Name: 항 종양 특성을 가진 분리 및 호중구의 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 학습하세요 항종양 특성을 가진 호중구 분리 및 기능 평가 방법을 배우세요. 밀도 구배법과 루시퍼라즈 표지 종양 세포 공배양을 통해 세포독성을 정량화하고 방사성 표지 없이 신뢰할 수 있는 결과를 얻는 기술입니다.

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ZG는 이스라엘 과학 재단 (부여 번호 11분의 41)의 I-CORE 프로그램에서 보조금 지원, Abisch-Frenkel 재단, Rosetrees 신뢰, 이스라엘 암 연구 재단 (ICRF - 연구 경력 개발 상) 및 관심사 재단. ZGF가 이스라엘 암 연구 재단 (ICRF - 연구 경력 개발 상)에서 보조금 지원, 건강의 이스라엘 정부와 이스라엘 폐 협회의 수석 과학자.

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호중구는 모든 백혈구 가장 풍부하며, 감염 및 염증의 경우 최초 대응한다. 이와 같이, 이들은 외부 큐에 매우 민감하고 쉽게 활성화된다. 또한, 호중구는 매우 짧은 반감기 및 빠른 회전율을 갖는다. 함께, 이러한 특성은 독특한 실험적인 전략이 필요되도록 호중구, 작업에 여러 가지 어려움을 올립니다. 예를 들어, 여러 호중구 정화 전략은 자신의 장점과 단점 각이있다. 호중구 작업에서 중요한 단계는 전체 혈액에서 자신의 정화입니다. 호중구 효율적 밀도 구배 또는 항체 기반 전략 (양 또는 음의 선택)을 사용하여 정제 할 수있다. 그것은 최소 비특이적 활성화와 고순도 호중구 높은 수치를 산출 이후 우리가 선택한 방법은 밀도 구배를 사용하는 것이다. 그러나, 우리는 최근의 연구 (21)에 표시로, 재치H 종양 진행 호중구 단핵 저밀도 분획 높은 번호에 축적된다. 밀도 구배의 사용은 고순도, 고밀도 호중구 분획을 제공하는 이러한 조건에서 그 전체를 순환하는 호중구 ...

