Name: qPCRTag 분석 - 높은 처리량, Sc2.0 유전형에 대한 실시간 PCR 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 학습하세요 합성 효모 게놈 프로젝트를 위한 고처리량 실시간 PCR 기반 PCRTag 유전형 분석법. 1536 웰 플레이트와 나노스케일 음향 액적 분사 기술을 활용하여 겔 전기영동 없이 신속하게 합성 염색체와 야생형을 구분할 수 있습니다.

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이 작품은에 의해 부분적으로 지원되었다 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 MCB-0718846과 (JDB에) 방위 고등 연구 계획국 계약 N66001-12-C-4020. LAM은 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회에서 박사 친교에 의해 투자되었다. 이 문서의 공개는 로슈가 후원한다.

1. (gDNA를)를 효모 게놈 DNA를 준비 <ol><li> 50 mM 트리스의 pH 8.0, 100 mM의 NaCl을, 1 % SDS를 포함 효모 용해 버퍼 (9)의 재고를 준비 (W / V), 2 % 트리톤 X-100 (V / V), 1 mM의 EDTA pH가 8.0. </li><li> 일반적으로 BY4741 (10) 배경의 실험실 균주에 대한 포화 문화 100 ~에 μl를 해당 재료 사용 ~ 2 × 10 6 세포를 시작으로. 배양 된 세포는 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브 내에서 실온에서 3 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리에 의해 수집한다. 뜨는을 대기음. </li><li> 효모 용해 버퍼 200 μl를 추가하고 피펫으로 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 산은 비드 레벨 셀 슬러리의 수준 아래 약 1mm가되도록 유리 비드의 세정 ~ 300 μL를 추가한다. </li><li> 흄 후드에서 이소 아밀 알코올, 페놀 / 클로로포름 200 μL / 추가 (: 24 : 25 1). 의 microfuge 튜브 캡이 떨고 동안 누수가 발생합니다 어떠한 비드 캡과 튜브 사이에 붙어 있지 않은지 확인(단계 1.6). 혼합하고 뚜껑이 밀봉되어 있는지 확인하기 위해 3 회 전환. </li><li> 이러한 에펜 도르프 5432으로 탁상 믹서로 실온에서 10 분 동안 튜브를 흔들어. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 20,800 XG에 원심 분리기. </li><li> 전송을 100 % 에탄올 1 ㎖를 함유하는 미세 원심 새로운 튜브에 수성상의 75 μL. 혼합을 10 회 전환. </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 20,800 XG에서 원심 분리하여 DNA를 펠렛. </li><li> DNA 펠렛을 빠지없이 뜨는을 대기음. 70 % 에탄올 500 μL로 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 20,800 XG에 원심 분리기. </li><li> DNA 펠렛을 빠지 일반적으로 약 10 분이다 초과 에탄올이 증발 될 때까지 개방의 microfuge 모자와 펠렛을 공기 - 건조하지 않고 뜨는을 대기음. </li><li> 75 mM이 트리스 산도 7.4의 μL와 혼합하는 소용돌이의 DNA 펠렛을 재현 탁. 무기한 -20 ° C에서 샘플을 저장합니다. 을 사용하여 샘​​플에서의 DNA 농도를 측정RNA로부터 DNA를 구별 큐 비트, 같은 형광 계 벤치 탑. gDNA를 최종 농도가 ~ 1-2 NG / μL 있는지 확인하십시오. </li><li> 혼합 물과 소용돌이를 사용하여 게놈 DNA의 1:10 희석을 준비합니다. </li><li> 나누어 나노 탄성 액체 분배기 (단계 3)과 호환 소스 플레이트의 적당한 웰에 희석 된 gDNA 30 μL. Labcyte 에코 (550)를 사용하는 경우, 384 웰 폴리 프로필렌 플레이트 (384PP 판)를 사용합니다. 주 :이 경우 적절하게 밀봉 플레이트 -20 ° C에서 1 개월 이상 동안 저장 될 수있다. </li></ol> 2. 1536 멀티 웰 플레이트로 준비하고 분배 qPCR에 마스터 믹스 <ol><li> 혼합하는 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브와 소용돌이에 등의 LightCycler 1536 DNA 그린 마스터로 qPCR에 마스터 믹스 850 μL를 준비합니다. 모든 거품을 제거하기 위해 실온에서 20,800 XG에 2 분의 qPCR에 마스터 믹스를 원심 분리기. 단일 1536 멀티 웰 플레이트에 필요한 qPCR의 마스터 믹스의 구성 요소는 다음과 같다S : <ol><li> 효소 마스터 믹스 (집중 녹색 마스터 튜브 1, 5 배), SYBR의 42.5 μL (20 배 농축 된 녹색 마스터 관 (4))의 170 μL, 물 637.5 μl를 결합합니다. </li></ol></li><li> 분배도 같은 예술 로빈스 코브라와 같은 벌크 액체 디스펜서를 사용하여 1,536 멀티 웰 플레이트에 / 500 NL. (2.2.1-2.2.4는 코브라에 특이 적으로 참조 단계를 참고.) <ol><li> 다음 설정을 분배 프로그램 만들기 : 액체 클래스, 물; 대기음 볼륨, 800 μL; 볼륨, 500 NL을 분배; 시간, 20 초를 씻는다. 분배 설정에서, 분배 속도가 49.6 mm / 초로 설정되어 있는지 확인하십시오, 오프셋 분배는 0.25 mm로하고, 초과 흡입 된 액체는 잘 돌아 소스에 분배됩니다. </li><li> 미세 원심 분리 튜브의 뚜껑을 잘라하거나 열어두고 갑판의 위치 1에있는 미세 원심 분리 튜브 홀더, 잘 A1에서 qPCR에 마스터 믹스를 포함하는의 microfuge 튜브를 놓습니다. Aspirat을 편집하여 A1에 &#39;잘 대기음&#39;을 설정E 설정. </li><li> 이전에 &#39;실행&#39;을 치는 단계 2.2.2에서 설정 한 프로그램의 첫 번째 선택 해제 흡인 및 분배 단계로 qPCR에 마스터 믹스를 분배하고에 세척 단계를 수행합니다. 완료되면, 흡인를 다시 선택하고 qPCR에 마스터 믹스를 분배하기 위해 전체 프로그램을 실행하기 전에 단계를 분배. 