Name: 내피 세포 접착 정량 체외 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 학습하세요 내피 세포 접착 정량 체외 방법을 사용하여 인간 관상동맥 내피 세포의 접착성을 측정하는 기술입니다. 형광 표지 단핵구를 활용한 이 실험법은 혈관 생물학 연구에서 세포 접착의 정확한 정량화를 가능하게 합니다.

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우리는 전폭적인 지원을 해준 Simon Bouffler와 인프라 지원을 해준 영국 공중 보건국에 매우 감사합니다. 이 연구는 NIHR(National Institute for Health Research) 보조금을 통해 영국 공중보건국(Public Health England)의 지원을 받았습니다. 이 보고서는 NIHR의 의뢰를 받은 작업입니다. 이 간행물에 표현된 견해는 저자의 견해이며 반드시 NHS, NIHR 또는 보건부의 견해는 아닙니다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.

유리 Coverslips는 1. 준비 <ol><li> 에탄올을 모두 커버 슬립의 총 노출을 보장하기 위해 때때로 교반하면서 적어도 10 분 동안 70 % 에탄올에 담가들을 커버 글라스 원형 12mm 직경 소독. 무균 세포 배양 접시에 커버 글라스와 에탄올을 붓고 (중 6cm 또는 10cm 직경). </li><li> 멸균 미세 5B 집게 한 쌍의 픽업과 24 잘 클러스터 판의 우물에 각각의 유리 커버 슬립을 배치합니다. 커버 슬립이 잘의 측면을 감동과 잘의 중간에 약입니다되지 않도록주의하십시오. </li><li> 흐름 캐비닛에 건조 커버 글라스와 유엔 덮인 24 아니라 클러스터 판을 둡니다. 이 약 10 분 소요 </li><li> 이 기간 동안 0.1 ㎎ / ㎖에 행크 평형 염 용액 (HBSS)에 10 ㎎ / ㎖ 인간 피브로넥틴 희석하여 도포 혼합물을 준비한다. </li><li> 커버 슬립은 건조되면, 각 공동 유리 상 코팅 용액 100 μL 피펫그래서 verslip 솔루션은 물론 외부의 주위에 풀링없이 만 유리를 포함한다. 시간 이상 세포 배양 인큐베이터에 덮여 24 잘 클러스터 판을 놓습니다. </li><li> 사용 직전, 코팅 용액을 제거한다. 동일한 코팅 용액은 멸균 튜브에 옮기고 효능의 눈에 보이는 손실이 세 번까지 사용할 수있다. </li></ol> 내피 세포 단일 층의 2 준비 <ol><li> 37 ° C에서 중간 및 5 % 이산화탄소에서 배양 인간 동맥 내피 세포 (EC). </li><li> 문화 미디어를 대기음 10 ml의 HBSS와 EC 단일 층을 씻어 </li><li> HBSS 대기음 및 추가 2 ml의 0.5 % 트립신, 0.2 % EDTA 솔루션입니다. 약 5 분 동안 실온에서 인큐베이션. </li><li> EC는 플라스크의 측면에 탭에 의해 탈락 할 수있는 경우, 대두 트립신 억제제의 5 mL를 추가하고 피펫으로 상기 셀을 제거하기 위해, 플라스크의 표면 물총. </li><li> 15 ML 튜브와 원심 분리기 튜브에 세포를 전송5 분 200 XG에. </li><li> 뜨는 대기음 미디어 5ml에 EC 펠렛을 재현 탁. 혈구와 세포를 세어 EC 미디어 ml의 당 50,000 EC에 세포 농도를 조정합니다. </li><li> 피복 된 유리 커버 슬립을 함유하는 24 웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 1 ㎖를 분배. 37 ° C 플러스 5 % 이산화탄소에서 세포 배양 인큐베이터에서 세포 O / N을 부화. </li><li> 합류 단층를 3 일 내에 형성되는 경우 세포는 실험에 사용하기위한 준비가되어있다. </li></ol> 단핵구 3. 준비 <ol><li> RPMI에서 배양 전송 HL-60 세포를 15 ml 튜브에 현탁 배양으로, 10 % 우태 혈청으로 보충. 5 분 동안 200 XG에서 세포를 원심 분리기. </li><li> 5 ml의 배지에 재현 탁하고 세포 상등액을 제거하고 2 백만 세포 / ml로 미디어 세포 농도를 조절한다. HL-60의 형광 라벨을 원하는 경우, 혈청없이 RPMI PR에 세포를 재현 탁4 절에 설명 된대로 oceed. </li><li> 1과 3 사이의 시간의 선택 일정 기간 EC 단층을 함유 24 웰 클러스터 플레이트의 각 웰에 HL-60 세포 현탁액 0.5ml를 추가하고 37 ° C, 5 % 이산화탄소에서 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 부화 시간. 약간의 차이가 바인딩 포화가 달성 1 시간과 3 시간의 시간 점 사이에 관찰된다. </li><li> 세포 세척 / 수확 준비 : HBSS 100 ml의 120 ML 튜브를 입력합니다. 새로운 24 웰 플레이트의 각 웰에 포르말린 1 mL로 분배. </li><li> 를 만지지 않도록주의하면서 잠복기 후, 날카로운 집게의 쌍을 사용하고 우물에서 유리 커버 슬립을 선택하고 수직 커버 슬립을 누르고 3 초 동안 벤치에 조직의 조각에 커버 슬립의 가장자리를 가볍게 두 드리 조직과 커버 슬립의 세포 덮인 표면. </li><li> 포셉 한 쌍 단단히 커버 슬립을 잡고 및 HBSS 다섯 번에서 커버 슬립 덩크. </li><li> 다섯 번째 덩크 후HBSS에서 3 초 동안 조직에 커버 슬립의 가장자리를 두드려. </li><li> DAB 다음 5 덩크 세 세트의 총을, 3.6 및 3.7에 설명 된 덩크와 뿌리며 마치 절차를 반복합니다. </li><li> 실온에서 세포를 해결하기 위해 잘 포함 10 % 포르말린에 커버 슬립을 전송합니다. 커버 슬립은 열거에 대한 준비가 장기 저장 또는 아래에 설명 된 다른 절차를 실시한다. </li></ol> 세포 추적기와 HL-60 세포의 4. 라벨 (선택 사항) <ol><li> 개수 및 15 mL의 원심 분리 튜브로 HL-60 세포 (예를 들어, 1000 만) 적당량 옮긴다. 원심 분리기 HL-60 5 분 200 XG에 세포. 상층 액을 제거합니다. </li><li> 1 백만 세포 / ml의 농도에서 혈청없이 RPMI 배지에서 세포 추적기에 재현 탁 된 세포 펠렛. 1 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 품어. </li><li> 200 XG에 원심 분리기 세포 5 분 동안 상층 액을 버린다. 2,000,000 (C)의 농도로 배지에서 재현 탁 된 세포 펠렛ELL 학생 / ㎖. </li><li> 유리 커버 슬립에 성장 각 웰에 들어있는 내피 세포에 세포 추적기 표지 HL-60의 0.5 ML을 추가합니다. 3.3에서 계속합니다. </li></ol> 접착제 내피 세포의 5 열거 <ol><li> 현미경 개별 세포를 식별하기 위해 DAPI 반대 얼룩 슬라이드에 마운트 된 커버. </li><li> 4 배 또는 10 배 목적으로 거꾸로 현미경을 사용하여, 여러 분야 (예를 들어, 5 필드)의 이미지를 획득하고 유엔 조사 내피 세포에 집계 단핵구의 가장 높은 수를 (이것은 일반적으로 3-5이어야 함) 계산합니다. </li><li> 내피 세포에 단핵구의 임계 값으로 두 번이 번호를 설정 그 클러스터로 정의한다. 필요한 경우, 다른 기준은 실험의 성질에 따라 클러스터를 정의하는데 사용될 수있다. </li><li> 클러스터의 개수 및 필드 내피 세포의 개수를 카운트. 접착제 내피 세포의 비율을 얻기 위해, 후자가 전자를 나눈다. 점수다수의 필드 카운트의 평균 및 표준 편차를 얻었다. </li></ol> 항체 6.으로 대조 <ol><li> 커버 슬립에 부착 분석법 및 세포를 RT에서 15 분 동안 10 % 포르말린으로 고정 된 후에, 표준 절차 (10) 및 원하는 항체를 사용한 면역 형광에 커버 슬립 대상. </li><li> 추가 및 내피 세포에 부착 된 단핵 세포를 빠지 피하기 위해 매우 조심스럽게 다양한 솔루션을 제거합니다. </li></ol> 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 아제의 활동 7.으로 대조 <ol><li> 커버 슬립에 부착 분석 및 세포 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 제 활성을 15 분, 얼룩을 위해 포르말린에 고정 된 후 염색 키트와 함께 제공되는 사용 설명서의 설명에 따라. 추가 및 내피 세포에 부착 된 단핵 세포를 빠지 피하기 위해 매우 조심스럽게 다양한 솔루션을 제거합니다. </li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