호중구는 처음에 침입하는 미생물에 대한 첫 번째 줄에 방어 역할을 타고난 면역 세포 특징했다. 오늘은, 호중구가 더 많은 기능을 광범위한 것으로 알려져있다가, 외국 항원 1, 2에 적응 면역 반응을 장착 조혈 3, 4 혈관 신생을 조절하는 5 상처 치유에 관여된다. 또한, 호중구는 프로 및 항 종양 활동 -6,7-의 덕에 의해 종양의 성장 및 전이성 진행에 영향을 미칠 수있다. 호중구는 다형성 분할 핵을 특징으로한다 (따라서 다형 (PMN) 백혈구라고합니다) 적어도 세 과립의 별개의 서브 클래스뿐만 아니라 분비 소포 8 (그림 1A-C)를 포함한다. 호중구는 식균 높은 용량 및 미생물 제거를위한 임계 높은 NADPH 옥시 다제 활성을 갖는 한에 중요한 케모카인의 다양한 분비추가 호중구 염증 8,9의 사이트에 다른 면역 세포의 견인. 호중구는 수신자와 같은 수용체 (TLR들)을 포함한 표면 수용체의 대량 발현을 특징으로, C 형 렉틴 수용기 ​​(CLRS)는, 수용체 3 (하여 CD11b / CD18)과 다른 부착 분자 (예를 들어, L 셀렉틴을 보완 LFA-1, VLA-4 및 carcinoembryonic 항원 관련 세포 부착 분자 (3) (CEACAM3 / CD66b)), 케모카인 수용체 (예, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), 화학 유인 물질 수용체 (예, PAFR, LTB 4 R 및 C5aR) 사이토 카인 수용체 (예, G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR)은 수용체 (예 FPR1-3) 펩타이드를 포르 밀, 및의 Fc 수용체 (예를 들어, CD16 (FcγRIII 인간의 호중구는 CD11b를, CD15, CD16와 CD66b 백혈구 마커를 사용하여 식별되는 반면), CD32 (FcγRII) 및 CD64 (FcγRI) 10. 마우스에서 호중구는 일반적으로는 CD11b + Ly6G +로 식별됩니다. 또한 일반적으로 조직에서 호중구의 검출을위한 과립 단백질 된 myeloperoxidase (MPO) 및 호중구 엘라 스타 제 (NE)에 대한 얼룩 허용됩니다. 그것은 호중구의 다양한 기능이 동일하거나 별개의 셀에 의해 세포의 서브 모집단에 의해 매개되는지 아직 불분명하다. 축적 된 데이터는 염증성 자극과 미세 환경의 영향 11,12 가소성의 높은 정도를 나타내는 이종의 인구 호중구의 존재를 시사한다. Fridlender 등. (13)는 크게 프로 종양 특성을 가진 항 종양 특성 및 N2로 N1 불리는 두 개의 주요 하위 집단으로 암의 호중구를 분할했다. 암뿐만 아니라 만성 염증, T 세포 반응을 억제 과립 14 골수 유래 세포 억제제 (G-MDSCs)로 구성된 부가적인 서브 집단이있다. G-MDSCs이는 CD11b + Ly6C 특징으로 미성숙 골수 세포로 간주됩니다쥐 15 낮은 Ly6G 안녕하세요 표현형, 인간의 16 CD15 + / CD16 낮은 표현형을하면서. G-MDSCs 정상 순환 호중구보다 사이토 카인과 케모카인의 동안 낮은 수준을 아르 기나과 마이 엘 로퍼 옥시 다제의 높은 수준을 표현한다. 그들은 이하 식세포 및 이동성을하지만 ROS 15,17,18 높은 수준의 생산. 본 논문에서는 항 종양 특성을 가진 호중구의 분리 및 특성에 대한 몇 가지 기본적인 방법을 설명합니다. 호중구는 인간의 순환에서 모든 백혈구의 가장 큰 인구를 구성하는 동안 (45~70%; 1,800 - 6,000 / μL) -; 300-500 / μL 15 %, 생쥐에서 정상 조건 하에서, 그들은 10 (오히려 드문 드문 ). 염증에 따라 때때로 만성 염증 (7)의 상태를 나타내는 암에 지속적으로 호중구 수가 증가한다. 호중구는 다 능성 일반적인 골수 전구체 (CMP) CE에서 개발골수성의 단계 (메가 바이트), promyelocytes (오후), myelocytes (MC), metamyelocytes (MM) 및 밴드 세포 (BC)를 통과하는 분화 과정을 통해 골수의 재편, 8. 그들은 순환 (8)에 공개되기 전에 7 일 - 성숙, 후 유사 분열 호중구는 4 골수 내에 남아있을 수 있습니다. 염증 상태에 따라 연장 될 수있다 12 시간 - 혈중 호중구 매​​출 6의 평균 반감기 일반적으로 빠르다. 비자극 호중구는 포르 볼 에스테르 포르 볼 (12)에 노출시킴으로써 항 - 종양 활성, 케모카인 IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 및 CXCL5 6,19 또는 인위적으로 나이브 호중구를 노출시킴으로써 얻어 질 수있는 기능을 제한적 -myristate 13 아세테이트 (PMA) 6. 호중구의 낮은 번호와 함께 혈액 호중구의 짧은 반감기 (~ 3-5 10 5 ×) 순진한 (6) 1 ml의 혈액에서 달성 - 8 주 이전 마우스, 그것을 만든어려운 시험 관내에서 마우스 호중구 순환의 기능을 탐구한다. 이러한 어려움을 극복하기 위해, 다른 소스가 이용되고있다. 예를 들면, 호중구의 다수는 (티오 글리콜 레이트 브로 쓰 또는 자이 모산의 복강 내 주사 한 후, 예) 골수 20 무균 염증 유도 다음 복막로부터 획득 될 수있다. 이는 복강 호중구로부터 얻어지는 모든 항 종양 활성 (미공개 관찰)을 발휘하는 것은 아니다. . 40,000,000 혈액 호중구 용이 1 mL의 혈액으로부터 분리 할 수있다 - Granot 외 6은 BALB / c 마우스 (20)가되도록 종양 진행 (6) (도 2A)으로 악화 호중구를 개발 마우스 4T1 유방 암종 세포주 동소 접종 관찰 3-4주 후 종양 접종. 이러한 호중구 항암 활동을 획득하고 이에 따라 COI왔다순서 네드 종양 동반 된 호중구 (TEN)는 순진한 호중구 (6) (그림 2B)와 구별한다. 고밀도 호중구 (HDN,도 1a)가 높은 항 종양이지만, 암의 문맥에서 생성 저밀도 호중구 (LDN,도 1b) (21)는 그렇지 않다. 또한, 종양 - 함유 마우스의 골수 및 비장으로부터 고밀도 호중구는 항 종양 활성 (미공개 데이터)를 갖는다. 그것은 호중구의 양의 증가와 함께, 종양 진행과 비장 서서히 확대 (비장)을가되도록 유의해야한다. 그것은 10도 자연 (MMTV-PyMT 및 MMTV-Wnt1 유방 종양과 K-RAS 중심의 폐 종양) 모두를 포함하는 암의 다른 모델에서 생성 및 AT-3 (MMTV-PyMT)과 E0771의 유방암 (주입 주목해야한다 세포, LLC 루이스 폐 암종 세포 및 B16-F10 흑색 종 세포). 이 다치거나에서 호중구 동원하지만, 범위삼주 후 1 ml의 혈액에서 10 × 10 6 호중구 - 또는 모델 5에 도달, 4T1-접종 생쥐보다 훨씬 적습니다.

