RAFT 중합 제어를 통해 트라이 구성 요소 형광 Glycopolymers의 손쉬운 및 효율적인 준비

이 절차의 전반적인 목표는 가역적 첨가 단편화, 사슬 전달 또는 뗏목 중합화를 사용하여 형광 통계적 선형 글리코 중합체의 잘 제어된 합성입니다. 이것은 먼저 글리코 단량체, 두 개의 락토 바이오 에틸 메스 아크릴아미드 또는 L-A-E-M-A를 합성하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 L-A-E-M-A-N 2 개의 아미노 에틸 메타 아크릴 아미드 또는 A EMA 및 N 2 개의 하이드 록시 에틸 아크릴 아미드 또는 GAA의 뗏목 중합을 사용하여 해당 저 분산성 글리코 중합체를 합성하는 것입니다.

다음으로, 글리코 중합체는 카르복시 플루오레세인 xito 중간 에스테르와 반응하여 1차 아민 중 하나에서 변형되어 플루오레세인 화 글리코 중합체를 생성합니다. 마지막 단계는 플루오레세인 천연 글리코 폴리머를 알려진 탄수화물 결합 특이성을 가진 렉틴 코팅된 어로즈 비드에 결합하는 것입니다. 궁극적으로, 형광 현미경 검사는 글리코 폴리머와 로즈 비드의 결합을 분석하는 데 사용되며, 글리코 폴리머가 관심 탄수화물을 가지고 있고 형광 태그로 표시되어 있음을 확인합니다.

기존의 자유 라디칼 중합을 사용하는 기존 방법에 비해 RAF 중합의 장점은 wrath 공정이 개시제 유래 사슬의 수를 최소화하는 제어 중합 기술이라는 것입니다. 그 결과 미리 결정된 분자량의 폴리머와 매우 좁은 폴리 분산 랙이 생성됩니다. 중합은 특정 형광 글리코 폴리머의 준비를 위해 정의된 단량체 혼합물에 적용할 수 있습니다.

이러한 글리코 폴리머는 렉틴 코팅 비드를 사용하여 확인할 수 있는 정의된 결합 능력을 가지고 있습니다. 형광 글리코 폴리머의 효율적인 준비는 향후 글리코 생물학 연구에 큰 가치가 있음이 입증될 것입니다. 시작하려면 2g의 락토 바이오닉산을 3ml의 무수 메탄올에 녹입니다.

다음으로, 용액이 흐려질 때까지 절대 에탄올을 용액에 천천히 적가하십시오. 회전 증발기를 사용하여 모든 용매를 제거하십시오. 이 과정을 세 번 반복하여 98%의 수율로 1.94g의 락토 비오 1개의 5개의 락톤을 생성합니다.

메탄올 3밀리리터에 락토 바이오 락톤 1g을 메탄올 2밀리리터 함유 A EMA 및 MEHQ 용액에 첨가합니다. 다음으로, 1ml의 트리에틸아민을 넣고 혼합물을 실온에서 저어줍니다. 48 시간 후, 혼합물에 20 밀리리터의 탈 이온수를 첨가하고 회전 증발기로 옮깁니다.

완전히 마를 때까지 증발시킵니다. 잔류물을 20ml의 탈이온수에 용해시키고 용액을 10 x 20mm 음이온 교환 컬럼 상단에 바릅니다. 배출구 아래에 1mg의 MEHQ가 들어 있는 비커를 놓고 컬럼을 비커로 용리합니다.

회전 증발기에서 용액을 추출한 후 잔류물을 탈이온수 20ml에 용해시키고 이온 교환 수지 1mg의 분취액을 첨가합니다. 소화전 테스트가 음성이 나올 때까지 소화전 테스트에서 용액 1마이크로리터를 제거하고 이를 박층 크로마토그래피 플레이트에 적용하여 수행합니다. 플레이트에 에탄올 용액에 2%anhy를 뿌리고 핫 플레이트에서 섭씨 90도에서 1분 동안 가열합니다.

파란색이 형성되지 않을 때 끝점에 도달했습니다. 다음으로, 프릿 유리 깔때기를 통해 용액을 여과하여 시험관에 넣습니다. 용액을 섭씨 영하 80도에서 동결한 다음 동결 건조기로 옮겨 동결 건조합니다.

최소량의 메탄올에 잔류 물을 용해시키고 섭씨 영하 20 도와 무수 아세톤을 첨가하여 생성물을 침전시킨다. 프릿티드 글라스 깔때기를 통한 여과로 침전된 L-A-E-M-A를 수집합니다. 깔때기를 옮기고 진공 건조제로 침전시켜 먼저 약 150 메쉬 산화 알루미늄 나노 입자 0.5g에서 2 밀리리터 시험관에서 1 밀리리터의 상용 등급 HEAA로 건조시킵니다.

300배 G에서 튜브를 30초 동안 원심분리하고 최상층을 무억제제 HEAA로 사용하여 32.8mg의 L-A-E-M-A, 1.7mg의 EMA, 27.5마이크로리터의 무억제제 HEAA 및 0.4mL의 탈이온수를 조심스럽게 용해하고 용액을 잘 세척된 1mL 측면 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 50마이크로리터의 래프트 시약과 50마이크로리터의 개시제 시약을 튜브에 추가하고 밸브를 닫은 상태에서 튜브 측면을 가볍게 두드려 혼합합니다. 튜브를 진공 라인에 연결하고 드라이 아이스 에탄올 수조를 사용하여 내용물을 얼립니다.