코브라는 주요 시스템에 제공 미만 10 분 초기 세척 단계, 유휴 앉아 한 경우, 불필요하다. </li><li> 물론 각 qPCR에 마스터 믹스를 분배하는 &#39;실행&#39;을 누르십시오. </li></ol></li><li> 잘 1536 멀티 웰 플레이트 (저속 PCR 플레이트 스피너를 사용하여 30 초)의 짧은 원심 분리하여 각각의 하단에있는 qPCR에 마스터 믹스를 수집합니다. </li></ol> 3. 분배 템​​플릿 DNA와 1,536 멀티 웰 플레이트에 프라이머 <ol><li> 이러한 에코 (550)과 같은 탄성의 액체 전달 시스템을 사용하여, 1536 멀티 웰 플레이트의 웰에 원하는 희석 gDNA를 5 NL (단계 1.3)을 분배. <ol><li> ECH의 경우550 O를, 플레이트 재 포맷 소프트웨어를 사용하거나 다른 방법으로 전송 프로그램에 사용자 정의 Excel 스프레드 시트를 제공한다. 프로그램은 사용자가 물리적으로 gDNA를 (단계 1.3)을 분배 한 잘되는 소스 일치의 gDNA를 잘 선택한 소스를 확인합니다. 384PP 판에서 액체 계면 활성제없이 버퍼 나타냅니다 소스 플레이트 타입 &#39;384PP_AQ_BP2&#39;를 선택합니다. </li></ol></li><li> 프라이머, 순방향 전 혼합 및 에코 (550)과 같은 탄성의 액체 전달 시스템을 사용하여, 1536 멀티 웰 플레이트의 웰에 원하는 각각 50 μM의 최종 농도로 리버스 10 NL 디스펜스. <ol><li> 액체 전달 시스템의 경우, 플레이트 재 포맷 소프트웨어를 사용하여 또는 대안 적 전달을 프로그래밍하는 사용자 Excel 스프레드 시트를 제공한다. 주 : 여기 쉽게하므로 1536 멀티 웰 플레이트 레이아웃 시각적 실시간 PCR 결과를 검사하는 프라이머 염색체 순서와 일치되도록 프라이머를 분배 할 수있다이후 (단계 6). </li><li> 음향 액체 디스펜서와 호환되는 판에 프라이머를 프리믹스. 에코 (550)의 경우, Labcyte 384LDV (낮은 죽은 볼륨) 판을 사용하고 소스 플레이트 타입 &#39;384LDV_AQ_B&#39;액체가없는 단백질과 간단한 버퍼이다 나타 내기 위해 에코 프로그래밍을 선택합니다. </li></ol></li></ol> 4. 인감 및 원심 분리기 1536 멀티 웰 플레이트 <ol><li> 이러한 열 Plateloc 마이크로 플레이트 실러로 마이크로 시일 시스템을 이용하여, 즉시 열 시일기구와 호환되는 광학적으로 투명한 밀봉을 사용하여 1536 멀티 웰 플레이트를 밀봉. 얼룩 자국을 방지하기 위해 실의 표면을 만지지 마십시오. <ol><li> Plateloc 열 마이크로 실러를 사용하는 경우, 다음 설정을 사용 : 시간 ​​2.0 초, 인감 온도 162 ° C, 공기 압력 PSI (82)를 밀봉. 이 악기는 뜨거워 ~ 5 분 소요 등 사전에 설정되어야한다. </li><li> Plateloc 열 마이크로의 마감재를 사용하는 경우, adapteR은 좋은 밀봉을 보장하기 위해 악기의 무대에서 1536 멀티 웰 플레이트의 높이를 높이기 위해 사용되어야합니다. 참고 :이 Plateloc 열 마이크로 실러의 스테이지 판을 구입하는 것이 바람직하지만, 다른 솔루션은 1,536 멀티 웰 플레이트의 높이를 높이기 위해 모서리에 하드웨어 상점에서 사용할 수 네 ~ 2mm 두께의 표준 와셔를 삽입하는 것입니다. </li></ol></li><li> 즉시 각 웰의 바닥에 모든 시약을 수집하고 실온에서 3 분 동안 2,000 XG에 밀봉 1536 멀티 웰 플레이트를 원심 분리. </li></ol> 5. 리얼 타임 PCR <ol><li> 프로그램 용융 곡선 분석 다음 두 단계 증폭 프로토콜 등의 LightCycler 1536로서 1536 qPCR의 악기. 다음의 LightCycler 1536 소프트웨어 프로그램을 설정 사용 : <ol><li> 사전 배양 : 95 ° C, 1 분 유지, 램프 속도 4.8 ℃ / 초, 아니 취득. </li><li> 두 단계의 증폭 : 95 ° C의 30주기, 아니 유지,속도 4.8 ℃ / 초 램프, 아니 획득; 64 ° C, 30 초 유지, 램프 속도 2.5 ℃ / 초, 단일 획득]. </li><li> 용융 곡선 : 95 ° C, 10 초, 램프 속도 4.8 ℃ / 초, 아니 획득; 60 ℃, 1 분, 램프 속도 2.5 ℃ / 초, 아니 획득; 97 ° C, 램프 속도 0.1 ℃ / 초, 5 인수 / (연속) ° C. </li><li> 쿨 : 40 ° C, 30 초, 램프 속도 2.5 ℃ / 초, 아니 취득. </li></ol></li><li> 실행 정의 탭에서 &#39;녹색 인터 염료&#39;에 감지 형식을 설정합니다. </li><li> 실행 정의 탭에서 &#39;마스터 컨트롤&#39;에 피펫 제어를 설정합니다. 이 기능은 내부 통제의 역할과 추정 위음성을 식별하는 데 유용 1,536 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 qPCR에 마스터 믹스의 존재를 감지합니다. </li><li> 1,536 qPCR에 악기로 2 ~ 4 단계에서 제조 된 1536 멀티 웰 플레이트를 삽입하고 프로그램을 실행합니다. </li></ol> 6. 데이터 분석 <ol><li> 반환 한qPCR의 소프트웨어 내에서 데이터의 육안 검사를 ORM. 참고 : 1,536 소프트웨어는 모두 증폭의 시각화를 가능하게하고 호출 (긍정적, 부정적, 무효, N은 /도 2) 보여주는 열지도뿐만 아니라, 곡선 용융 (긍정적 또는 회색의 색상 규모를 슬라이딩, 교차점 값을 부정적인 위해도 3), 또는 엔드 포인트 형광 (EPF) 값 () 컬러 스케일을 슬라이딩. </li><li> 원시 데이터 또는 악기에서 오프라인으로 처리하기위한 계산 된 데이터 중 하나에 1,536 형태로 소프트웨어 .txt 파일 (결과 테이블) 또는 .xml 파일에서 데이터 내보내기. 참고 : 높은 신뢰와 양 / 음 및 CP 값 호출을 결정하면서 1536 소프트웨어에 내장 된 고유의 자동화 교차 포인트 (CP)를 호출 알고리즘은 상대적으로 낮은으로 낮은 서브 마이크로 리터 반응 볼륨에서 계정에 모양과 증폭 곡선의 기울기를합니다 형광 값. </li><li> 의 LightCycler DNA 그린 마스터 사용 인 경우qPCR에 대한 D는 모든 우물 &#39;마스터 컨트롤&#39;을 통과하는지 확인합니다. 실패는 잘은 qPCR에 마스터 믹스 및 누락 된 데이터 포인트가 잠재적 위음성 고려되어야한다을받지 않은 나타냅니다. 모든 우물 &#39;마스터 컨트롤&#39;을 통과하는지 확인합니다. 실패는 잘은 DNA의 mastermix를 수신하고 누락 된 데이터 포인트를 잠재적 위음성을 고려하지 않았다 나타냅니다. </li></ol>