<table><tbody><tr><td>세포주</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 4T1 유방암 세포</td><td>ADCC</td><td>CRL-2539</td><td>성장 매체: DMEM + 10 % 열-비활성화 FBS</td></tr><tr><td>PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well Tissue Culture Plate&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td>멸균</td></tr><tr><td>100mm 조직 배양 플레이트&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>멸균</td></tr><tr><td>25 cm2 조직 배양 플라스크</td><td>Nunc</td><td>156340</td><td>멸균</td></tr><tr><td>90 mm 세균 등급 배양 접시&nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, 이스라엘</td><td>20090-01-017</td><td>멸균</td></tr><tr><td>15 ml 멸균 원추형 원추형 원심분리기 튜브&nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, 이스라엘</td><td>835015-40-111</td><td>멸</td></tr><tr><td>균 50ml 멸균 원추형 원심분리기 튜브&nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, 이스라엘</td><td>835050-21-111</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Falcon 12 x 75 mm 라운드-바텀 폴리스티렌 튜브&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td>멸균</td></tr><tr><td>Millicell 24 마이그레이션 플레이트는 5&mu의 기공 크기를 가지고 있습니다; 엠&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>PSMT010R1</td><td>멸균</td></tr><tr><td>화이트 96-플랫-바텀 웰 플레이트&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3917</td><td>멸균</td></tr><tr><td>세포 여과기 (40 mm)&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>멸균</td></tr><tr><td>20G x 1.5" 바늘</td><td>BD Microlance 3&nbsp;</td><td>301300</td><td>멸균</td></tr><tr><td>23G x 1" 바늘&nbsp;</td><td>BD Microlance 4</td><td>300800</td><td>멸균</td></tr><tr><td>25G x 5/8" 바늘&nbsp;</td><td>BD Microlance 5</td><td>300600</td><td>멸균</td></tr><tr><td>0.3 ml 주사기와 30G x 8mm 바늘</td><td>BD Micro-Fine Plus Demi</td><td>320829</td><td>멸균</td></tr><tr><td>9 mm 클립&nbsp;</td><td>BD, 오토클립&nbsp;</td><td>427631</td><td>멸균</td></tr><tr><td>EasySep 자석&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS 분리 컬럼&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td>멸균</td></tr><tr><td>MidiMACS 분리기 자석</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>현미경 유리 슬라이드&nbsp;</td><td>멘젤-Gl &auml; ser 슈퍼프로스트&nbsp; 플러스 써모</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>오비탈 쉐이커&nbsp;</td><td>스카이 라인, ELMI</td><td>S-3.02.10L</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더&nbsp;</td><td>TECAN</td><td>InfiniteF200Pro</td><td></td></tr><tr><td>POWDER</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA), 분획 V</td><td>시그마</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>브로모데옥시우리딘(BrdU)&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td><td>멸균</td></tr><tr><td>CFSE (5-(및 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester)</td><td>분자 프로브</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Dextran T500</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td></td></tr><tr><td>돼지 장 점막에서 추출한 헤파린 나트륨 염&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>고독성, 조심해서 다루세요</td></tr><tr><td>Thioglycollate 분말&nbsp;</td><td>Difco</td><td>225650</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan A</td><td>Sigma</td><td>Z4250</td><td></td></tr><tr><td>미디어 및 보충제</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 수정된 이글 매체 (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Opti-MEM&reg; 나는 세럼을 중간 줄였습니다&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>31985062</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Foetal bovine serum (FBS), 열 비활성화</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-020-1A</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-042-1B</td><td>멸균</td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신 x 1000 용액</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, 이스라엘</td><td>03-031-5</td><td></td></tr><tr><td>Mg2+ 및 Ca2+&nbsp가 없는 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, 이스라엘</td><td>02-023-1</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ 및 Mg2+ 없이 멸균 PBS x 10</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, 이스라엘</td><td>02-023-5A</td><td>멸균</td></tr><tr><td>HPLC 등급 물&nbsp;</td><td>J.T. Baker</td><td>4218-03</td><td>오토클레이브</td></tr><tr><td>솔루션</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACK &ndash; 암모늄-염화물-칼륨</td><td>생명 기술&nbsp;</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>PBS에 Bromodeoxyuridine(BrdU) 용액(10mg/ml)</td><td>1ml PBS 및 멸균 필터에 BrdU 10mg을 용해합니다.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFSE, DMSO</td><td></td><td></td>의 5mM <td>1ml DMSO에 CFSE 2.8mg을 용해합니다. 멸균 200ml 튜브에 10ml 분취량으로 나누어 -20oC의 어두운 곳에 보관합니다.</td></tr><tr><td>Eosin Y 솔루션</td><td>Sigma</td><td>HT110-2-32</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' balanced salt solution</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>02-016-1A</td><td>멸균</td></tr><tr><td>헤파린, PBS</td><td></td><td></td>에 20mg/ml <td>100mg 헤파린을 5ml 멸균 PBS에 용해하고, 0.2mm 필터를 통해 멸균 필터를 사용합니다.