상술 단핵구 접착 분석은 내피 단층 (10) 위에 전리 방사선의 생물학적 효과를 연구하기위한 실험에 성공적으로 사용되었다. 이것은 내피 단층의 접착 성을 평가하기 위해 사용할 수있는 유일한 방법은 아니지만 점착성 단일 층 내의 비율 또는 내피 세포의 비율의 정량을 허용하는 유일한 방법이다. 이 단핵 세포의 접착 글로벌 양적 변화로서 중요한 차이이며, 다른 방법에 의해 측정 한 내피 단층 또는 내피 세포의 서브 모집단의 증가 접착 모든 세포 접착 일반 상승를 기인 할 수있다 단일 층 내에서,로 위의 예에서와 같이. 이러한 정보를 갖는 값이 조사되었다 이네스 후 향상된 접착 능력을 나타내 내피 세포의 백분율을 정량화하는 사실에 의해 예시이 효과는 접착했다 세포의 비율과 같은 특정 유전자의 유전 적 변이로 인해 아니라고 할 결론은 선량 X-방사선에 의해 유전자의 무작위 돌연변이으로부터 예상되는 것을 (1000 회 이상)의 상술 크게했다 . 결과의 재현성을 가능 요소는 세척 제도이다. 세척 절차는 조직에 뿌리며 마치 다음 세척 완충액으로 유리 커버 슬립의 침적을 수반 같이, 필연적 웰로 세척 완충액의 피펫의 이전 방법에서 발생 버퍼 난류의 변동은 회피된다. 실제로 이는 세척 단계에서 변동 요소를 제거 세척 과정을 고안하라고 강요 피펫 팅 방법을 사용하여 수득 복제 사이의 과도한 변동이 관찰되었다. 틀림없이, 필요로하는이 분석 거짓말의 한계는 N 할 단핵구 클러스터의 수동 계산을 수행하기 위해OT는 높은 처리량 분석을 위해 적응 될 수 있도록. 둘째, 많은 단핵구는 클러스터를 구성하는 방법에 대한 결정은 세미 임의로 결정되어야하고 레벨이 너무 높게 설정 및 일부 정품 클러스터 제외 초래할 수있다. 이 방법에서의 전단력의 부족은 또한 혈관 내피 세포의 접착 성이 크게 개선 된 유도되는 실험 (예를 들면, + TNFα)의 한계로 볼 수있다. 이 접착 덜 과장된 보강의 검출을 허용하는 다른 상황에서는 그러나, 전단력의 부족 장점이다. 단핵 세포 접착에 겸손한 증가가 특히 중요하고 관련이있을 수 있습니다. 생체 내, 단핵 세포는 (일반적인 실험 시간에) 힘을 전단 크게 인해 접착에 겸손한 증가와 내피 세포에 큰 숫자에 첨부 할 것으로 예상되지 않는다. 시간 그러나, 일부 단핵구 아마 것, 이것은 만성 염증의 환경을 나타낼 가능성이 높습니다. 이와 같이,이 접착에 겸손 증가 전단 응력으로 관찰 할 수 있도록 일반적으로 짧은 가능성이 너무 덧 ​​있습니다 실험 시간 프레임에서 공개 될 내피 세포 접착에 작은 증가를위한 기회를 제공하기 때문에 전단력의 부재는 장점이 될 수 있습니다. 위의 증명으로 특정 세포 단백질이나 세포의 상태에 특정 내피 세포의 접착의 연결을 허용하는 등 노화 분석 및 면역 형광 염색 등의 분석이 분석 한 후 세포를 대상 수있는 능력은, 기능을이 방법의 유용성을 증가하는 이전 접착 분석을 사용할 수 없습니다. 이 방법은 est2 - 불멸화 인간 동맥 내피 세포와 비슷한 결과가 사용되고 또한 단지 특정 세포주 특정 아니라고 보여주는 차 인간 동맥 내피 세포 (10)를 얻었다. 또한, ADO내피 세포의 접착 성을 분석하는이 방법의 ption 레이블 면역 세포의 형광을 측정하는 표준 접착 분석에 동일한 세포를 실시 배제하지 않는 것으로 이해되어야한다. 함께,이 보고서는이 방법이 포함 다양한 표준 접착 분석보다 더 많은 정보를 제공하는 것을 보여줍니다.