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</ol>

LAM, NAP, 잼, JDB가 공개하는 게 없다. RC과 알은, 로슈 생명 과학에 의해 미국의 고용 및 원리 실험의 증거의 일부로 LAM 사용하여 응용 프로그램을 개발하는 일을하고 있습니다.

이 훨씬 더 높은 처리량을 가능으로 PCRTag의 유전자형 분석으로 실시간 PCR 검출의 설립은 Sc2.0 프로젝트의 중요한 발전이다. 이전 워크 플로는 384 웰 PCR 플레이트, 1.5 시간 열 사이클링 실행 시간, 아가 로스 겔 전기 영동, 겔의 수동 주석 2.5 μL 반응을 지정했습니다. qPCRTag 분석이라고 여기에 제시된 워크 플로우는 여러 주요 병목 현상을 극복한다. 첫째, qPCRTag 실행은 약 한 시간에, 마무리 (판 설정 플러스 실행 시간)에 시작, 처리 할 수​​있는 하나의 실험에 4 × 384 웰 플레이트를 응축. 그것은 qPCRTag 분석을위한 잘 당 시약 비용이 낮은 처리량 아가 로스 젤 기반의 접근 방식과 파에 있는지주의하는 것이 중요하다. 그러나, 겔 전기 및 수동 주석을 우회하여, qPCRTag 워크 플로우의 주요 장점 시간과 노동에 상당한 비용 절감을 제공한다. 중요한 qPCRTag 워크 플로우는 EN입니다자동화 tirely 호환. PCRTag 분석의 출력으로 실시간 탐지의 사용과 주요 관심사는 오탐 (false positive)과 음성 (false negative)의 속도입니다. PCRTag 프라이머 원래 실시간 PCR에 사용하기 위해 설계되지 않은 이후, 그것은 모든 프라이머 쌍이 출력 사용에 적합 할 것으로 예상된다. 이를 위해이 앞까지 실시간 기반 분석에서 작동하지 않는 일부를 제외 모든 PCRTag 프라이머 쌍의 기능과 특이성을 확인하는 것이 중요하다. 예를 들어, 3 번 염색체 PCRTag 위양성 및 네거티브은 바이 PCR 및 대형 데이터 (도 2 및 3) ​​실시간으로 재현성이 더욱 분석에서 제외 될 수있다. 또한, 실패 알려진 프라이머 쌍은 (겔 전기 영동으로 평가하고,도 S6과 외. 1 Annaluru의 S7에 도시)도 배제 할 수있다. 이것은 쉽게 EXCLU 단순히 달성딩은 음향 전송 프로토콜을 결함이있는 프라이머 쌍 설정할 때. 가장 높은 처리량 분석과 마찬가지로, 우리는 하류 검증을받을만한 형질 전환 체를 식별하기 위해 기본 화면으로 실시간 PCRTag 감지 기능을 사용하려는. 그 후, 차 심사를위한 황금 표준은 판독과 같은 겔 전기와 PCRTag 분석 유지됩니다. 높은 처리량 실시간 PCR 기술과 최첨단 나노 액체 처리 시스템을 결합 Sc2.0에 대한 PCRTag 분석의 응용 프로그램을 넘어 신속하고 자동화 된 분석을 가능하게하고 많은 분야에 영향을 미칠 수있는 가능성이있다. 예를 들어,이 흐름은 높은 처리량 라이브러리 스크리닝, 감염성 질병 진단, 마이크로 바이 분석, 최첨단 게놈 편집에 적용 할 수는 동시에 다수의 궤적을 수정하려고 접근한다.