</td></tr><tr><td>히스토파크-1119&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>0.2mm 필터를 통한 제균 필터.</td></tr><tr><td>히스토파크-1077&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>0.2mm 필터를 통한 멸균 필터.</td></tr><tr><td>Luciferase 세포 배양 용해 완충액 x5</td><td>Promega</td><td>E153A</td>는 <td>사용 직전에 멸균수에 1:5로 희석합니다.</td></tr><tr><td>Luciferase 분석 솔루션</td><td>Promega</td><td>E1501</td>은 <td>luciferase 분석 기질 분말(E151A)과 luciferase 분석 버퍼(E152A)를 포함합니다.</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>MHS-32</td><td></td></tr><tr><td>PBS + 0.5% BSA</td><td></td><td></td><td>2.5g BSA를 500ml PBS에 용해시키고 0.2mm 필터를 통해 멸균 필터를 사용합니다.</td></tr><tr><td>PBS + 1% BSA</td><td></td><td></td><td>100ml PBS에 BSA 1g을 용해하고 0.2mm 필터를 통해 멸균 필터를 만듭니다.</td></tr><tr><td>2.5% BSA</td><td></td><td></td>가 함유된 5x PBS <td>250ml 멸균 HPLC 등급 물과 250ml PBSx10의 혼합물에 12.5g BSA를 용해시키고 0.2mm 필터를 통해 멸균 필터를 통과합니다.</td></tr><tr><td>0.5% BSA 및 2mM EDTA</td><td></td><td></td>를 함유한 PBS <td>50ml 멸균 PBS에 250mg BSA를 용해시키고 0.2mm 필터를 통해 200mL의 0.5M EDTA pH 8.0 멸균 필터를 추가합니다.</td></tr><tr><td>FACS 완충액(0.5% BSA, 2mM EDTA 및 0.02% NaN3을 함유한 PBS)</td><td></td><td></td><td>는 50ml 멸균 PBS에 250mg BSA를 용해하고 0.5M EDTA pH 8.0 200ml 및 2% NaN3 500ml, 멸균 필터를 0.2mm 필터를 통해 추가합니다.</td></tr><tr><td>식염수 (0.9 % NaCl)</td><td></td><td></td> <td>9g NaCl을 1,000 ml ddw에 용해, 오토 클레이브</td></tr><tr><td>0.2 % NaCl 용액</td><td></td><td></td><td>2 g NaCl을 1,000 ml ddw에 용해, 오토 클레이브</td></tr><tr><td>1.6 % NaCl 용액</td><td></td><td></td><td>1,000 ml ddw에 16 g NaCl 용해, 오토 클레이브</td></tr><tr><td>2 % 아지드</td><td></td><td></td> 나트륨 <td>50 ml 멸균 ddw에 1g 아 지드 화 나트륨을 용해하고 4oC에 보관하십시오. 독성이 강합니다.</td></tr><tr><td>3% 티오글리콜레이트 용액</td><td></td><td></td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 티오글리콜레이트 분말 3g을 100ml ddw에 녹입니다. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 용액이 노랗게 변할 때까지 끓이고 오토클레이브합니다.</td></tr><tr><td>트리판 블루 용액(0.4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td>를 <td>PBS에서 1:10으로 희석하여 0.04% 용액을 얻습니다.</td></tr><tr><td>트립신 용액 B&nbsp;</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-046-1</td><td>멸균</td></tr><tr><td>1 mg/ml Zymosan A</td><td></td><td></td><td>Eppendorf 튜브의 1 ml 멸균 PBS에 1 mg Zymosan A를 재현탁합니다. Vortex를 격렬하게 배양하고 30분 동안 37 oC에서 튜브를 배양합니다. 오토클레이브하지 마십시오. 사용하기 전에 용액을 새로 준비하십시오.</td></tr><tr><td>KITS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep PE 선택 키트</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18557</td><td></td></tr><tr><td>EasySep PE 선택 칵테일&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18151</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 자기 나노 입자&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18150</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G 마우스 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-332</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 마우스 호중구 강화 키트</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19762</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 인간 호중구 강화 키트</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19257</td><td></td></tr><tr><td>FITC BrdU 플로우 키트</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td></td><td></td>559619</tr><tr><td>MACS 호중구 분리 키트</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-658</td><td></td></tr><tr><td>식세포작용 분석 키트&nbsp;</td><td>케이맨 화학 회사&nbsp;</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>항체 FcR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>차단 항체&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>정제된 쥐 anti-Ly6G 항체&nbsp;</td><td>BD 파밍겐&nbsp;</td><td>551459</td><td>클론 1A8</td></tr><tr><td>PE 결합 쥐 ly6G 항체&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>127608</td><td>Clone 1A8</td></tr><tr><td>FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>551460</td><td>클론 1A8</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 쥐 안티-마우스 Ly6G&nbsp;</td><td>TONBO Biosciences</td><td>65-1276</td><td>클론 1A8</td></tr><tr><td>violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G&nbsp;</td><td>TONBO Biosciences</td><td>75-1276</td><td>클론 1A8</td></tr><tr><td>FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553310</td><td>클론 M1/70</td></tr><tr><td>FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G 및 Ly-6C (GR-1)</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553127</td><td>클론 RB6-8C5</td></tr><tr><td>PE 결합 쥐 안티 마우스 CD45</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553081</td><td>클론 30-F11</td></tr><tr><td>FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab60343</td><td>클론 BM8</td></tr><tr><td>FITC-conjugated mouse anti-human CD66b&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>305103</td><td>Clone G10F5</td></tr><tr><td>정제된 쥐 동형 제어 항체 (IgG2a, k)&nbsp;</td><td>BD 파밍겐&nbsp;</td><td>553927</td><td>클론 R35-95</td></tr><tr><td>LEAF 정제 아르메니아 햄스터 안티 마우스 CD3e 항체</td><td>BioLegend</td><td>100314</td><td>클론 145-2C11</td></tr></tbody></table>