이러한 혈관 내피 세포 라인 층 전체 단핵구와 같은 면역 세포 침윤은 염증 하나의 과정에서 중요한 단계이다. 이 부상의 사이트에 면역 세포 (면역 세포)의 원점 복귀를 할 수 있습니다. 이러한 관상 동맥 및 경동맥 다른 인스턴스와 지역에서는 내피 층을 통해 단핵 세포의 침윤은 잠재적 플라크 (2)의 형성으로 이어지는 동맥의 벽에 이들 세포의 바람직하지 않은 장기 체류가 발생할 수있다. 면역 세포 침윤의 모든 경우에서, 첫 번째 단계는 혈관의 국부적 인 영역에서의 내피 세포의 활성화를 수반한다. 내피 세포 등의 내피 세포 표면 3- 상 면역 세포의 모집 및 부착을 용이 예컨대 VCAM, ICAM 및 E 셀렉틴과 같은 세포 표면 단백질의 발현을 증가시키기 TNF-α 및 IL-6과 같은 염증성 사이토킨에 의해 활성화된다 6. 7 내피 부착 단핵구를 계산함으로써 수행 하였다. 정밀도의 관점에서 이러한 방법의 한계는 림프구 또는 단핵구 밀착성 4에 대응 방사성 물질의 정량 하였다 무선 표지 된 림프구 또는 단핵구의 사용되었다. 이 방법은 결국 8 측정된다 관심 면역 세포가 차분 대신 방사능의 형광되고있는 상기와 같은 방법으로 형광 염료로 표지 하였다하고있다 형광 계 방법에 의해 대체되었다. 현재이 방법은 가장 편리한로 떠오르고있다 몇몇 상업 공급 업체 키트 형태로 판매되고있다. 이 분석은 제어 및 실험 샘플 사이의 밀착성의 상대적인 수준을 측정 할 수 있지만, 형광의 변화가 전체에 걸쳐 예를 접착 일정한 변화로 인한 것인지 공개하지 않는다ndothelial 세포군 또는 변화로 인해 세포의 하위 집단 내 밀착성의 차이 인 경우. 그것은 세정 엄격함이 결과에 큰 효과를 발휘하고, 더욱 중요한 것은, 다른 내피 세포 단층 사이의 결합되지 않은 단핵구를 헹굼 균일 샘플 사이 결과 복제 결과의 근접성 및 재현성에 큰 영향을 줄 수 있음도 분명하다 . 최근에, 내피 세포 단층에 걸쳐 미디어에 단핵구 펌프 몇몇 시스템에서는이 문제를 해결하기 위해 구를 사용 하였다. 또한, 이러한 플로우 시스템은 또한 내피 세포상의 전단력의 영향 요점을 되풀이. 이러한 시스템의 장점은 명확하고 매우 매력적이지만 급성 염증의 경우와 같이, 그러한 같은 전리 방사선 등 TNFα, 다른 활성제와 같은 요인들에 의해, 내피 세포 접착 성이 크게 증대 될 수있는 동시에 실현하는 것도 중요 10 야기가 T는 변경모자는 쉽게이 매우 엄격한 시스템에 의해 체외 실험 시간 프레임 내에서 검색되지 않습니다. 내피 세포 접착 이러한 미세한 변화를 쉽게 놓친 또는 시험 관내에서 기각 반면, 만성 염증의 특성 인 수명, 내 같은 작은 변화가 매우 심각한 결과를 발휘할 수있는 생체 내에서 반드시 양성 아니다. 따라서 강력한, 아직 민감하고 구체적인 방법 감지하고 내피 세포 접착이 필요한 측정합니다. 여기서는 직접 내피 세포의 접착 성을 측정하는 방법을보고한다. 이 방법은 내피 세포 접착의 대리 지표로서 간접 형광 측정에 의존하지 않는다. 그것은 접착의 변화가 모든 셀에 걸쳐 균일 한 변화로 인해 또는 하위 집단에 국한 여부를 알 수있다. 또한, 이러한 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 제, 세포 생존력 마르 마커 내피 세포의 공동 - 염색을 허용KER, Calcien 오전 및 특정 세포 상태 또는 특정 단백질의 발현 개별 접착제 내피 세포의 연결을 허용하는 세포 표면 및 세포 내 단백질에 대한 항체.