Sc2.0, 또는 합성 효모 게놈 프로젝트 ( <a href="http://www.syntheticyeast.org" target="_blank">www.syntheticyeast.org은</a> ), 설계 및 완전히 합성 진핵 생물의 게놈을 구축하는 목표를 설정하고있다. 출발점으로 사카 cerevisiae의 3 고도로 큐레이터 게놈 서열을 사용하여, 열 여섯 선형 염색체 각 셀 체력을 유지 게놈 안정성을 향상, 유전 유연성을 증가 지정 설계 원칙들의 세트를 충족시키기 위해 재 설계되었다. 예를 들어, 반복 등의 불안 요소는 Sc2.0 염색체에서 삭제됩니다. TAG 정지 코돈의 모든 인스턴스는 비 - 유전 학적으로 인코딩 된 아미노산의 도입에 대한 최종적인 균주의 코돈 &#39;확보&#39;를 TAA로 재 부호화된다. 또한 Cre 호텔-LOX 시스템에 의해 활성화 유도 진화 시스템, 스크램블은, 새로운 구조 4 파생 게놈을 생성하는 전례없는 능력을 허용한다. <p class=&quot;jove_content는&quot;&gt; Sc2.0 게놈의 또 다른 주요 디자인 요소 합성 및 야생형 DNA의 추적을 가능하게 DNA 워터 마크 역할을 PCRTags의 도입이다. PCRTags 합성 염색체에 ORF를 짧은, 다시 코드 세그먼트이다; PCRTag 서열은 합성 및 야생형 염색체 DNA 간의 레벨 차이가있는 동안, 인코딩 된 단백질은 아미노산 서열, 따라서 아마도, 기능면에서 동일하다. PCRTag 시퀀스는 특히 선택적 증폭 (그림 1A)를 용이하게하기 위해 프라이머 결합 부위로 설계되어 있습니다. PCRTag 설계는 일반적으로 58 ° C, 60 ° C 사이 융점과 원시 시퀀스 (최소 33 %) 이상 ~ 60 % 다른 합성 서열을 코딩 수득 GeneDesign 5,6-에서 &#39;가장 다른&#39;알고리즘을 이용하여 수행된다 앰플 리콘은 200 ~ 500 염기쌍 2 사이의 길이. 이들 영역은 공지 된 바와 레코딩, 각 ORF의 처음 100 개의 염기쌍 내에 허용되지코돈 사용 (7)의 관점에서 특별한 설정을 가지고있다. 함께, 이러한 디자인 룰이 합성 및 야생형 PCRTag 프라이머 쌍 독점적 합성 및 천연 DNA 각각 (도 1b)를 결합하여 증폭함으로써 PCR 조건을 단일 조건에서 거의 모든 PCRTags의 고성능을 선호. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig1.jpg" /> 그림 1 :. PCRTag 설계도 () PCRTags는 Sc2.0 염색체에 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 내에서 시퀀스를 다시 코딩. (나) 합성 (SYN) 및 야생형 (WT) PCRTag 프라이머는 독점적으로 각각 결합하여 (gDNA를)를 합성하고 야생형 게놈 DNA를 증폭. 템플릿으로 (WT) 또는 반 synVIL2 gDNA를 중 하나를 사용하여 열세 PCRTag 프라이머 쌍을 테스트 염색체 육의 왼쪽 팔의 ~ 30킬로바이트 세그먼트의 분석은, 여기에 표시됨. 많은 경우, 단일 ORF는 하나 이상의 P를 인코딩CRTag. PCRTag 앰플 리콘의 존재 / 부재가 아가 로스 겔 전기 영동을 통해 평가된다. PCRTag의 증폭은 200 BP 500 BP에 크기가 다양합니다. 패널의 맨 아래에있는 빠른 마이그레이션 종은 프라이머 이량 체이다. PCRTag 분석 Sc2.0 염색체의 조립에 중요한 도구로 입증되었습니다. 20-30 PCRTags를 코딩하는 합성 DNA의 일반적인 실험 30-50킬로바이트에서는 대응 야생형 DNA 1,2,8을 대체하는 효모 세포 내로 형질 전환된다. PCRTag 분석이어서 DNA의 세그먼트에 걸쳐 합성 아닌 야생형 형질 PCRTags 인코딩을 식별하는 데 사용되며, 또는 &#39;승자 소위. 그것은 &#39;승자&#39;를 식별하므로 처리량과 PCRTag 분석의 비용이 중요한 고려 사항 여러 형질 전환을 테스트하는 것이 필요하다. 현재 두 Sc2.0 염색체가 Sc2.0 게놈의 10 % 미만을 나타내는 (synIII 1 synIXR 2) 완료되었는지, ALT무릎 더 남아있는 염색체의 절반 이상은 현재 합성 및 조립을 겪고있다. 이 프로젝트에 필요한 PCRTag 분석의 규모는 빠른 합성 DNA와 야생형 DNA의 부재의 존재를 젤을 실행하고 수동으로 득점 할 수있는 능력을 상회한다. 우리는 아가로 오스 겔 전기 영동의 사용을 회피하기 위해 실시간 PCR을 사용하여 흐름을 개발 PCRTag 분석의 처리량을 향상시킬 수있다. 워크 플로우는 1536 멀티 웰 플레이트, 주형 DNA와 프라이머를 전송하는 나노 탄성 액체 디스펜서의 각 웰에 qPCR에의 mastermix을 분배 벌크 액체 분배기를 사용한다, 그리고 1536 qPCR의 열 사이 클러는, 우리가 500 (NL)로 반응을 소형화 할 수 있도록하고 처리량을 극대화 할 수 있습니다. 또한 분석은 자동화 될 수있다. 높은 처리량 프로토콜의 유전자형이 유형은 여러 서식처에서 많은 클론의 분석을 요구하는 모든 프로젝트에 일반화 될 것이다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">효모 gDNA 준비</td></tr><tr><td>효모 gDNA</td><td></td><td>실시간 PCR을 위한</td><td>맞춤형</td> 템플릿</tr><tr><td>산 세척 유리 구슬 (0.5 mm)</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>효모 세포 용해</td></tr><tr><td>초순수 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 (25:24:1, v/v)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td>효모 세포 용해</td></tr><tr><td>5432 믹서</td><td>Eppendorf</td><td>5432</td><td>효모 세포 용해</td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td>효모 세포 용해</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 형광계</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td>gDNA 정량화</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR 어세이 키트</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>gDNA 정량</td></tr><tr><td>Labcyte 384PP 플레이트</td><td>Labcyte</td><td>P-05525</td><td>gDNA 소스 플레이트</td></tr><tr><td colspan="4">DNA Green Mastermix 준비 및 </td></tr><tr><td>분배 LightCycler 1536 DNA 그린</td><td>로슈</td><td>5573092001</td><td>실시간 PCR 마스터믹스</td></tr><tr><td>1.5ml 마이크로퓨지 튜브 홀더</td><td>ARI</td><td>EST BD060314-1</td><td>코브라 데크용 마이크로퓨지 튜브 홀더</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 멀티웰 플레이트</td><td>Roche</td><td>5358639001</td><td></td></tr><tr><td>Cobra 액체 처리 시스템</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>630-1000-10</td><td>분배 qPCR 마스터 믹스 1536 플레이트</td></tr><tr><td>PCR 플레이트 스피너</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>1536 플레이트</td></tr><tr>의 축<td colspan = "4 "> 템플릿 및 프라이머 분배</td></tr><tr><td>PCRTag 프라이머</td><td>IDT</td><td>사용자 정의</td><td>미리 혼합 정방향 및 역방향 50 &mu; M 각</td></tr><tr><td>TempPlate 피어싱 가능한 밀봉 호일, 멸균</td><td>USA Scientific</td><td>2923-0110</td><td>PCRTag 프라이머 플레이트용 임시 밀봉</td></tr><tr><td>Labcyte LDV 384 웰 플레이트</td><td>Labcyte</td><td>LP-0200</td><td>사전 혼합 프라이머 소스 플레이트</td></tr><tr><td>Echo 550 Liquid Handler</td><td>Labcyte</td><td></td><td>는 프라이머 및 템플릿 DNA 2.5nl 방울을 1536 플레이트로 전송합니다</td></tr>. <tr><td>Plateloc Thermal Microplate Sealer</td><td>Agilent</td><td>G5402-90001</td><td>LC1536 실행 이전 플레이트용 열 밀봉</td></tr><tr><td>투명 영구 밀봉</td><td>Agilent</td><td>24212-001</td><td>LC1536 멀티웰 플레이트용 광학 투명 열 밀봉</td></tr><tr><td>PlateLoc Roche/LightCycler 1536 플레이트 스테이지</td><td>Agilent</td><td>G5402-20008</td>은 <td>~2mm 두께의 와셔를 대체할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Sorvall Legend XTR</td><td>Thermo Scientfic</td><td>75-004-521</td><td>원심분리기 열 밀봉 1536 플레이트</td></tr><tr><td>산업용 공기 압축기</td><td>Jun Air</td><td>1795011</td><td>Echo 및 Heat Sealer</td></tr><tr>를 실행<td colspan="4">Real Time PCR</td></tr><tr><td>LightCycler 1536</td><td>Roche</td><td></td>에는 <td>220V 콘센트가 필요합니다</td></tr>.</tbody></table>

