RAFT 중합 제어를 통해 트라이 구성 요소 형광 Glycopolymers의 손쉬운 및 효율적인 준비

본 절차의 전반적인 목표는 가역적 첨가-분열 연쇄 이동(RAFT) 중합법을 사용하여 형광 통계적 선형 글라이코폴리머를 정밀하게 합성하는 것입니다. 이는 먼저 글라이코 단량체인 2-락토바이오에틸 메타크릴아미드(L-A-E-M-A)를 합성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 L-A-E-M-A, N-(2-아미노에틸)메타크릴아미드(AEMA) 및 N-(2-하이드록시에틸)아크릴아미드(HEAA)의 RAFT 중합을 통해 이에 대응하는 낮은 분산도의 글라이코폴리머를 합성하는 것입니다.

다음으로, 글리코 폴리머의 일차 아민 중 하나를 카르복시 플루오레세인 자토 미들 에스테르와 반응시켜 수정함으로써 플루오레세인이 결합된 글리코 폴리머를 생성합니다. 마지막 단계는 플루오레세인이 결합된 글리코 폴리머를 알려진 탄수화물 결합 특성을 가진 렉틴 코팅 아가로스 비드에 결합시키는 것입니다. 최종적으로, 형광 현미경을 사용하여 글리코 폴리머의 아가로스 비드 결합 여부를 분석함으로써, 해당 글리코 폴리머가 목적 탄수화물을 보유하고 있으며 형광 태그가 표지되었음을 확인합니다.

기존의 일반적인 자유 라디칼 중합을 이용하는 방법과 비교했을 때 RAF 중합의 장점은, 이 과정이 개시제 유래 사슬의 수를 최소화하는 제어 중합 기술이라는 점입니다. 그 결과, 미리 정해진 분자량과 매우 좁은 다분산 지수를 갖는 폴리머를 얻을 수 있습니다. 이러한 중합법은 특정 형광 글라이코폴리머(glycopolymer)를 제조하기 위해 정의된 단량체 혼합물에 적용될 수 있습니다.

이들 글리코 폴리머는 렉틴 코팅 비드를 사용하여 확인할 수 있는 정의된 결합 능력을 가지고 있습니다. 형광 글리코 폴리머의 효율적인 제조는 향후 글리코 생물학 연구에 큰 가치가 있을 것입니다. 먼저, 무수 메탄올 3 mL에 락토바이오닉산 2 g을 녹이십시오.

다음으로, 용액이 막 탁해질 때까지 절대 에탄올을 천천히 한 방울씩 첨가합니다. 회전 증발 농축기를 사용하여 모든 용매를 제거합니다. 이 과정을 세 번 반복하여 98%의 수율로 1.94g의 lacto bioo one five lactone을 생성합니다.

메탄올 3 mL에 녹인 1 g의 lacto bio lactone 용액을 메탄올 2 mL에 녹인 A EMA 및 MEHQ 용액에 첨가합니다. 다음으로, triethylamine 1 mL를 첨가하고 실온에서 혼합물을 교반합니다. 48시간 후, 혼합물에 탈이온수 20 mL를 첨가하고 이를 회전 증발기로 옮깁니다.

완전히 건조될 때까지 증발시킵니다. 잔류물을 20 milliliters의 탈이온수에 녹인 후, 이 용액을 10 by 20 millimeter 음이온 교환 컬럼 상단에 도포합니다. 1 milligram의 MEHQ가 들어 있는 비커를 출구 아래에 놓고, 컬럼을 용출시켜 비커에 받습니다.

회전 증발기로 용액을 농축한 후, 잔류물을 20 milliliters의 탈이온수에 녹이고 1 milligram씩 이온 교환 수지를 첨가합니다. 용액 1 microliter를 취해 박층 크로마토그래피 플레이트에 도포하여 수분 테스트를 수행하고, 결과가 음성이 될 때까지 이를 반복합니다. 플레이트에 2% anhy 에탄올 용액을 분사하고 핫플레이트 위에서 90 °C로 1분 동안 가열합니다.

더 이상 푸른색이 나타나지 않으면 종말점에 도달한 것입니다. 다음으로, 유리 여과 깔때기를 사용하여 용액을 시험관으로 여과합니다. 용액을 -80 °C에서 냉동시킨 후, 동결 건조기로 옮겨 동결 건조합니다.

잔류물을 최소량의 메탄올에 용해시킨 후, -20 °C의 무수 아세톤을 첨가하여 생성물을 침전시킵니다. 프리트 유리 깔때기를 이용한 여과를 통해 침전된 L-A-E-M-A를 수집합니다. 깔때기와 침전물을 진공 데시케이터로 옮겨 건조시키며, 먼저 2 mL 시험관에 약 150 mesh 알루미늄 옥사이드 나노입자 0.5 g과 상업용 등급의 HEAA 1 mL를 넣습니다.

튜브를 300 ×g에서 30초 동안 원심분리하고, 상층액을 억제제가 제거된 HEAA로 조심스럽게 사용하십시오. L-A-E-M-A 32.8 mg, a EMA 1.7 mg, 억제제가 제거된 HEAA 27.5 µL 및 탈이온수 0.4 mL를 용해시킨 후, 이 용액을 깨끗이 세척된 1 mL 플래스크 튜브로 옮기십시오. 다음으로, RAFT 시약 50 µL와 개시제 시약 50 µL를 튜브에 넣고 밸브를 닫은 상태에서 튜브 측면을 가볍게 두드려 섞으십시오. 튜브를 진공 라인에 연결하고 드라이아이스-에탄올 배스를 사용하여 내부 물질을 동결시키십시오.

