포유 동물 세포에서 인간의 Granzymes의 높은 수율과 비용 효율적인 발현 시스템

이 절차의 전반적인 목표는 인간 배아 신장 2 93 T 세포에서 엽산, 당화 및 효소 활성 그랜자임을 높은 수율로 생산하는 것입니다. 이는 먼저 적절한 조직 배양 접시에서 HEC 2 93 T 세포를 확장함으로써 달성됩니다. 확장 후 일반적인 준비 크기는 20-25 개의 배양 요리로 구성됩니다.

두 번째 단계는 효율적인 인산칼슘(calcium phosphate) 방법을 사용하여 그랜자임(granzyme) 발현 플라스미드로 확장된 세포를 일시적으로 transfection하는 것입니다. 다음으로, 세포 상층을 수확하고 분비된 그랜드 효소를 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피로 정제합니다. 마지막 단계는 키나아제 처리에 들어가 그랜드 효소를 활성화하고 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 프로테아제를 추가로 정제하는 것입니다.

궁극적으로, 효소 활성은 신속하고 신뢰할 수 있는 콜레 메트릭 분석을 사용하여 테스트됩니다.충분한 양의 활성 프로테아제의 가용성은 그랜자임 연구의 제한 요소이기 때문입니다. 이 방법은 다양한 유기체에서 새로운 세포 사멸 경로의 특성화 또는 전체 단백질체 접근법에서 새로운 단백질 분해 효소 기질의 식별과 같은 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저 150 x 25 밀리미터 조직 배양 접시를 사용하여 20 밀리리터의 배양 배지에서 HEC 2 93 T 세포를 성장시키고 세포를 80 % Co 유창성 세포로 분할하여 느슨하게 부착하지만 플레이트를 위아래로 엄격하게 피펫팅하여 트립신 없이 기계적으로 분리할 수 있습니다.

형질주입 전날 밤에 세포는 형질주입 당일에 60 - 70%의 co를 제공합니다. 일반적인 준비 크기는 20-25 개의 배양 요리로 구성됩니다. 형질주입 1시간 전에 표준 배양 배지를 20ml의 형질주입 배지로 변경하고, 1시간 배양 단계가 끝날 무렵, 형질주입 1-2분 전에 50ml 튜브에 400마이크로그램의 혈장 DNA와 10.95ml의 이중 증류수 및 1.55ml의 2몰 염화칼슘을 혼합했습니다.

12.5 밀리리터의 2 x 힙에서 12.5 밀리리터의 DNA 칼슘 용액으로 식염수를 완충하여 30초 동안 배양하기 전에 튜브의 반전으로 혼합했습니다. 실온에서이 혼합물을 접시 당 5 밀리리터로 세포에 직접 적가하고 전체 영역에 골고루 뿌려 매체를 약간 주황색으로 바꿉니다. 조직 배양 인큐베이터에서 7-11시간 동안 배양 접시를 배양합니다.

배양 후, 미세한 침전물이 보입니다. 트랜스펙션 배지를 제거합니다. 조직 배양 인큐베이터에서 72시간 동안 배양하기 전에 예열 PBS로 조심스럽게 헹구고 20ml의 무혈청 배양 배지를 첨가한 후 SDS 페이지에서 세포 상등액 샘플을 실행하고 kumasi로 염색하여 transfection 및 발현 효율을 분석합니다.

브릴리언트 블루. 그랜자임 밴드를 시각화하기 위해. 배양 디캔트 후 세포 배양 상층액을 250ml 튜브로 넣고 원심분리로 투명

분리 된 세포에서 배지를 제거하는 첫 번째 스핀을 수행합니다. 상등액을 새로운 250 밀리리터 튜브로 옮기고 4, 000 GS에서 4 섭씨 온도에서 30 분 동안 회전하여 남아있는 세포 파편을 제거합니다. 다음으로, 염화나트륨 5ml, 트리스 염기 6.25ml, 황산니켈 1ml와 투명화된 상등액 250ml를 추가합니다.