qpcrtag 분석 - 높은 처리량, sc2.0 유전형에 대한 실시간 pcr 분석

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

합성 효모 게놈 프로젝트 (Sc2.0)는 16 디자이너 효모 염색체를 구축하고 하나의 효모 세포로 결합하는 것을 목표로하고있다. 하나 합성 염색체 synIII 1, 및 하나의 합성 염색체 팔 synIXR 2를 지금까지 구성 및 그 생체 기능은 대응 야생형 염색체의 부재 하에서 검증되었다. Sc2.0 염색체의 중요한 설계 특징은 야생형 대응에서 합성 염색체의 차별화를 가능하게 오픈 리딩 프레임 (ORF를) 내 짧은, 재 코딩 시퀀스입니다 PCRTags의 도입이다. PCRTag 합성 또는 야생형 염색체 간단한 PCR 분석을 사용하여 테스트 할 수있는 DNA의 각 유형의 존재 / 부재 중 하나에 선택적으로 어닐링 프라이머. PCRTag 분석의 표준 판독 아가 로스 겔 전기 영동하여 증폭 산물의 존재 / 부재를 평가하는 것이다. 그러나, 1.5 킬로바이트 및 AG 당 하나의 평균 PCRTag 증폭 물 밀도~ 12 메가의 enome 크기는 완성 된 Sc2.0 게놈은 약 8,000 PCRTags를 인코딩합니다. 처리량을 개선하기 위해, 우리는 우리가 qPCRTag 분석 전화 PCRTag의 유전자형에 대한 실시간 PCR 기반 탐지 분석을 개발했습니다. 워크 플로는 우리가 하나의 실험에서 합성 및 야생형 프라이머 쌍 모두 768 PCRTags까지 테스트 할 수 있도록, 1536 멀티 웰 플레이트에서 500 NL 반응을 지정합니다.