<table><tbody><tr><td>Hepes Buffered Saline Solution (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips Round 12 mm Diameter</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>24-well cluster plate</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Meso-Endo Cell</td><td>media Cell Applications</td><td>212-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Soybean 트립신 억제제</td><td>Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>세포 추적기 Green</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Life Technologies</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>베타 glasctosidase 분석 키트&nbsp; &nbsp;</td><td>셀시그널링</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>피브로넥틴</td><td>시그마</td><td>F0895</td><td></td></tr></tbody></table>

내피 세포 접착 정량<em&gt; 체외</em

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

염증의 기본적인 프로세스 중 하나는 주변 조직에 혈관의 내강에서 면역 세포 침윤이다. 혈관 라인 내피 세포, 예컨대 단핵 세포로 면역 세포 순환에 접착 될 때 발생한다.이 밀착성의 시험 관내 측정 이제 직접 카운트로 어느 내피 층에 부착 단구의 총 수를 정량함으로써 수행 될 때까지 또는 부착 된 단핵 세포의 형광의 간접적 인 측정에 의해. 이러한 측정은 내피 세포 집단의 평균 접착 성을 표시 할 수 있지만, 그것들은 예컨대 셀 번호 등과 같은 여러 요인들에 의해 혼동되고, 실제로 접착되어 내피 세포의 비율을 공개하지 않는다. 여기에 우리가 설명하고 내피 세포 단층의 테스트 인구 내에서 접착 세포의 열거를 할 수있는 방법을 보여줍니다. 내피 세포는 커버 글라스에 성장하고 원하는 다음처리 (즉,이 형광 표지 할 수있다) 단핵구와 도전. 침지 및 배수 여러 발사 관련된 인큐베이션, 세정 절차 후, 세포를 고정한다. 단핵 세포에 의해 둘러싸여있다 접착제 내피 세포는 용이하게 식별되고 접착제이다 모집단 내의 내피 세포의 실제 비율을 보여준다 부착 인덱스를 부여 열거된다.