항 종양 특성을 가진 분리 및 호중구의 특성

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

호중구 순환 모든 인간 백혈구의 가장 풍부한는 침입 미생물에 대한 숙주 방어에 중요한 역할을한다. 또한, 호중구는 종양 세포의 면역 감시에서 중심적 역할을한다. 이들은 어느 과산화수소 또는 항체 - 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC)을 통해 관련된 세포 의존성 접촉 메커니즘을 통해 종양 세포의 사멸을 종양 세포를 인식하고 유도 할 수있는 능력을 가지고있다. 항암 활성을 갖는 호중구 암 환자의 종양 - 함유 마우스의 말초 혈액으로부터 분리 할 수​​있다. 이러한 호중구는 현저한 종양 세포 상해 활성을 보여 정상인 또는 나이브 마우스의 호중구 구별하는 종양 혼입 호중구 (TEN)를 지칭한다. 다른 백혈구에 비해 호중구 밀도 구배 실시 때 실현&gt; 98 % 순수 호중구 집단을 얻을 수있다 다른 부력을 나타낸다. 그러나, 또한통상 고밀도 호중구 인구 (HDN)에, 암 환자에서 종양 - 함유 마우스에서뿐만 아니라 만성 염증성 조건 하에서 구별 저밀도 호중구 인구 (LDN)는 순환 나타난다. LDN는 단핵구 분획 공동 정제 및 양성 또는 음성 선별 전략을 사용하여 단핵 세포로부터 분리 될 수있다. 절연 호중구 순도 유동 세포 계측법에 의해 결정되면, 이들은 시험 관내 및 생체 기능 분석에 사용될 수있다. 우리는 호중구의 항 종양 활성을 모니터링하는 능력 마이그레이션 및 반응성 산소 종을 생성 할뿐만 아니라 생체 탐식 능력을 모니터링하는 방법을 설명한다. 우리는 또한 생체 내 추적 호중구 레이블을 기술을 설명하고 생체 내에서 자신의 안티 전이성 용량을 확인할 수 있습니다. 이러한 모든 기술은 획득 및 항 종양 호중구를 특성화하는 방법을 이해하는데 필수적기능.

최근의 연구에서 우리는 호중구 6 항 전이 기능을 확인 하였다. 종양 베어링 마우스에서 호중구는 세포 독성 표현형을 획득하고 종양 세포 (6)를 죽일 수있는 능력을 가지고있다. 이는 현저한 항 종양 효과가없는 6 나이브 마우스의 호중구는 대조적이다. 프로토콜 절에 설명 된 여러 기술은 시험 관내 및 생체 내 6 항 종양 호중구 기능 연구를 위해 사용되어왔다. 종양 세포 독성은 호중구 종양 - 함유 마우스 (6)로부터 획득 될 수있다. 이 목적을 달성하기 위하여, 생쥐는 동소 좌측 서혜부 유방 지방 패드로 4T1 세포 (1 프로토콜)로 주입 하였다. 2 CM 3 (도 3 - - 종양 좌하 복부 분명) 21 일 후 종양 접종하여 1 차 종양의 크기에 도달 하였다. 이때, 마우스를 안락사시키고, 1 mL의 혈액 (마우스...

호중구는 침입하는 미생물에 대한 숙주 방어뿐만 아니라 종양 세포의 면역 감시에도 중요한 역할을 합니다. 여기에서는 항종양 특성을 가진 호중구의 분리와 관련된 기술과 in vitro 및 in vivo에서 항종양 호중구 기능을 모니터링하는 방법에 대해 설명합니다.