우리는 네 가지 균주에서 추출한 효모 게놈 DNA (gDNA를)과 합성 및 야생형 염색체 3 PCRTag 프라이머 쌍 (1)를 테스트했다. 3 번 염색체는 염색체의 길이에 걸쳐 186 PCRTag 프라이머 쌍 (synIII이다 ~ 2백70킬로바이트 및 야생형 염색체가 3 ~ 3백15킬로바이트)을 갖는다. 프라이머의 두 세트와 네 개의 균주의 각을 테스트하기 위해, 우리는 하단에 각 사분면의 상단 절반 야생형에 합성 PCRTag 프라이머를 할당, 네 사분면, gDNA를 각 유형의 하나에 멀티 웰 플레이트를 나누었다. 게놈 DNA는, 야생형 염색체 3 (야생형, synIXR 2) 인코딩 중 두 효모 균주에서 추출 된 나머지 두 인코딩 합성 염색체 3 (synIII 1 synIII synIXR)한다. qPCR의 마스터 믹스에서 동일하게 배열 된 에코 550 프라이머를 사용하여 gDNA를 PCRTag 프라이머와 다음 벌크 액체 분배기를 사용하여 1536 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 분주쉽게 시각적 비교를 위해 멀티 웰 플레이트의 각 사분면. 멀티 웰 플레이트는 광학적으로 투명 씰로 밀봉 실시간 PCR 분석을 실시 열을했다. 예상대로 qPCRTag이 실험에서는 합성 프라이머 단독 합성 DNA 반대로 증폭함으로써, 대부분의 경우, 증폭, 관찰 (도 2 및도 3). 그러나, 우리는 또한 데이터 세트에서 위음성 및 위양성을 제안, 예상 패턴에서 여러 편차를 관찰했다. 이 실험에서, 마스터 제어가 성공적 웰 플레이트에 각에 mastermix을 벌크 액체 분배 디스펜서를 나타내는, 웰의 100 %에서 검출되었다 (데이타 미기재). 이것은 음성 (false negative)의 하나의 잠재적 인 원인을 배제. 또한, 일부 염색체 3 PCRTags은 적어도 2 SYN 1 WT 포함한 (도 S6에 도시 Annaluru 등의 S7. 1)이 실패하는 것으로 알려진프라이머 쌍; 따라서이 우물은 각 사분면에서 무시 될 수있다. 진정한 위음성이 올바른 에코 (550)의 교정뿐만 아니라 gDNA를 준비하고 설명 된 바와 같이 프라이머 주어진, 우리의 경험하지만, 템플릿 gDNA를 또는 프라이머의 전송의 부족으로 발생할 수있는이 오류의 주요 원인이되지 않았습니다. 전반적으로이 실험에서 위음성 율은 (WT) 템플릿 (~ 2 %) SYN DNA (~ 8 %)로 SYN 프라이머에 대한 다소 높은 있지만과 (WT) 프라이머 매우 낮았다. 위양성는 SYN 프라이머는 gDNA를 WT (및 그 반대)와 혼합 웰 신호의 검출은, 크로스 또는 증폭 프라이머 다이머에서 발생할 수있다. 실제로, 프라이머 이량 체는 겔 전기 영동 (그림 1B)에 의해 종종 볼 수 있습니다 및 오류의 합리적인 소스를 나타냅니다. qPCR에의 적용, 용융 곡선의 시험은 프라이머 이량 체와 같은 다른 종, 신호에 기여 될 수 있는지를 결정하는데 유용 할 수있다. 또한, 반환 한프라이머 이량 성향 프라이머를 식별 할 수있다 주형 DNA의 부재에 분배되어있다 대조 실험을 orming. 너무 많은 PCR 사이클이 수행되는 경우, 또는 열처리 온도가 너무 낮 으면 크로스 증폭 특히, 겔 전기 영동에 의해 관찰 될 수있다. 우리 qPCRTag 프로토콜에 대한 이들 파라미터의 양을 최적화함으로써 증폭에 의한 크로스 위양성의 수를 최소화하기 위해 시도했다. 마지막으로, 실시간 기반의 탐지에 적합하지 않은 프라이머를 식별하는 데 도움이 아니라 각각의 교차점 (CP) 값을 검사 (예를 들어, 그림 3, Bb22, Fb22, Bb46, Fb46). 전반적으로이 실험에서 위양성률은 SYN 템플릿 (~ 10 %)와 WT 프라이머에 대한 (WT) 템플릿 (~ 5 %) 이상으로 SYN 프라이머에 대한 낮았다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig2.jpg" /> 그림 2 : 존재 / AB를 표시 플레이트 열지도qPCRTag 실험에 대한 sence 호출. SYN을 분리하는 흰색 점선 게놈 DNA (사분면 고체 흰색 선으로 구분) 합성 (SYN)를 사용하여 PCRTag 분석을 실시 하였다 및 야생형 (WT) 염색체 3 PCRTag 프라이머 (의 4 개의 다른 종류의 (위 각 사분면) 및 WT (아래)). (WT)과 synIXR gDNA를이. synIII과 synIII synIXR gDNA를가 SYN PCRTag 프라이머로 증폭를 산출, 합성 염색체 3 인코딩 (WT) PCRTag 프라이머로 증폭를 산출, 야생형 염색체 3 인코딩. 프라이머는 왼쪽에서 오른쪽으로 염색체 위치에 따라 배열과 비교를위한 네 개의 사분면에서 동일하게 위치한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig3.jpg" /> 그림 3 : 플레이트 열qPCRTag 실험에 대해 교차점 (CP)의 값을 표시하는 맵. 이것은도 2에서와 동일한 데이터 집합이고 플레이트 레이아웃 따라서 동일하다. N / A는 더 증폭 &#39;을 의미한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Synthetic Yeast Genome 프로젝트인 Sc2.0의 디자이너 염색체는 존재/부재 종말점이 있는 PCRTagging이라는 PCR 기반 유전형 분석 분석을 사용하여 네이티브 염색체와 구별할 수 있습니다. 여기에서는 PCRTag 유전형 분석을 위한 고처리량 Real-Time PCR 검출 방법에 대해 설명합니다.