이 방법은 모집단 내의 개별 접착제 내피 세포의 검출을 허용한다. 예를 들어, 유엔 조사 내피 세포의 단층은 (이전에 개별 내피 세포 주위 클러스터에서 단핵 세포에 의해 구속 된 단핵 세포와 배양에 칠일 후 10Gy의 조사에서 배양 및 세척, 내피 세포 단층 다음과 같은 몇 산발적 HL-60 단핵구를 유지하면서 그림 1). 이 현상은 위상차 현미경 하에서 용이하게 관찰 할 수 있지만, 형광 현미경은 단핵구 클러스터에도 선명한 영상을 보여준다. 기재된 접착 분석을 수행 한 결과, 표준 면역 형광 방법에 적합한 항체를 사용하여 막, 세포질 또는 핵 (도 2)에 대해 단백질을 세포 염색을 진행하는 것이 가능하다. 또한, 같은 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 아제 (그림 3)와 같은 효소 기반의 분석은 또한 PE 될 수 있습니다rformed. 각 단핵구 클러스터 개별 내피 세포에 상당하기 때문에, 클러스터 열거 단층 내의 접착제 내피 세포의 실제 수를 공개한다 (도 4), 및 인구 내의 접착제 내피 세포 따라서 비율 (표 1,도 6) . 이 내피 세포 접착의 이러한 정량화 할 수 있습니다 지금까지 유일한 방법입니다. 그것은 여기에서 실험에 사용 내피 세포는 접촉 억제하고 합류 달성 후에 수가 증가하지 않는다는 것을 주목할 필요가있다. 이것은 나중에 포인트 증가 내피 세포 수로 인한 잠재적 인 복잡성을 제거합니다. 원한다면, 내피 단층 부착 단핵구 (3.9 대신 고정) 0.5 % 트립신 0.2 % EDTA 용액에 의해 탈락 할 수 있으며 현대 법의 경우 (도 5)와 같이 그 형광, 플레이트 판독기를 사용하여 측정. </P&gt; <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> 내피 세포의 단층에 단핵구의 그림 1. 접착. 미 조사 된 내피 세포는 단핵구는 산발적으로 랜덤 방식으로 개별 셀 (패널 왼쪽)와 같은 사후 10 Gy를 조사 7 일 개별 내피 세포에 클러스터에 부착 된 단일 층 (오른쪽 패널). 낮은 패널은 위상차에서 볼 수있는 작은 밝은 구형 세포가 실제로 세포 추적기 녹색 미리 라벨링 된 단핵 세포임을 확인 상단 패널의 형광 이미지입니다. 단핵구 클러스터의 일부는 흰색 화살표로 표시됩니다. 이미지는 10 배 목표를 사용하여 촬영 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <html><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> 단백질 후 접착 분석을위한 내피 세포의도 2 염색법은. 바와 접착 분석을 수행 한 후, 커버 글라스의 셀 (A) 막 단백질의 검출 (CD44)에 대한 면역을 실시하고, b) 세포질 단백질 (튜 불린) 또는 c) 핵 단백질 (γ-H2AX). (A)와 쇼 단핵구 세포 추적기 녹색과 오른쪽 패널에 비슷한 이미지 미리 라벨링 (20X의 목적으로 본) (B)의 왼쪽 패널은 CD44과 미세 소관 (적색) 및 DAPI 염색 핵 (파란색)를 알 수있다. γ-H2AX에 대한 항체로 염색 한 조사 내피 세포의 핵에 (C) 지점에 흰색 화살표. DAPI로 밝은 청색 염색 단핵구 핵 쉽게 내피 세포의 핵 타원형 구별된다. 이미지는 20 배 목표로 촬영했다.<html> jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> 내피 세포에서 알 수있는 바와 같이 내피 세포의 그림 3. 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 제 염색. 접착 분석 한 후, 커버 슬립에 세포, 노화 세포의 리소좀이 파란색으로 원인이 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 아제를 위해 염색을 실시 하였다 그 선택적으로 인해 작은 크기와 구형 쉽게 식별 다수의 단핵 세포에 의해 바인딩됩니다. 20X 목표를 통해 본 이미지입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 2924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; 개개의 내피 세포에 단핵구 클러스터도 4 열거. 접착 분석 한 결과, 세포의 이미지는 여러 다른 위치 식별 및 단핵구 클러스터에서 촬영하고, (녹색) 원. 클러스터는 내피 세포에 10 이상의 단핵구의 응집으로 정의 하였다. 이미지의 단핵 세포 클러스터와 십이일 후 조사 내피 세포의 수의 수 (빨간색 점선)를 계산하고, 계산 부착 내피 세포의 비율이 10 배 목표를 찍은 표 1. 그림과 같이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> 그림 부착 단핵 세포의 형광 5. 정량화. 다음 adhE 유전자가 결실<html> 시온 분석은, 커버 글라스에 세포 trypsinised하고 단핵구의 형광 내피 단층의 밀착성의 간접 지표로서, 형광 플레이트 판독기를 사용하여 측정 하였다 CellTracker 녹색 미리 라벨링. 진술 일 후 조사에서 이러한 측정의 결과를 얻을 수 위의 그래프에 엮어했다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> 그림 4에서 설명하고 결과는 조사의 십이일 후 10 Gy를 조사, 8~10%을 보여주는 위의 표에 같이 세 가지 커버 글라스에 5 개의 서로 다른 위치에 1 접착제 내피 세포 득점 한 테이블에서 접착 시험 점수의 그림 6. 표현 내피 세포 접착되었다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; 접착제의 백분율 내피 세포 </td></tr><tr><td></td><td> 디스크 1 </td><td> 디스크 2 </td><td> 디스크 3 </td></tr><tr><td> 필드 1 </td><td> 8.65 </td><td> 8.29 </td><td> 8.21 </td></tr><tr><td> 필드 2 </td><td> 10.44 </td><td> 7.27 </td><td> 7.21 </td></tr><tr><td> 필드 3 </td><td> 9.63 </td><td> 9.05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> 이 필드 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7.09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> 필드 5 </td><td> 10.55 </td><td> 9.4 </td><td> 11.61 </td></tr><tr><td> 평균 </td><td> 10.07 </td><td> 8.22 </td><td> 8.75 </td></tr></tbody></table> 표 1. 접착 분석을 기록했다. F에 기술 된 바와 같이 세 개의 커버 글라스에 5 개의 서로 다른 위치에 접착제 내피 세포는 득점했다igure 4 및 결과 십이일 10 Gy를 조사 후, 조사 된 내피 세포를 8-10 %가 접착 된 것을 보여주는 위에서 표로.