500ml 진공 필터 장치를 사용하여 상층액을 여과합니다. 니켈 고정 금속 이온 친화성 크로마토그래피 컬럼을 결합 완충액으로 평형화합니다. A: 적절한 FPLC 시스템을 사용합니다.

그런 다음 투명화된 상등액을 섭씨 4도에서 분당 0.5밀리리터의 유속으로 평형화된 컬럼에 도포합니다. 상층액을 도포한 후 자외선 또는 UV 흡수제 기준선에 도달할 때까지 결합 완충액으로 컬럼을 세척합니다. 분당 0.5ml의 유속으로 선형 20mL ILE 구배로 그랜자임을 용리하는 동시에 2mL 분획을 수집합니다.

SDS 페이지 및 kumasi 염색에 의한 elucian fractions를 분석합니다. 분수가 들어있는 그랜드 자임을 멍하니 튜브로 당깁니다. 작은 샘플을 섭씨 영하 20도에서 pre entero kinase control로 보관하십시오.

초기 상등액 50ml당 0.02 단위의 엔테로 키나아제를 투석 튜브의 풀링된 분획에 직접 첨가하고 엔테로 키나아제 완충액에서 실온에서 밤새 투석합니다. 다음날은 SDS 페이지 및 kumasi blue staining에 의한 pre enterer kinase control과 비교하여 Grand를 처리한 kinase를 분석합니다. 터미널 처리 종료가 완료된 경우.

투석 버퍼를 S 버퍼 A로 변경하고 실온에서 4시간 더 투석한 후 DIALATE 8을 필터링합니다. 다음으로, S 열을 S 버퍼와 평형화합니다. A. 시료 로딩 후 섭씨 4도에서 분당 0.5밀리리터의 유속으로 컬럼에 시료를 로드합니다.

UV 흡수제 기준선에 도달할 때까지 S 버퍼 A로 컬럼을 세척합니다. 그랜자임을 30밀리리터 선형 염화나트륨 구배로 용리하고, 그랜자임 A는 약 650밀리몰의 염화나트륨, 그랜자임 B는 약 700밀리몰의 염화나트륨, 그랜자임 M은 약 750밀리몰의 염화나트륨으로 용리합니다. 그랜자임을 함유한 분획을 풀링하고 스핀 필터에서 약 100마이크로몰까지 농축하고 농축된 그랜자임 제제를 분취하고 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

다음으로, SDS 페이지 및 콜레 메트릭 분석으로 엘루시안 분획을 분석하여 콜레 메트릭 분석을 수행하여 96의 엘루시안 분획 또는 농축 스톡에서 작은 그랜자임 샘플을 분배합니다. 음, 평평한 바닥 플레이트에는 포지티브 컨트롤과 네거티브 컨트롤이 포함됩니다. 각각에 100마이크로리터의 분석 버퍼를 추가합니다.

접시를 섭씨 37도에서 10분 동안 잘 배양합니다. 마지막으로, 마이크로플레이트 리더에서 405나노미터의 광학 밀도를 측정합니다. 이 프로토콜은 S 컬럼의 그랜자임 BE를 보여주는 이 대표적인 kumasi 염색 SDS 페이지 젤에서 입증된 바와 같이 순수한 그랜자임의 높은 수율을 생성합니다.

재조합 그랜자임은 재조합 및 비변성 그랜자임 B 활성을 비교하는 이 색상 메트릭 분석에서 표시된 바와 같이 비변성 프로테아제 제제와 유사한 활성을 나타냅니다. 중요한 것은 엔도 H 처리는 HEC 2 93 T 세포에서 생성된 그랜자임이 완전히 글리코실화되었음을 나타냅니다. 재조합 그랜드 효소는 박테리아 단백질 기질과 UOCD를 사용하여 이 대표적인 그랜자임(granzyme) 절단 분석에서 입증된 바와 같이 고분자 단백질 기질을 절단할 수 있습니다.

여기서 쪼개진 N-O-U-C-D를 나타내는 띠는 그랜자임 농도가 증가함에 따라 서서히 사라집니다. 이 동영상을 시청한 후에는 HK 2 93 T 세포에서 높은 수율로 완전 글리코실화된 활성 그랜드 효소를 생산하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.