특정 감각 세포의 상호 공 초점 및 3D 전자 현미경

이 절차의 전반적인 목표는 천연 장 조직의 다른 상피 세포에 흩어져 있는 특정 장 감각 세포의 완전한 초미세 구조를 문서화하는 것입니다. 이것은 먼저 장에서 300 x 50 미크론 조직 분절을 얻어서 이루어집니다. 다음으로 컨포칼 현미경을 사용하여 세그먼트의 광학 Z 스택을 얻습니다.

그런 다음 컨포칼 데이터는 연속 블록 얼굴 주사 전자 현미경 또는 SBEM을 사용하여 조직을 처리하고 이미지화하기 위한 가이드 역할을 합니다. 마지막으로, SBEM 데이터는 특정 장내 센서 셀의 초미세 구조를 3D로 렌더링하기 위해 분할됩니다. 궁극적으로 상관 관계가 있는 공초점 현미경 검사와 연속 블록 얼굴 스캐닝.

전자 현미경은 고유 조직의 특정 세포를 보여주고 그 초구조를 3D로 드러내는 데 사용됩니다. 이 방법은 광학 현미경 수준에서는 시각화할 수 없는 특정 세포 간 상호 작용과 같은 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법을 사용함으로써, 우리는 이전에 감각이 내분비 세포로 들어가는 것과 ggl로 들어가는 것 사이에 숨겨진 물리적 화학적 관계를 보고했습니다.

마우스 결장을 분리한 후, 텍스트 프로토콜에 따라, 좋은 차가운 PBS에 넣고 침수된 동안 메스를 따라 조직을 절단하고, 치과 왁스 시트에 PBS 몇 방울로 조직을 옮기고 메스 저주를 사용하여 원위 결장에서 약 6개의 작은 조직 세그먼트를 사용합니다. PBS에서 5%의 저융점 aros를 준비한 후, 이를 사용하여 표준 크기의 tissue tech cryo mold와 같은 작은 플라스틱 용기에 조직 세그먼트를 삽입하고, 내장된 부분을 진동 블레이드 마이크로톰에 장착하고, 얼음처럼 차가운 PBS를 사용하여 버퍼 트레이를 채웁니다. 그런 다음 0.8 진폭과 초당 0.04mm 속도로 300 미크론 조직 스트립을 자릅니다.

300미크론 조직 스트립을 아로스로 갈고 블레이드에 수직으로 마이크로톤으로 장착합니다. 그런 다음 섭씨 4도의 PBS에 블록을 보관하기 전에 세부 사항에 대한 텍스트 프로토콜을 참조하여 50미크론 두께로 조직 스트립을 절단합니다. 조직 블록을 이미징한 후 텍스트 프로토콜에 따라 컨포칼 현미경을 사용하여 조직 절편을 레진에 침투 및 삽입하는 방법을 설명합니다.

PBS에서 조직을 제거하고 0.1 몰 코에이트 버퍼를 사용하여 각각 5분씩 3회 헹굽니다. 레진이 준비되고 전자 현미경을 위해 조직이 염색되면 텍스트 프로토콜에 따라 조직 블록을 사용하여 조직 블록을 삽입한 후 액체 방출제로 경화된 유리 슬라이드 사이에 조직 블록을 끼우고 섭씨 60도에서 추가로 48시간 동안 블록을 평평하게 경화합니다. 그런 다음 슬라이드를 당겨 해부 범위 아래에서 블록을 분리하고 수지에 내장된 조직 블록의 방향을 컨포칼 현미경 사진의 방향과 일치시킵니다.

관심 세포가 포함된 영역을 쉽게 식별할 수 있도록 전도성 에폭시가 포함된 핀에 블록을 평평하게 장착하고 30분 동안 건조시킵니다. 그런 다음 블록을 표면에 평평하게 놓고 다음날 섭씨 60도에서 밤새 건조시킵니다. 블록을 콜로이드은 액체로 코팅합니다.

연속 블록 면과 컨포칼 현미경 사진의 상관을 용이하게 하기 위해 블록이 올바른 각도로 절단될 수 있도록 조직 섹션을 평평하게 유지합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 주사 전자 현미경을 수행한 후 피지에서 0.8 가우시안 블러 필터를 사용하여 SPEM 이미지를 원시 DM 3 형식에서 8비트 TIFF 이미지로 변환합니다. TIFF 이미지를 필터링합니다.

데이터 세트를 원래 크기의 25%로 축소하고 TIFF 스택으로 저장하여 피지 플러그인 선형 스택 정렬로 데이터 세트를 처리하는 데 필요한 RAM 메모리 양을 최소화합니다. SPEM 이미지 스택을 정렬하고 자르기 3D 플러그인을 사용하여 자릅니다. 데이터를 렌더링하려면 그리기 모드에서 표면 도구를 사용하고 그리기 모드에서 윤곽 옵션을 50밀리초 동안 사용하여 관심 셀을 수동으로 분할하고 볼륨으로 렌더링합니다.

더 부드러운 렌더링을 위해 셀의 모든 슬라이스에서 윤곽을 추적하거나 더 빠른 렌더링을 위해 5개의 슬라이스마다 윤곽을 추적할 수 있습니다. 스냅샷 도구를 사용하여 P-Y-Y-G-F-P 마우스를 사용하여 300DPI 이상의 해상도로 최종 이미지를 내보냅니다. 소장의 원위부에 있는 모든 장내분비세포는 다음과 같이 SBEM에 대해 식별되고 처리됩니다.

선택된 조직 분절은 컨포칼 현미경으로 이미지화하여 광학적으로 1미크론 떨어진 Zack 이미지를 얻었습니다. 조직 블록의 크기를 최적화하는 것은 컨포칼 데이터와 SBEM 데이터 간의 지형적 상관관계를 위해 매우 중요합니다. 이 볼륨은 마우스의 회장에 있는 장 내분비 세포를 렌더링하여 상피 세포 아래에 약 60미크론 정도 확장된 두드러진 신경 포드를 보여줍니다.

컨포칼 Z 스택을 전체 블록 면의 SBEM 이미지와 연관시킴으로써, 관심 세포는 A-P-Y-Y-G-F-P 마우스의 원위 결장에서 나온 블록에서 식별됩니다. SBEM 이미지의 광학 슬라이스와 일치하도록 블록의 방향을 가능한 한 평평하게 유지하는 것이 중요합니다. 세포가 확인되면 SBEM 이미징은 분비성 슬레 및 기타 세포 소기관을 식별할 수 있을 만큼 충분히 높은 해상도로 수행됩니다.

이 비디오에는 장 내분비 세포의 3D 렌더링이 포함되어 있습니다. 데이터 세트에는 조직 깊이의 45미크론에 걸쳐 있는 643개의 이미지가 포함되어 있습니다. 세포에는 분비물과 미세 융모로 가득 찬 신경 포드가 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 관심 세포를 식별하고 연속 블록 상 주사 전자 현미경을 위해 조직을 처리하기 위한 가이드로 형광을 사용하여 천연 장 조직의 다른 상피 세포에 흩어져 있는 특정 장내 감각 세포의 완전한 초미세 구조를 문서화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.