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 암에서의 호중구 기능을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 말초혈을 채취합니다. 두 번째 단계에서는 밀도 구배 원심분리를 통해 호중구를 정제한 후, 하룻밤 동안 공동 배양을 진행합니다.루시페라아제로 표지된 종양 세포를 이용하여 세포의 루시페라아아제 활성을 정량화합니다. 최종적으로, 각 공동 배양 시스템 내 루시페라아제의 양은 해당 공동 배양 내 중성구의 세포 독성과 역상관 관계를 가질 수 있습니다. 항체 기반의 중성구 분리나 다른 세포 생존율 평가 방법과 같은 기존 방식과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 중성구의 비특이적 활성화를 최소화하고 방사성 표지자를 사용하지 않고도 세포 생존율을 측정할 수 있다는 점입니다.본 절차의 시연은 저희 실험실의 대학원생과 박사후 연구원인 Simoni 박사가 진행하겠습니다. 종양 모델 마우스에서 호중구를 분리하려면, 우선 심장 천자로 채취한 혈액 1 mL를 0.5% BSA가 포함된 PBS로 희석하여 최종 부피를 6 mL로 맞춥니다. 다음으로, 15 mL 원추형 폴리프로필렌 원심분리관 바닥에 멸균 여과된 1.119 g/mL 설탕물을 3 mL 첨가합니다. 그런 다음 튜브를 천천히 조심스럽게 기울입니다.멸균 여과된 1.077 g/mL sucrose 3 mL를 1.119 g/mL sucrose 층 위에 쌓고, 그 위에 희석된 혈액 6 mL를 추가합니다. 상온에서 700 Gs로 30분간 원심분리하여 sucrose 밀도 구배 상에서 세포를 분리합니다. 분리 종료 후 제동이 걸리면 대부분의 적혈구가 튜브 바닥에 위치하게 됩니다.고밀도 호중구는 sucrose 층 사이의 계면인 흰색과 빨간색 링의 약 3 mL 지점에 위치하게 됩니다. 저밀도 백혈구는 1.077 g/mL 층과 BSA 함유 PBS 사이 계면의 흰색 링인 약 6 mL 지점에 위치하므로, 저밀도 세포층의 5 mm 위까지 PBS-BSA 층을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 1 mL 피펫 팁을 사용하여 세포를 천천히 회전시키면서 천천히 흡입하여 저밀도 세포를 제거합니다.세포를 0.5%BSA가 포함된 30 milliliters의 PBS에 분주합니다. 그 다음 고밀도 호중구(neutrophils)를 30 milliliters의 PBS 및 BSA가 포함된 별도의 튜브로 옮깁니다. 동일한 방식으로 두 세포군을 모두 원심 분리한 후, 펠렛을 36 milliliters의 멸균 HPLC 등급수에 재현탁합니다.30초 후, 2.5%BSA가 첨가된 5 XPBS 9mL를 넣어 세포의 등장성을 회복시키고 세포를 원심분리합니다. 다시 세포를 P-B-S-B-S-A 10mL에 재현탁하고, trypan blue 배제법을 통해 생존 세포 수를 측정합니다. 그 후 다시 한번 원심분리하여 호중구를 적절한 최종 세포 밀도의 배양 배지에 재현탁합니다.암 환자의 혈중 호중구를 분리하는 방법입니다. 먼저 헤파린 처리를 한 사람의 혈액 10 milliliters와 동일한 부피의 생리식염수에 희석한 3% DExT strand T 500을 혼합하고, 적혈구를 침전시키기 위해 상온에서 30분 동안 배양합니다. 적혈구가 가라앉으면 백구가 풍부한 상층액을 1.077 grams per milliliter 자당 층 위에 천천히 층층이 쌓고, 원심분리를 통해 세포를 분리합니다. 시연된 바와 같이, 사람의 고밀도 호중구는 펠릿(palate)에 존재하며, 저밀도 호중구는 1.077 grams per milliliter 자당 층과 혈장 사이의 경계면에서 단핵구 및 림프구와 함께 공동 정제됩니다.앞서 시연한 것과 같이 호중구를 수집한 후, 세포를 10 mL의 0.2% sodium chloride에 넣고 30초 동안 희석하여 혼입된 적혈구를 용혈시킵니다. 그다지 10 mL의 1.6% sodium chloride를 첨가하여 세포의 등장성을 회복시키고, 튜브를 한 번 뒤집어 혼합합니다. 세포를 원심 분리하여 가라앉힌 후, 펠릿을 20 mL의 HBSS로 3회 세척합니다.