qPCRTag 분석 - 높은 처리량, Sc2.0 유전형에 대한 실시간 PCR 분석

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

QPCR TAG 분석의 전반적인 목표는 실시간 PCR 기반 검출 시스템과 소형화된 반응을 구현함으로써 합성 효모 게놈 프로젝트 PCR TAG 유전자형 분석법의 처리량을 향상시키는 것입니다. 이는 먼저 벌크 액체 분주기를 사용하여 1536 멀티웰 플레이트의 각 웰에 QPCR 마스터 믹스를 분주함으로써 수행됩니다. 그다음, 나노스케일 음향 액적 방출 로봇이 템플릿 DNA와 프라이머를 멀티웰 플레이트의 웰로 옮깁니다.그 다음 플레이트를 밀봉하고 A-Q-P-C-R 열순환기(thermocycler)를 통해 반응을 진행합니다. 마지막으로, 실시간 PCR 데이터를 분석하여 각 유전자좌(locus)에 합성 PCR 태그 또는 야생형 PCR 태그의 존재 여부를 결정합니다. 결과적으로 이러한 QPCR 태그 워크플로우는 처리량을 향상시킵니다.이 기술의 현재 PCR TAG 분석법 대비 주요 장점은 젤 전기영동과 해당 젤의 수동 주석 처리를 생략할 수 있다는 점입니다. 우리는 더 긴 염색체에 대해 PCR 태깅을 수행하는 것이 얼마나 많은 시간과 노동력이 소요될지 깨달았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 약 200만 개의 효모 세포를 배양 및 수확한 후, 200 µL의 효모 용해 버퍼를 첨가하고 피펫으로 재현탁합니다.펠렛에 세포 층보다 약 1mm 낮은 위치까지 300 µL의 산 세척 유리 비드를 추가합니다. 그 다음 흄 후드 내에서 200 µL의 phenol chloroform, isoamyl alcohol을 첨가하고, 튜브를 세 번 뒤집어 혼합한 후 캡이 밀봉되었는지 확인합니다. 이후 벤치탑 믹서를 사용하여 상온에서 10분 동안 튜브를 흔들어 섞어줍니다. 원심분리 후, 수층 75 µL를 1 mL의 100% ethanol이 들어있는 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.다시 원심분리한 후 튜브를 10회 반전시켜 혼합하고, 펠렛이 떨어지지 않도록 상층액을 흡입하여 제거한 다음 500 µL의 70% ethanol로 펠렛을 세척합니다. 상층액을 제거한 후 75 µL의 10 mM tris pH 7.4를 사용하여 펠렛을 재현탁하고 볼텍싱하여 혼합합니다. DNA를 1:10으로 희석한 후, 나노스케일 음향 액체 분주용 소스 플레이트의 해당 웰에 희석된 GDNA 30 µL를 분주합니다.1.5 milliliter 마이크로 튜브에 850 microliters의 QPCR 마스터 믹스를 미리 준비하고 볼텍싱하여 혼합합니다. 그 다음, 20,800 G의 원심력과 상온 조건에서 2분 동안 원심 분리하여 기포를 제거합니다. 그런 다음 벌크 디스펜서를 사용하여 1536 멀티웰 플레이트의 각 웰에 500 nanoliters씩 분주합니다.플레이트를 짧게 원심 분리하여 각 웰 바닥에 QPCR 마스터 믹스를 모읍니다. 다음으로, 음향 액체 이송 시스템을 사용하고 텍스트 프로토콜에 설명된 세부 사항에 따라, 희석된 GDNA 5 nanoliters와 50 micromolar로 미리 혼합된 정방향 및 역방향 프라이머 10 nanoliters를 멀티웰 플레이트의 원하는 웰에 분주합니다. 음향 액적 기술은 소리를 이용하여 소량의 액체를 소스 플레이트에서 뒤집힌 목적지 플레이트로 수직 이송합니다.여기서는 qPCR 태그 반응을 설정하기 위해 템플릿, DNA 및 프라이머를 2.5 nanoliter 방울의 배수로 1536 멀티웰 플레이트의 웰에 분주합니다. 그다음, 광학적으로 투명한 씰과 마이크로플레이트 씰링 시스템을 사용하여 1536 멀티웰 플레이트를 즉시 밀봉합니다.밀봉된 플레이트를 즉시 실온에서 2000 G로 3분 동안 원심 분리하여 모든 시약을 웰 바닥에 모은 후, 텍스트 프로토콜의 지침에 따라 실시간 PCR 프로그램(QPCR 장비)을 설정하고 완료되면 실행 버튼을 누릅니다. 모든 웰이 마스터 컨트롤을 통과했는지 확인하십시오. 이는 웰 내에서 QPCR 마스터 믹스가 검출되었음을 나타냅니다. 컨트롤을 통과하지 못한 웰은 잠재적인 위음성 데이터 포인트가 될 수 있습니다.데이터를 분석하려면 QPCR 소프트웨어 내에서 시각적으로 검토하거나, 기기에서 데이터를 내보내 오프라인으로 처리하십시오. 본 실험에서는 네 가지 서로 다른 균주에서 추출한 효모 GDNA를 사용하여 야생형 및 합성 3번 염색체 PCR 태그 프라이머 쌍을 테스트했습니다. 이 중 두 균주는 야생형 3번 염색체를 가졌으며, 다른 두 균주는 합성 염색체를 인코딩하고 있었습니다.예상대로 세 가지 합성 프라이머는 일반적으로 야생형 DNA가 아닌 합성 DNA를 증폭시켰습니다. 마찬가지로 야생형 프라이머는 야생형 DNA로부터만 앰플리콘을 생성했습니다. 소수의 위양성 및 위음성이 관찰되는 것은 예상되는 결과이며, 이러한 오류의 가능한 원인은 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 기술되어 있습니다.이 기술을 숙달하면 처음부터 끝까지 약 1시간 안에 완료할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

qpcrtag-analysis-high-throughput-real-time-pcr-assay-for-sc20

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연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 샘플 제한된 양의 작업 특히, microRNA (miRNA) 표현 수준에 대해 비용과 시간 효율 높은 처리량 검사 도구로 microfluidic 플랫폼와 함께 최적화된 멀티 플렉스 반전 transcriptase 정량 PCR (qRT - PCR) 프로토콜을 설명합니다.

