다. 우리 rhoptry 단백질을 정제하는 니켈 계 수지 친화 정제 시스템을 사용한다.

의 발현에 대한 헬라 세포를 기반으로 무료 발현 시스템<em&gt; 변형체</em&gt; Rhoptry 단백질

이것은 분비된 당화(glycosylated mammalian protein)의 생산 및 X선 결정학 및 기타 생물물리학 연구를 위한 균질한 단백질의 충분한 수율을 가진 후속 1단계 정제를 위한 빠르고 비용 효율적인 프로토콜입니다.

효율적인 포유 동물 세포 발현 및 결정화에 대한 세포 외 당 단백질의 단일 단계 정화

적절한 번역 후 변형을 통한 진핵 단백질의 실험실 규모 생산은 상당한 장벽을 나타냅니다. 다음은 포유류 발현 시스템을 사용하여 단백질 발현을 위한 신속한 확립 및 전환을 제공하는 강력한 프로토콜입니다. 이 시스템은 선택적 아미노산, 단백질의 선택적 표지 및 글라이칸 조성의 저분자 조절제를 지원합니다.

서스펜션의 HEK293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식

이온 채널의 정화는 종종 도전, 하지만 일단 달성, 그것은 잠재적으로 수 체 외에서 조사 기능 및 채널의 구조. 여기, 표현과 포유류 bestrophin 단백질, 캘리포니아2 +의 가족의 정화에 대 한 단계적 절차 설명-Cl- 채널을 활성화.

표현과 포유류 Bestrophin 이온 채널의 정화

자사는 HEK293 세포에서 구조체 설계, 일시적 형질감염, 전장 인간 헌팅틴 단백질 변이체의 발현 및 정제를 포괄하는 확장 가능한 프로토콜을 제공합니다.

일시적 발현 시스템을 사용한 포유류 세포에서 전장 인간 헌팅틴 변이체의 효율적이고 확장 가능한 생산

그의 태그 정제, 투석 및 활성화는 박테리아에서 가용성, 활성 매트릭스 메탈로프로테이나제-3 촉매 도메인 단백질 발현의 수율을 증가시키기 위해 사용된다. 단백질 분획은 SDS-PAGE 겔을 통해 분석된다.

박테리아 발현 및 친화성 크로마토그래피를 이용한 인간 매트릭스 메탈로프로테이나제-3의 정제

인간 막 수송체의 구조 및 생화학적 연구에는 밀리그램 단위의 안정적이고 온전하며 균질한 단백질이 필요합니다. 여기서는 코돈 최적화 유전자를 사용하여 인간 용질 운반체 수송체를 스크리닝, 발현 및 정제하는 확장 가능한 방법을 설명합니다.

구조 및 생화학 연구를 위한 Human Solute Carriers의 High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies(구조 및 생화학 연구를 위한 인간 용질 담체의 고처리량 발현 및 정제)

배우세요 HEK293T 세포에서 인간 그란자임을 고수율로 발현하는 비용 효율적인 방법을. 칼슘 인산염 전염 및 크로마토그래피 정제를 통해 완전히 당화되고 효소 활성이 높은 프로테아제를 생산할 수 있습니다.

포유 동물 세포에서 인간의 Granzymes의 높은 수율과 비용 효율적인 발현 시스템

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