디지털 핵산 정량 분석​​ 실험의 단순 대량 판독

이 절차의 전체적인 목표는 일반적인 실시간 PCR 장비를 사용하여 분석의 전체 형광을 측정함으로써 디지털 드롭렛 분석의 판독을 간소화하는 것입니다. 이는 먼저 분석 대상 샘플과 두 가지 표준물질의 증폭 반응액을 준비하고, 이를 수천 개의 나노리터 크기 반응기로 분할하여 드롭렛을 형성함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 드롭렛을 배양하여 각 드롭렛 내의 핵산을 증폭시키는 것입니다.

다음으로, 표준 QPC 또는 열순환기(thermocycler)를 사용하여 각 샘플 또는 표준물질의 전체 형광(bulk fluorescence)을 측정합니다. 마지막 단계는 표준 샘플로부터 생성된 표준 곡선을 이용하여 분석 대상 샘플 내 형광 액적의 분율을 예측하는 것입니다. 이 방법의 성능을 검증하기 위해, 형광 현미경을 사용하여 전체 형광 분석의 정량 성능을 독립적으로 평가할 수 있습니다.

드롭렛 카운팅과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 특수 장비가 필요하지 않다는 점입니다. 이 분석법을 시작하기 전, 프로토콜 텍스트에 설명된 모든 필수 시약과 두 가지 표준 시료가 필요합니다. 하나는 뉴클레아제 제거수로 대표되는 템플릿 미포함 대조군이며, 다른 하나는 lambda DNA와 같이 템플릿 농도가 높은 시료입니다. 각 표준 시료 3.3 µL를 변성 버퍼 3.3 µL와 함께 qPCR 튜브에 넣어 변성시키십시오.

상온에서 3분 동안 배양합니다. 각각의 샘플에 3.3 µL의 중화 버퍼를 넣어 반응을 중단시킵니다. 마찬가지로, 관심 대상인 템플릿 3.3 µL에 변성 버퍼 3.3 µL를 가하여 상온에서 3분 동안 배양해 변성시킵니다.

3.3 µL의 중화 버퍼로 반응을 정지시킵니다. 위양성 또는 음성 결과가 적게 나오도록 샘플당 11 µL의 마스터 믹스를 준비합니다. 액적을 형성하기 전에 마스터 믹스를 UV 광선에 노출시킵니다.

먼저, 0.5 mL 또는 1.5 mL 투명 튜브를 사용하여 샘플당 10 µL의 프리믹스 혼합물을 얼음 위에서 준비합니다. 프리믹스 혼합물은 랜덤 올리고(randomized oligo), B-S-A-D-N-A 폴리머라제 반응 버퍼, dn, NTPs 및 뉴클레아스 프리 워터(nuclease free water)로 구성됩니다. 튜브를 얼음 위 물에 두고 UV 광선에 노출시킨 후 UV 조사를 마칩니다.

A-D-S-D-N-A 결합 염료와 기준 식이를 프리믹스 혼합물에 넣습니다. 중합효소가 pH 7.5보다 훨씬 높거나 낮은 수준에 노출되지 않도록 PHI 29 DNA polymerase를 마지막에 추가합니다. 잘 섞은 후, 변성된 템플릿 또는 표준물 10 µL와 마스터 혼합물 10 µL를 취해 잘 혼합합니다.

액적은 정전기와 전단 응력에 매우 민감할 수 있으므로, 실험자는 액적을 형성하기 전에 정전기를 유발할 수 있는 옷을 제거하고 제자리에서 접지를 해야 합니다. 본 시연에 사용된 미세유체 장치는 내부적으로 제작되었으며, 액적 생성을 위한 흐름 집중 접합부(flow focusing junction)와 오일 유입구 하나 및 수성 유입구 두 개로 구성되어 있습니다. 두 개의 시린지 펌프를 사용하여 계면활성제가 포함된 오일 55 µL와 반응 혼합물 20 µL가 미세유체 칩을 통해 흐르는 유량을 조절하십시오.