우리는 내피 세포 단층 내에서 접착 세포의 실제 수를 정량화할 수 있는 시험관 내 방법을 보고합니다.

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 체외(in vitro)에서 혈관 내피 세포의 접착력을 정량화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 24-웰 클러스터 플레이트 내에서 피브로넥틴(fibronectin)이 코팅된 커버슬립을 준비합니다. 그다지 인간 관상동맥 내피 세포를 유리 커버슬립에 도포하고, 내피 세포 단일층이 융합될 때까지 배양합니다.내피세포에 원하는 처리를 수행한 후, 형광 표지된 단핵구를 글라스 커버슬립에 첨가하고 내피세포 단층과 함께 배양합니다. 마지막 단계는 커버슬립을 세심하게 담그고 세척하는 과정을 통해 내피 단층에서 결합되지 않은 단핵구를 제거하는 것입니다. 결과적으로, 이 방법을 통해 특정 처리 후 접착력을 가지는 내피세포 집단의 비율을 정량화할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 현재의 모든 방법으로 측정하는 내피세포 단층의 전반적인 접착력이 아니라, 접착된 내피세포의 실제 수나 백분율을 측정한다는 점입니다. 저희는 현재 이용 가능한 방법들을 사용하여 내피세포의 ADI를 측정하려 했으나, 이러한 방법들에 내재된 기술적 문제로 인해 결과에서 용납할 수 없을 만큼 큰 편차가 발생하는 것을 확인한 후 이 방법의 아이디어를 처음 얻게 되었습니다. 모든 커버슬립이 에탄올에 완전히 노출되도록 가끔 흔들어주면서, 70% ethanol에 최소 10분 동안 담가 직경 12 millimeter의 원형 유리 커버슬립을 멸균하였습니다.그런 다음 멸균된 미세 5B 핀셋을 사용하여 모든 유리 커버슬립과 에탄올을 멸균된 세포 배양 접시에 옮깁니다. 각 유리 커버슬립을 집어 24-웰 클러스터 플레이트의 웰에 하나씩 배치합니다. 이때 커버슬립이 웰의 벽면에 닿지 않도록 주의하며 웰의 대략 중앙에 위치시킵니다. 유리 커버슬립이 담긴 24-웰 클러스터 플레이트를 덮지 않은 상태로 클린벤치 내에서 건조시킵니다.이 과정은 약 10분 정도 소요됩니다. 커버슬립이 마르면, 용액이 웰 바깥쪽으로 흘러나오지 않고 유리 부분만 덮이도록 각 유리 커버슬립 위에 코팅 용액 100 µL를 떨어뜨립니다. 코팅된 24웰 클러스터 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣고 최소 1시간 동안 유지합니다.인간 관상동맥 내피세포를 37°C, 5% CO₂ 조건의 배지에서 배양합니다. 배양액을 흡입하여 제거하고, 10 mL의 Hank's balanced salt solution(HBSS)으로 내피세포 단층을 헹군 후 HBSS를 흡입하여 제거합니다. 0.5% trypsin 및 0.2% EDTA 용액 2 mL를 첨가하고 실온에서 약 5분간 배양하면, 플라스크 측면을 가볍게 두드려 내피세포를 떼어낼 수 있습니다. 대두 트립신 억제제(soybean trypsin inhibitor) 5 mL를 플라스크 표면에 분사합니다. 세포를 완전히 분리하기 위해, 세포 현탁액을 15 mL 튜브로 옮기고 200 ×g에서 5분간 원심분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거하고 내피세포 펠렛을 5 mL의 배지로 재현탁합니다.헤모사이토미터(hemo cytometer)로 세포 수를 측정하고, 세포 농도를 배지 1mL당 50,000개의 내피세포가 되도록 조정합니다. 코팅된 유리 커버슬립이 들어 있는 24웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 1mL씩을 분주합니다. 37°C, 5% CO₂ 조건의 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 이제 세포에 원하는 처리를 수행할 준비가 되었습니다.3일 이내에 단층이 합류(confluent)되면, 10% fetal calf serum이 첨가된 RPMI에서 배양한 HL 60 세포를 15 milliliter 튜브로 옮기고 200 times G에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 다음 상층액을 제거하고, HL 60 세포의 형광 표지를 위해 serum이 없는 배지 5 milliliter에 세포를 재현탁합니다. 세포 수를 측정하여 적절한 양의 세포를 15 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다.