그 다음 세포 수를 측정하고, 2% FBS가 첨가된 RPMI 1640에 적절한 세포 밀도로 재부유시킵니다. glyco 또는 Xan으로 유도된 중성구(neutrophils)를 분리하기 위해, 23게이지 1인치 바늘이 장착된 투베르쿨린 주사기를 사용하여 복강 내에 주입하십시오.마우스의 복강에 적절한 용액 1 mL를 주입합니다. 4~24시간 후, 안락사시킨 동물의 복막에 25 gauge 5/8 inch 바늘이 장착된 5 mL 주사기를 사용하여 멸균 PBS 5 mL를 주입합니다. 복막을 부드럽게 마사지한 후, 액체를 다시 주사기로 흡입하여 복강 삼출물 세포를 수집합니다.10% FBS가 보충된 RPMI 1640 배지로 세포를 세척합니다. 그다음 대식세포를 제거하기 위해, FBS가 보충된 배지가 담긴 조직 배양 등급 배양 접시에서 10⁶ cells/mL 농도로 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 분리된 호중구를 염색하려면, 세포 1×10⁵개를 50 µL씩 PBS 분주액에 다시 부유시키고, 박층 세포 준비 어댑터를 사용하여 150 ×g에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 5분 후, 어댑터에서 사전 라벨링된 유리 슬라이드를 분리하여 세포를 고정하고 염색합니다.다음으로, 슬라이드를 수돗물로 15회 세척합니다. 슬라이드를 다시 공기 중에서 건조시킨 후, 광학 현미경으로 세포를 관찰하여 호중구의 항종양 활성을 평가합니다. 0.5% FBS가 첨가된 최적화된 저혈청 배지에 루시페레이스 표지 종양 세포를 10⁴ cells/mL 농도로 5배 희석합니다.그 다음, 0.5% FBS가 포함된 최적화된 저청혈청 배지 100 µL에 종양 세포 5 × 10³개를 희석하여 흰색 96-웰 평저 조직 배양 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 4시간 후, 0.5% FBS가 포함된 최적화된 저청혈청 배지 50 µL에 neutrophil 1 × 10⁵개를 희석하여 각 웰에 추가하고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고 각 웰을 200 µL의 PBS로 세척합니다.그 후 PBS를 흡입하여 제거하고 각 웰에 50 µL의 passive lysis buffer를 첨가합니다. 다음으로 플레이트를 호일로 덮어 150 RPM의 오비탈 쉐이커에서 실온으로 배양합니다. 20분 후, 플레이트를 발광 플레이트 리더기에 로드합니다.각 웰에 루시페라아제 분석 용액 50 µL를 주입하고, 웰당 10초 동안 화학 발광을 측정합니다. 마지막으로, 공식에 따라 종양 용해 백분율을 계산하여 이 대표 실험(10⁵)에서 호중구 세포독성의 정도를 테스트합니다. 호중구는 앞서 설명한 바와 같이 루시페라아제를 발현하는 4T1 표적 세포 및 종양이 없는 마우스에서 정제한 호중구와 함께 공동 배양되었습니다.종양 세포의 사멸은 거의 관찰되지 않았습니다. 그러나 저밀도 및 고밀도 중성구의 면역 억제 특성을 테스트하기 위해 종양 유발 마우스에서 정제한 중성구를 사용한 결과, 상당한 수준의 세포 독성이 나타났습니다. anti CD three 또는 anti CD three와 저밀도 또는 고밀도 중성구를 함께 처리하여 자극을 준 후, anti CD three 활성화 이후의 CD eight 양성 비장 T 세포 수를 평가하였습니다.CD8 양성 세포의 극적인 증가가 관찰되었습니다. 그러나 저밀도 호중구와의 공배양은 CD8 양성 세포의 눈에 띄는 감소를 유도했으며, 이러한 효과는 고밀도 호중구가 존재하는 경우에는 관찰되지 않았습니다. 증식의 지표로서 CFSE 유지 정도 또한 평가되었습니다.anti-CD3 처리된 세포와 고밀도 호중구 존재 하에 배양된 anti-CD3 처리된 세포 모두에서 왼쪽으로 단어 이동(word shift)이 나타나며, 이는 두 경우 모두에서 CD8 양성 세포의 증식이 증가했음을 보여줍니다. 이 절차 이후에 산화적 burst, 식세포 작용 또는 이동 측정과 같은 다른 방법들을 수행하여, 다양한 병리적 시나리오에서 호중구 기능이 어떻게 영향을 받는지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