높은 처리량 MicroRNA의 프로파일 : 최적 멀티 플렉스 플루 동적 ArrayTM의 IFCs에 Nanoliter의 규모 qRT - PCR

이 비디오에서는 용융 온도 분석을 기반으로 다양한 염기서열 길이의 DNA 단편의 길이 다형성을 결정하는 고해상도 용융 PCR 기술에 대해 설명합니다.

돌연변이 DNA 염기서열의 염기서열 변화를 결정하기 위한 고분해능 용융 PCR

이 비디오는 DNA 샘플에서 단일 뉴클레오티드 변이를 검출하기 위한 chip-in-a-tube 형식의 디지털 PCR의 유용성을 보여줍니다. 단일 PCR 반응은 독립적인 PCR 반응으로 작용하는 챔버로 분할되며, 챔버 내 증폭된 표적에서 형광 신호를 검출하는 것은 샘플 내 변이 대립유전자의 빈도를 계산하는 데 사용됩니다.

단일 뉴클레오티드 변이체의 정량화를 위한 Chip-in-a-tube 기반 디지털 PCR

여기에서는 T-세포 수용체 절제원(TREC)과 K-삭제 재조합 절제원(KREC)을 동시에 정량화하는 방법을 설명합니다. TREC/KREC 분석은 흉선 및 골수 배출량의 마커로 사용할 수 있습니다.

T 세포 수용체 절제술 원의 동시 정량 (TRECs)와 K-삭제 재조합 절제술 원 (KRECs) 실시간 PCR에 의한

Provided는 열 순환기 또는 현미경 및 스테이지 히터를 사용하여 DNA 샘플의 초기 농도를 정량화하기 위한 실시간 재조합효소 중합효소 증폭 분석을 개발하기 위한 프로토콜입니다. 또한 내부 양성 대조군의 개발도 설명되어 있습니다. 원시 실시간 형광 데이터를 처리하기 위한 스크립트가 제공됩니다.

내부 양성 대조군과 양적 재조합 효소 중합 효소 증폭 분석 개발

이 원고는 상향 및 하향 벡터 - 숙주 접합 DNA를 동시에 분석 할 수있는 양방향 통합 사이트 분석을위한 실험 절차 및 소프트웨어 분석을 설명합니다. 양방향 PCR 제품은 모든 다운 스트림 시퀀싱 플랫폼에 사용할 수 있습니다. 결과 데이터는 통합 DNA 표적의 높은 처리량, 정량적 비교에 유용합니다.

양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

식물 병원 체 현장, 특히 토양을 매개로 병원 균의 신속 하 고 정확한 검색은 추가 inoculum 생산 및 공장 분야에서 질병의 확산을 방지 하기 위해 중요 합니다. 여기 휴대용 실시간 PCR 탐지 시스템을 사용 하 여 개발 메서드 필드 조건에서 현장 진단이 있습니다.

휴대용 실시간 PCR 시스템을 사용 하 여 토양 품 어진 Phytopathogens의 현장 분자 검출

디지털 연쇄 반응 (PCR) 단일 뉴클레오티드 이체와 DNA 복사 번호 이체의 고감도 검출을 위한 유용한 도구입니다. 여기, 칩에 튜브 형식으로 디지털 PCR를 사용 하 여 인간 게놈에 있는 드문 이체를 측정 하기 위한 주요 고려 사항을 설명 합니다.

튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과

이 기사에서는 임상 고형 종양 샘플에서 종양 발생 유전자 융합을 평가하기 위해 차세대 염기서열 분석 뒤에 앵커된 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응 기반 라이브러리 준비 키트의 사용을 자세히 설명합니다. 습식 벤치 와 데이터 분석 단계가 모두 설명되어 있습니다.

앵커드 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응을 이용한 종양발생 유전자 융합 검출 후 차세대 염기서열 분석

이 작업은 2색 ddPCR 시스템을 사용하여 SARS-CoV-2 검출을 위한 다양한 분석법을 개발하는 단계를 요약합니다. 단계는 정교하며 분석 및 실험 성능을 개선하는 방법에 대한 메모가 포함되어 있습니다. 이러한 분석은 여러 SARS-CoV-2 RT-ddPCR 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

SARS-CoV-2 검출 및 정량화를 위한 2단계 역전사 액적 디지털 PCR 프로토콜

이 프로토콜은 Caenorhabditis elegans에서 감수분열 동안 교차 빈도 및 분포를 측정하는 방법을 제공합니다. 염색체의 기원을 결정하기 위해 Real-time PCR을 사용한 single-nucleotide polymorphism genotyping을 사용했습니다. 4점 매핑을 통해 각 염색체의 왼쪽, 중앙 및 오른쪽 팔 영역의 교차 분포를 결정할 수 있었습니다. ...

Real-time PCR을 이용한 SNP 유전형 분석에 의한 Caenorhabditis elegans 감수분열의 교차 빈도 및 분포

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qPCRTag 분석 - 높은 처리량, Sc2.0 유전형에 대한 실시간 PCR 분석

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