세포를 200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후, 혈청이 포함되지 않은 PMI 배지 내의 cell tracker에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 1 million cells/mL의 농도로 세포를 세포 배양 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 세포를 200 ×g에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.세포 펠렛을 배지에 현탁하여 밀리리터당 200만 개의 세포 농도로 만듭니다. 내피세포 단층이 포함된 24-웰 클러스터 플레이트의 각 웰에 cell tracker로 라벨링된 HL 60 세포 현탁액 1mL를 첨가하고, 37°C, 5% CO₂ 조건의 세포 배양 인큐베이터에서 1~3시간 사이의 정해진 시간 동안 배양합니다. 배양 기간이 끝난 후, 정밀 5B 핀셋을 사용하여 커버슬립의 가장자리만 잡고 웰에서 유리 커버슬립을 꺼낸 뒤, 커버슬립의 가장자리를 가볍게 닦아냅니다.벤치 위에 티슈 한 장을 깔고 커버슬립을 3초 동안 올려둡니다. 포셉으로 커버슬립을 단단히 잡고, 티슈가 세포가 덮인 커버슬립 표면에 닿지 않도록 주의합니다. 커버슬립을 HBSS에 다섯 번 넣었다 뺍니다.HBSS로 커버의 가장자리를 닦아냅니다. 조직을 3초 동안 담급니다. 담그기와 닦아내기 과정을 총 3회 반복하되, 각 회차당 5번의 담그기 후 1번의 닦아내기를 수행합니다.그런 다음 커버슬립을 Tencent 포뮬러가 들어 있는 웰로 옮겨 실온에서 세포를 고정합니다. 커버슬립은 이제 계수를 위한 준비가 되었으며, 장기 보관하거나 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 항체 또는 노화 관련 베타 갈락토시다아제 활성에 대한 대비 염색을 수행할 수 있습니다. 부착된 혈관 내피세포를 계수하려면, 도립 현미경의 4배 또는 10배 대물렌즈를 사용하여 개별 세포를 식별할 수 있도록 DPI 대비 염색을 거친 커버슬립을 현미경 슬라이드에 마운트합니다. 여러 시야의 이미지를 획득하고, 조사되지 않은 혈관 내피세포 위에 응집된 단핵구의 최대 수를 측정합니다.필요한 경우, 클러스터로 정의하기 위한 내피세포당 단핵구 수의 임계값을 이 수치의 두 배로 설정하십시오. 실험의 성격에 따라 클러스터를 정의하는 다른 기준을 사용할 수 있습니다. 시야 내의 클러스터 수와 내피세포 수를 측정하십시오.해당 수치를 후자로 나누어 부착성 혈관 내피세포의 백분율을 구합니다. 수많은 시야를 측정하여 세포 수의 평균값과 표준 편차를 구합니다. 단핵구와 함께 배양하기 전, 감마선 조사 7일 후의 혈관 내피 단층에서는 단핵구가 개별 혈관 내피세포 주변에 군집을 이루어 결합하였습니다.이 현상은 위상차 현미경으로도 쉽게 관찰할 수 있지만, 형광 현미경을 사용하면 단핵구 클러스터의 이미지를 더욱 선명하게 확인할 수 있습니다. 설명된 ADI 분석을 수행한 후, 적절한 항체를 사용하여 세포의 막, 세포질 또는 핵 단백질을 염색하는 단계로 진행할 수 있습니다. 표준 면역형광법을 사용할 때는 세척 단계에서 주의가 필요하며, 과도한 힘을 가하면 단핵구가 떨어져 나갈 수 있습니다.또한, 노화 관련 베타-갈락토시다아제(senescence associated beta-galactosidase)와 같은 효소 기반 분석을 수행할 수 있습니다. 이는 노화된 세포의 리소좀을 청색으로 염색시키며, 작은 크기와 구형 모양으로 식별되는 수많은 단핵구들이 선택적으로 결합해 있는 혈관 내피세포에서 이를 확인할 수 있습니다. 각 단핵구 클러스터는 개별 혈관 내피세포에 대응하므로, 클러스터의 수를 세면 단층 내에 부착된 혈관 내피세포의 실제 수를 알 수 있으며, 이를 통해 전체 집단 내 부착 혈관 내피세포의 비율을 산출할 수 있습니다.이 방법은 현재까지 필요 시 혈관 내피세포의 부착력을 정량화할 수 있는 유일한 방법입니다. 기존 방법과 마찬가지로, 혈관 내피 단일층에 부착된 단핵구는 trypsin EDTA 용액으로 떼어낼 수 있으며, 플레이트 리더를 사용하여 형광을 측정할 수 있습니다. 숙련되면 이 기술은 4시간 이내에 수행 가능하며, 실제 작업 시간은 매우 짧습니다. 중요한 점은, 이 절차를 따를 때 모든 세척 및 침지 단계가 모든 샘플 간에 동일한 방식으로 동일한 횟수로 반복되어야 한다는 것입니다.부착성 내피세포가 비부착성 내피세포와 비교하여 어떤 특성을 갖는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 면역형광법 및 노화 관련 베타 갈락토시다아제 분석법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 교양 세포에 준수 아르 단위를 형성하는 박테리아 식민지의 숫자를 계산에 구성된 간단한 세균 유착 분석이다. 분석은 강력한이며, adhesin 독립 공부하고, 다수의 유사 콘텐츠는 세균 pathogenesis 작업을 대부분의 실험실에 사용됩니다.