그 다음 펌프를 사용하여 튜브 압력을 50 millitorr에 가깝게 낮춘 후 밸브를 닫습니다. 드라이아이스 배스를 제거하고 내용물이 녹도록 둡니다. 동결-진공-해동 사이클을 주의 깊게 두 번 더 반복합니다.

튜브 내부의 내용물이 완전히 용해되었는지 확인하고, 필요한 경우 가볍게 볼텍싱합니다. 안착시키기 전에 진공 라인에서 닫힌 튜브를 제거하여 투명 플라스틱 진공 백에 넣습니다. 플라스틱 핸드 펌프를 사용하여 백 내부의 공기를 제거합니다.

그런 다음 백을 70 °C의 덮개가 있는 항온수조에 24시간 동안 둡니다. 이어서 백에서 튜브를 꺼내고 그 내용물을 분자량 컷오프가 3,500 Daltons인 투석 백으로 옮깁니다. 투석 백을 비커에 넣고 2 L의 탈이온수로 24시간 동안 투석합니다.

투석 막의 내용물을 시험관으로 옮기고 -80 °C의 냉동고에 보관하십시오. 완전히 얼면 동결건조기로 옮겨 동결건조하십시오. 솜처럼 하얀 glyco polymer PMA LA EMA를 얻으려면, 먼저 0.9 mL의 PBS에 5 mg의 PMA LA EMA를 녹여 용액을 준비하십시오.

다음으로, 100 µL의 dimethylformamide에 녹인 0.6 mg의 carboxy fluorescein succinimidyl ester를 빠르게 교반 중인 용액에 천천히 첨가합니다. 마이크로 튜브를 호일로 감싼 후, 상온에서 16시간 동안 천천히 교반합니다. 용액을 분자량 컷오프(molecular weight cutoff)가 3,500 Daltons인 투석막으로 옮깁니다. 투석막을 비커에 넣고, 빛이 차단된 상태를 유지하며 2 L의 탈이온수로 16시간 동안 투석합니다. 투석막의 내용물을 시험관으로 옮깁니다.

용액을 -80 °C에서 동결시킨 후 동결 건조합니다. 솜사탕처럼 폭신하고 노란색을 띠는 형광 표지된 P-M-A-L-A-E-M-A 당글리코폴리머를 얻기 위해, HPLC 시스템을 사용하여 당글리코폴리머의 수평균 분자량, 중량평균 분자량 및 분산도를 측정합니다. 먼저 원심분리 튜브에 들어있는 50 µL의 erythro-lectin 코팅 aro-beads 현탁액에 1.5 mL의 PBS를 첨가합니다.

그 다음 튜브를 300 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 이어서 상층액을 제거하고 세척 과정을 두 번 더 반복한 후, 마지막으로 0.5 milliliters의 PBS를 첨가합니다. 렉틴이 코팅된 비드가 들어 있는 튜브에 6 microliters의 PBS에 녹인 3 micrograms의 fluorescein 표지 PMA LA EMA 용액을 첨가합니다.

fluorescein 표지 P-M-A-G-A-E-M-A를 음성 대조군으로 사용합니다. 그다음, 튜브를 알루미늄 호일로 감싸고 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 튜브를 1분 동안 원심 분리하고 상층액을 제거합니다.

그런 다음, 새로운 PBS 1.5 milliliters에 비드를 재현탁하고 세척 과정을 3회 반복합니다. 마지막으로, PBS 0.2 milliliters에 비드를 재현탁합니다. 현탁된 비드 4 microliters를 면역형광 현미경 슬라이드의 웰에 옮기고, 유리 커버 슬립으로 덮은 후 기록합니다.

10배 대물렌즈의 FITC 필터와 카메라가 장착된 형광 현미경을 사용하여 슬라이드 이미지를 촬영하였습니다. 글라이코폴리머는 젤 투과 크로마토그래피로 분석하였습니다. RAFT를 사용하지 않고 합성된 폴리머는 RAFT를 사용하여 제조된 폴리머보다 분산도가 훨씬 높습니다.

플루오레세인(fluorescein)으로 표지하면 글라이코 폴리머(glyco polymer)의 외관이 흰색에서 UV 광원 아래에서 강한 노란색으로 변합니다. 표지되지 않은 폴리머 용액은 어둡게 유지되는 반면, 플루오레세인 표지 폴리머는 밝은 녹색으로 발광하여 표지의 존재를 확인시켜 줍니다. 렉틴(lectin) 코팅 비드에 대한 특이적 결합은 펜던트 당 잔기를 가진 폴리머에서만 발생하며, 이 경우 비드가 녹색으로 발광하는 반면, 펜던트 당 잔기가 없는 폴리머로 처리했을 때는 어두운 상태로 유지됩니다. 이러한 RAFT 기반 중합 기술은 합성 가능한 글라이코 폴리머의 종류에 있어 매우 높은 유연성을 제공합니다.

이후의 글라이코 폴리머 표지는 수성 환경에서 1차 아민과 반응할 수 있는 매우 다양한 형광 시약을 사용하여 수행할 수 있습니다. 당생물학 분야의 연구자들은 이 기술을 통해 매우 다재다능하고 정의된 글라이코 폴리머를 용이하게 얻을 수 있습니다. 이러한 글라이코 폴리머는 낭성 섬유증 환자의 호흡기 계통이나 여러 유형의 인간 암에서 관찰되는 것과 같은 탄수화물 결합 특이성을 탐구하는 도구로 사용될 수 있습니다.