isolation-characterization-neutrophils-with-anti-tumor

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 보고서에서는 종양에 침투 leukocytes의 고도 정화 인구를 분리를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 복잡한 종양 조직에서 세포를 분리에 대한 수율과 순도를 향상시키기 위해 Miltenyi 생명 공학 프로토콜에서 적응하고 있습니다.

일차 종양에서 면역 세포의 분리

이 비디오에서는 종양이 있는 마우스의 혈액에서 불연속 자당 구배 원심분리를 통해 세포독성 고밀도 호중구와 저밀도 호중구를 분리하는 방법을 보여줍니다.

Isolation of Cytotoxic Neutrophils from Tumor-Bearing Mouse Blood(종양을 지닌 쥐 혈액에서 세포독성 호중구의 분리)

이 비디오는 항혈관신생 종양 관련 호중구(TAN)를 생성하는 분석을 보여줍니다. pro-angiogenic TAN을 포함하는 쥐 흑색종 종양을 채취하면 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 단일 세포를 분리하고 NIPOMAMIDE phosphoribosyl transferase(NAMPT) 억제제로 처리하여 혈관 신생을 자극하는 능력을 줄입니다.

항혈인성 종양 관련 호중구 생성

호중구는 백혈구 중 가장 풍부한 유형입니다. 밀도 구배 분리 방법에 의한 인간 혈액에서 호중구의 분리 및 과립구 경로를 따른 인간 전골수구(HL60) 세포의 분화가 여기에 설명되어 있습니다. 항림프종제에 대한 림프종 세포의 민감도에 대한 역할을 테스트합니다.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

새로운 프로토콜 분리 하 고 인간에서 파생 된 미의 특성 설명 및 마우스 호 중구. 이러한 프로토콜 활용 ultracentrifugation, cytometry, 기술과 immunoblotting microparticle 콘텐츠를 분석 하 고 세포질 기능에 다양 한 셀 형식에서 파생 된 미의 역할을 연구 하기 사용할 수 있습니다.

절연 및 특성화 Neutrophil 파생 된 미의 기능 연구

여기 우리가 설립된 피하 종양에서 종양 면역 및 비 면역 microenvironment의 구성 요소를 풍부 하 게 분리 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 종양 면역 침투 및 비 면역 종양 분수는 종양 면역 microenvironment의 포괄적인 특성화를 허용할 수 있는 별도 분석에 대 한 수 있습니다.

농축 및 설립된 피하 Murine 종양에서 종양 면역 및 비 면역 Microenvironments의 특성

여기, 우리는 인간의 저밀도 호 중구 (LDN), 수술 후 복 막 게 액체에서 회복 대규모 호 중구 extracellular 함정 (그물)를 생산 하 고 이후에 성장 하는 무료 종양 세포를 효율적으로 트랩 방법을 제시.

호 중구 Extracellular 함정 밀도가 낮은 호 중구에 의해 생성 된 종양 세포 성장 및 첨부 파일 중재 하십시오 복 막 게 액체에서 얻은

여기에서, 우리는 종양 을 지탱하는 마우스로의 그들의 전송 후에 항 혈관신생 종양 관련 호중구의 치료 잠재력을 보여줍니다. 이 프로토콜은 생체외 호중구 활성을 조작하고 이후에 종양 을 개발하는 생체 내에서 그들의 기능을 평가하는 데 사용될 수 있다. 그것은 잠재적인 호중구 기지를 둔 면역 요법을 공부를 위한 적당한 모형입니다.

조작된 종양 관련 호중구를 종양 베어링 마우스로 옮겨 생체 내 혈관신생 잠재력을 연구합니다.

이 프로토콜은 전혈, 버피 코트 또는 백혈구 막에서 호중구를 분리하여 좋은 수율, 높은 순도 및 최소한의 세포 활성화를 달성하는 방법을 자세히 설명합니다. 그라데이션 정제, 적혈구(RBC) 퇴적물 및 RBC 용액을 활용하여 고품질/순도 호중구 제제를 획득합니다.

전신 혈액과 버피 코트에서 인간의 호중구의 격리

이 정의된 프로토콜은 in vitro에서 인간 호중구 세포외 트랩(NET) 방출을 시각화하고 정량화하기 위한 실시간 고처리량 현미경 접근 방식을 설명합니다. 재현 가능한 방법을 통해 뚜렷한 NETosis 유도 인자를 자극 시 NET 방출의 특성과 동역학을 조사할 수 있으며 NETosis 길항제의 약리학을 평가할 수 있습니다.

Human Neutrophil Extracellular Trap release의 실시간 고처리량 현미경 정량화 및 길항제의 약리학 평가

여기에서는 자기 분리(negative selection) 및 불연속 밀도 구배 매체를 사용하여 전혈에서 저밀도 및 정상 밀도 호중구를 분리하기 위한 신뢰할 수 있는 접근 방식을 제공합니다. 이는 고순도 세포(≥93%)의 손대지 않은 분리를 보장하여 건강과 질병에서 호중구 하위 집단의 역할을 이해하는 데 중요한 호중구 하위 집단의 정확한 다운스트림 분석을 용이하게 합니다.

전혈에서 저밀도 및 정상 밀도 호중구의 분리 및 특성화(The Isolation and Characterization of Low- and Normal- Density Neutrophils from Whole Blood)

학습하세요 항종양 특성을 가진 호중구 분리 및 기능 평가 방법을 배우세요. 밀도 구배법과 루시퍼라즈 표지 종양 세포 공배양을 통해 세포독성을 정량화하고 방사성 표지 없이 신뢰할 수 있는 결과를 얻는 기술입니다.

항 종양 특성을 가진 분리 및 호중구의 특성

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