그런 다음 펌프로 튜브 압력을 50밀리토르로 낮추고 밸브를 닫습니다. 드라이아이스 중탕을 제거하고 내용물을 해동합니다. 동결, 진공 및 해동 주기를 두 번 더 조심스럽게 반복합니다.

튜브를 검사하여 내용물이 완전히 용해되었는지 확인하고 필요한 경우 부드럽게 소용돌이칩니다. 착석하기 전에 진공 라인에서 닫힌 튜브를 제거하고 투명한 플라스틱 진공 백에 넣으십시오. 플라스틱 핸드 펌프로 가방에서 공기를 배출하십시오.

그런 다음 가방을 섭씨 70도의 뚜껑이 있는 수조에 24시간 동안 넣습니다. 다음으로, 백에서 튜브를 제거하고 내용물을 분자량 컷오프가 3, 500 Daltons인 투석 백으로 옮깁니다. 투석 백을 비커에 넣고 2리터의 탈이온수로 24시간 동안 투

투석 백 내용물을 시험관에 옮기고 섭씨 영하 80도의 냉동고에 넣습니다. 일단 얼면 동결 건조기로 옮기고 동결 건조하십시오. 푹신푹신한 흰색 글리코 폴리머 PMA LA EMA를 먼저 얻으려면 PBS 0.9 밀리리터에 PMA LA EMA 5 밀리그램의 용액을 준비하십시오.

다음으로, 0.6 밀리그램의 카르복시 플루오레세인 신, 100의 중간 에터, 디메틸 포름 아미드의 마이크로 리터를 빠르게 교반 된 용액, 마이크로 튜브 및 호일에 천천히 첨가하고 실온에서 16 시간 동안 천천히 교반하고 용액을 3, 500 Daltons의 분자량 컷오프를 가진 투석 백으로 옮깁니다. 가방을 비커에 넣고 빛으로부터 보호하면서 2리터의 탈이온수에 대해 16시간 동안 투석합니다. 투석 백 내용물을 시험관에 옮깁니다.

용액을 섭씨 영하 80도에서 동결한 후 동결 건조하십시오. P-M-A-L-A-E-M-A, 글리코 폴리머로 표시된 솜털 같은 노란색 형광을 얻으려면 HPLC 시스템으로 글리코 폴리머의 수 평균 분자량, 무게, 평균 분자량 및 분산도를 측정합니다. 먼저 1.5 밀리리터의 PBS에서 50 마이크로 리터의 ery Krista 조리실 렉틴 코팅 아로 비드를 원심 분리기 튜브에 넣었습니다.

그런 다음 튜브를 300배 G로 1분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 상층액을 버리고 마지막으로 0.5ml의 PBS를 추가하기 전에 두 번 더 세척을 반복합니다. 6마이크로리터의 PBS에 포함된 3마이크로그램의 플루오레세인(Fluorescein)이라고 표시된 PMA EMA 용액을 렉틴 코팅된 비드가 들어 있는 튜브에 추가합니다.

P-M-A-G-A-E-M-A로 표시된 플루오레세인을 음성 대조군으로 사용합니다. 다음으로, 튜브를 호일로 싸서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 튜브를 1분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.

그런 다음 reus, 1.5 ml의 신선한 PBS에 구슬을 현탁시키고 세척을 3 번 반복합니다. 마지막으로, reus는 0.2 ml의 PBS에 비드를 현탁시킵니다 4 마이크로리터의 현탁 비드를 면역 형광 현미경의 웰로 옮깁니다. 유리 커버 슬립 레코드로 밀어 덮습니다.

10 x 대물렌즈 FITC 필터와 카메라가 장착된 형광 현미경을 사용한 슬라이드 이미지. 글리코 중합체는 겔 투과 크로마토그래피로 분석하였다. 뗏목을 사용하지 않고 합성된 고분자는 뗏목을 사용하여 만든 고분자보다 훨씬 높은 분산도를 갖습니다.

플루오레세인(fluorescein)으로 표지되면 글리코 폴리머의 물리적 외관이 흰색에서 자외선 아래에서 보이는 강한 노란색으로 변합니다. 표지되지 않은 폴리머 용액은 어둡게 유지되는 반면 플루오레세인 표지 폴리머는 밝은 녹색으로 빛나며 렉틴 코팅 비드에 대한 라벨 특이적 결합의 존재를 확인하며, 펜던트 설탕 잔류물을 운반하는 폴리머에서만 비드가 결합될 때 녹색으로 빛나고, 펜던트 설탕 잔류물이 없는 폴리머로 처리하면 어둡게 유지됩니다. 이 뗏목 기반 중합 기술은 합성할 수 있는 글리코 폴리머 유형에서 뛰어난 유연성을 허용합니다.

글리코 폴리머의 후속 라벨링은 또한 수성 환경에서 1차 수단과 반응할 수 있는 다양한 형광 시약을 사용하여 달성할 수 있습니다. 글리코 생물학 분야의 연구자들은 이 기술을 사용하여 매우 다재다능하고 정의된 글리코 폴리머를 쉽게 얻을 수 있습니다. 이러한 글리코 폴리머는 낭포성 섬유증 환자 또는 많은 유형의 인간 암에 관련된 환자의 호흡기에서 관찰된 것과 같은 탄수화물 결합 특이성을 탐색하기 위한 도구로 사용할 수 있습니다.