20,001 nanoliter 크기의 액적을 생성할 때, 가장 어려운 단계 중 하나는 에멀션을 방해하지 않고 액적을 수집하는 것입니다. 천천히 피펫팅하는 것이 중요하며, 가급적 넓은 구경의 팁(wide bore tip)을 사용하십시오.

각 샘플의 모든 액적을 PCR 튜브에 수집합니다. 와이드 보어 팁을 사용하여 매우 천천히 피펫팅하여, 광학 캡이 있는 새 PCR 튜브에 오일 30 µL를 분주합니다. 오일 위에 액적 20 µL를 옮깁니다.

일관된 부피를 유지해야 분석의 정확도를 최대한 높일 수 있습니다. 캡이 헐거우면 오일이 증발할 수 있으므로 튜브 캡을 단단히 닫으십시오. 에멀젼 튜브를 다룰 때는 에멀젼에서 최대한 멀리 떨어진 튜브 상단을 잡으십시오. 등온 증폭을 위해 PCR thermocycler, A-Q-P-C-R thermocycler 또는 핫플레이트를 사용할 수 있습니다.

본 시연에서는 A-Q-P-C-R thermocycler를 사용합니다. 샘플을 30 °C에서 7시간 동안 배양하고 75 °C에서 1분 동안 불활성화합니다. 반응 및 활성화 직후에 진행하십시오.

QPCR thermocycler를 사용하여 모든 시료의 형광 수준을 측정합니다. 각 시료에 대하여, DS DNA 결합 염료의 형광 강도를 참조 염료의 형광 강도로 나눕니다.

모든 샘플에서 배경 형광 또는 템플릿 미포함 대조군의 정규화된 형광값을 뺍니다. 표준물질의 보정 형광 측정값을 사용하여 선형 표준 곡선을 생성합니다. 템플릿 미포함 대조군 표준물질은 형광 액적이 0%인 샘플의 형광값을 나타내며, 고농도 템플릿 표준물질은 높은 템플릿 농도를 나타냅니다.

형광 측정은 해당 표준 곡선을 사용하여 형광성 액적(droplet)이 100%인 시료에서 기대되는 형광값입니다. 벌크 형광(bulk fluorescence)을 기반으로 양성과 음성 액적의 중간 비율을 예측합니다. 이 방법은 기존의 실시간 PCR 장비를 사용하여 액적 기반 디지털 분석의 벌크 형광을 측정합니다.

형광 및 비형광 액적을 서로 다른 비율로 사전 혼합한 후, 벌크 형광과 양성 액적 분율 간의 비교를 수행하였습니다. 예상대로 벌크 형광과 양성 액적 수는 투입된 형광 액적 분율에 따라 선형적으로 비례하였습니다. 표준물을 기반으로 예측된 비율을 예상 형광 투입 분율과 비교하였습니다.

해당 선은 선형 관계를 가정한 기대값을 나타냅니다. 결과는 2로그의 동적 범위에 걸쳐 액적 비율 정량화에서 우수한 성능을 보여줍니다. 실제 정량적 전장 유전체 증폭 분석에서 이 방법을 테스트하기 위해, 디지털 액적의 형광 수준과 양성 액적의 분율을 분석하였습니다.

템플릿 Lambda DNA의 농도를 증가시키며 MDA 분석을 측정하였습니다. 직선은 실험 데이터를 모델링하기 위해 푸아송 분포를 사용하여 예측한 형광 분율을 나타냅니다. 드롭렛의 대표적인 형광 이미지가 제시되었으며, 디지털 MDA 샘플의 벌크 형광 및 양성 드롭렛 분율 모두 드롭렛당 평균 템플릿 수에 따라 예상대로 스케일링되어, 벌크 판독 값이 디지털 분석 결과를 충실하게 반영할 수 있음을 보여줍니다.

이 방법은 분석 결과의 판독을 가속화하고 병렬화 및 단순화함으로써 디지털 PCR과 같은 다른 디지털 분석법에 도움이 될 수 있습니다.