포유류의 상피 세포에 박테리아의 접착 시험 관내 분석

두 분자가 상호 작용하는 세포의 표면에 고정하는 경우 수용체 - 리간드 상호 작용 속도론을 측정하는 접착 주파수 분석이 설명되어 있습니다. 이 기계 기반의 분석은 수용체와 리간드를 상호 작용으로 micropipette - 압력 인간의 붉은 부착 센서와 같은 혈액 세포와 인테 αLβ2과 세포 유착 분자 - 1을 사용하여 exemplified입니다.

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 Junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

이 비디오에서는 형광 현미경을 사용하여 암세포가 호중구 세포외 트랩(NET)에 부착되는 것을 감지하는 분석을 시연합니다. 테스트 웰에서는 NET에 부착된 형광 표지된 암세포의 수가 눈에 띄게 증가한 반면, DNase로 처리된 웰은 NET에 대한 암세포 부착력이 감소한 것으로 나타났습니다.

암세포가 호중구 세포외 트랩에 부착되는 것을 감지하기 위한 In vitro adhesion assay

감염의 사이트에서 활성화 된 내피 세포에 백혈구 준수는 호스트의 염증 반응의 중요한 구성 요소입니다. 수 있습니다 호중구 결합 분석은이 보고서에...

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

간장에 백혈구 모집은 고유 간 사인 내피 세포에 의해 줄 지어있다 간 사인 곡선의 전문 채널 내에서 발생합니다. 생리 전단 응력의 조건에서 인간의 간 사인 내피 세포에서 백혈구 모집의 위상차 현미경은이 과정을 기초가되는 분자 메커니즘의 해명을 용이하게 할 수있다.

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

호중구의 부착을 정량하는 방법이보고되어있다. 이 방법은 혈관에서 발생 된 것과 유사한 동적 흐름 환경을 생성한다. 그것은 허용 정제 부착 분자 (리간드) 또는 투명 스트레스 생체 환경 유사한 맥락에서 내피 세포 기질 (HUVEC) 중 하나에 호중구 부착 조사.

인간 호중구 유량 용기 접착 분석

여기서, 우리는 지속적으로 셀 기판 임피던스와 생균 영상 분석에 의해 비 침습성 방식으로 높은 시간 해상도를 가진 세포 부착 및 디 - 접착 공정을 정량화하는 프로토콜을 제시한다. 이러한 접근은 매트릭스 수정 및 접착 의존성 시그널링 이벤트들이 시간적인 관계에 의해 트리거 세포 접착 / 디 접착 공정의 역학을 보여준다.

매트릭스 수정에 의해 유도 된 세포 접착 및 탈 부착의 실시간 변화를 측정 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징을 사용하여

이 플로우 접착 분석은 T 세포 상피 세포 상호 작용의 간단한 고 충격 모델을 제공한다. 주사기 펌프는 전단 응력을 생성하기 위해 사용하고, 공 초점 현미경 정량 이미지를 캡처한다. 이 연구의 목적은 효과적으로 유동 조건을 이용하여 T 세포 유착을 정량화하는 것이다.

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

혈관 내 피는 단단히 백혈구 신규 모집을 제어합니다. 부적당 한 백혈구 넘쳐 흐름 인간의 염증 성 질병에 기여 한다. 따라서, 내 피 활성화의 새로운 규제 요소에 대 한 검색은 염증 성 질환에 대 한 향상 된 치료를 디자인 해야 합니다. 여기, 우리는 포괄적인 방법론 소설 내 피 레 귤 레이 터 백혈구 중 염증 매매 하는 것을 수정할 수 있는 특성을 설명 합니다.

심사 분석 실험 소설 내 피 레 귤 레이 터 염증 반응에 관여 하

혈관 벽에 면역 세포의 동적 접착 용기 추적에 대 한 전제 조건입니다. 여기, 우리 addressin 코팅 모 세관을 사용 하 여 인간 세포의 동적 세포 접착에 안티 integrin 항 체, 발산 또는 다른 요인의 영향 분석에 대 한 기능 생체 외에서 시험에 대 한 프로토콜을 제시.

선 동적인 장 질병에 방지 접착 치료의 기능 분석에 대 한 동적 접착 시험

여기에서는 만능 줄기 세포를 뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC) 유사 세포로 분화할 수 있는 프로토콜인 확장된 내피 세포 배양 방법(EECM)에 대해 설명합니다. 이들 세포는 내피 세포 부착 분자 발현을 보여주므로 시험관 내에서 면역 세포 상호작용을 연구하기에 적합한 인간 혈액-뇌 장벽 모델입니다.

인간 유도 만능 줄기 세포를 성숙한 면역 표현형을 가진 뇌 미세혈관 내피 세포 유사 세포로 분화

학습하세요 내피 세포 접착 정량 체외 방법을 사용하여 인간 관상동맥 내피 세포의 접착성을 측정하는 기술입니다. 형광 표지 단핵구를 활용한 이 실험법은 혈관 생물학 연구에서 세포 접착의 정확한 정량화를 가능하게 합니다.

내피 세포 접착 정량

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