Name: Zebrafish의 배아에 주입 마이크로 비드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: 학습하세요 제브라피시 배아에 마이크로비드를 주입하여 조직 환경을 조작하고 발달 과정에서 분자 효과를 평가하는 방법을. 이 기술은 정상 발달을 방해하지 않고 유전자 발현 및 기관형성 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 NIH 보조금 DP2OD008470에 의해 지원되었다.

이 프로토콜에 설명 된 제브라 피쉬 배아 작업을위한 절차는 노틀담 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 링거액 준비 <ol><li> 모든 염 침전을 피하기 위해 계속 교반하여 초순수 H 2 O와 116 mM의 염화나트륨, 2.9 mM의 KCl을 3.6 mM의 CaCl2를, 5 mM의 헤 페스의 용액을 제조. </li><li> 염을 추가하고 솔루션을 계속 교반하면서 한 후, 100 단위 / ㎖ 당 페니실린과 ml의 당 100 μg의 스트렙토 마이신을 추가합니다. </li><li> 모든 항생제와 염을 추가 한 후, 멸균 용기에서 솔루션 및 저장소의 필터 살균을 수행합니다. 주 : N - 페닐 티오 (1- 페닐 -2- 티오 우레아) 또는 PTU는 배아의 건강에 부정적인 영향없이 이식 된 배아 비드 안료의 형성을 차단하는 링거 용액에 첨가 될 수있다. 링거액 / 색소 블로킹 용액을 조제, concen를 사용0.003 %의 PTU의 tration. 인해 PTU의 낮은 농도는 PTU 분말 조금만 첨가량 피하기 위해, 링거액의 큰 부피가 적어도 1 L 이루어질 수 있음을 통보한다 첨가한다. 용액을 교반하는 동안, 단계 1.2 동안 PTU를 추가합니다. </li></ol> 2. Tricaine 솔루션 준비 <ol><li> 9.5의 pH에 균형 잡힌 1 M 재고에서, 솔루션 플러스 0.1 M 트리스의 L 당 에틸의 3 아미노 벤조 에이트 메탄 소금 (Tricaine을) 2g을 추가하고 초순수 H 2 O로 만든 주 : Tricaine 비드 주입 표현형 분석을 위해 원하는 시점 제브라 피쉬 배아를 안락사하는데 사용될 것이다. </li></ol> 3. E3 솔루션 준비 <ol><li> E3 1 L를 만들 0.25 M의 NaCl, 10 mM의 KCl을, 12.5 mM의 CaCl2를, 16.6 mM의 MgSO4로 초순수의 1 L의 용액을 제조. </li><li> 곰팡이 성장을 억제하기 위해 E3 솔루션에 메틸렌 블루의 200 μl를 추가합니다. </li></ol>마이크로 비드 전송 4. 당기 바늘 <ol><li> 외경에 필라멘트 화재 연마 붕규산 유리를 사용하여 1.0 mm, ID : 0.5 mm로, 10cm의 길이에. </li><li> 미세 바늘을 준비하는 마이크로 피펫 풀러에 borosilicated 유리를 놓습니다. 주 : = 245, 속도 = 200, 및 125 시간 = 당겨 열 = 540 : 다음의 네 가지 사이즈 바늘 당겨 출발점으로 사용될 수있다. </li><li> 바늘의 적절한 수의 당기 후, 해당 플라스틱의 상점은 사용할 때까지, 모델링 점토 또는 바늘 끝을 위반 방지하기 위해 접착 테이프의 스트립에 위치 요리를, 페트리. </li><li> 원하는 내경에 바늘 끝 트림, 바늘의 끝 점을 잘 포셉 한 쌍을 사용합니다. 참고 : 바늘 구멍의 크기는 마이크로 비드 크기가 사용뿐만 아니라 사용자 취급되는 환경에 따라 달라질 수 있습니다. 50-100 μm의 범위 마이크로 비즈가 이용 될 경우 좋은 출발점은 100 ~ 200㎛의 범위에서 선박 구멍 크기이다. </li><li> 프리 오R이 완료된 마이크로 비드 전달기구를 패션으로 모세관 홀더에 트리밍 바늘을 삽입, 사용하기. </li></ol> 5. 수염 / 래쉬 도구 준비 <ol><li> , 수염을 구하는 채찍, 또는 천연 또는 합성 머리 필라멘트의 다른 작은 아직 회사 조각. 45 ° 각도에서 필라멘트의베이스 부근 잘라. 영구 명확한 접착제 접착제를 사용하여 P-1000 마이크로 피펫 팁에 수염을 준수합니다. </li></ol> 6. 마이크로 비드 주입 트레이 준비 <ol><li> E3 용액 100ml를 2 % 아가 로스 겔 E3을 확인하여 2 g의 아가를 섞는다. </li><li> 위에 기포로부터 겔을 피하기 위해 플라스크마다 30 초 소용돌이, 250 mL의 삼각 플라스크에 1 분 30 초 동안 2 % 아가로 오스 용액을 가열한다. </li><li> 60mm X 15mm 페트리 접시의 뚜껑을 타고 위로 향 인테리어 더 큰 150mm X 15mm 접시에 넣습니다. </li><li> 아래로 고정해야하고, 150mm X 15mm 페트리 접시에 뜨거운 아가 로스 젤을 붓고집게 손가락으로 작은 접시의 뚜껑. 주 : 겔을 형성 할 때 붓는 응축을 제거하는 작은 접시 뚜껑 아래 아가 박층 허용; 이 해부 현미경으로 볼 수있는 구슬 쉽게 할 것이다. </li><li> 아가로 오스가 냉각로는 굳은 전에, 그러나, 젤에 잘 금형을 배치합니다. 이 배아 쉽게 배치 할 수 있습니다. </li><li> 주 : 겔의 상부에 부유 될 때까지 웰 중의 기포를 피하기 위해, 각도 천천히 금형을 배치. </li><li> 젤이 응고되면 microspatula을 사용하여 조심스럽게 잘 곰팡이를 제거. 4 ℃에서 E3 솔루션 및 저장소를 추가합니다. </li></ol> 7. 배아 컬렉션 <ol><li> 시스템 물로 채우고, 다음 챔버 O / N에서 성인 남성 제브라 피쉬 (들) 및 여성 (들) 쌍을 배치하여, 칸막이에 의해 분리 메이팅 챔버를 준비한다. </li><li> 미세 와이어 메쉬 스트레이너를 사용하여 수정 된 알을 수집 (배아 단계는 약간 다름). </li><li> 이 접시에 E3 솔루션의 약 25 ml의 스트레이너에 남아있는 계란이 없을 때까지 거꾸로 스트레이너를 켜고 E3의 벌금 스트림으로 세척하여 깨끗하고, 10cm 직경 페트리 접시에 수정란을 입금합니다. </li><li> 수집 한 후, 클러치 내에서 개발 비동기로 이어질 어려운 원하는 시간 포인트를 수집 할 수 있습니다 혼잡을 피하기 위해 몇 가지 요리 (접시 당 약 50 ~ 60 알)에 계란을 나눕니다. </li><li> 표준 제브라 피쉬 준비 시리즈 (40)에 따라 개발 평가를 가능하게 28.5 ℃에서 E3 솔루션의 배아를 품어. 참고 : 배아는 이전 단계에서 조작 광학 선명도를 필요로하는 경우 안료 개발을 방지하기 위해 24 시간 게시물 수정 (HPF)에서 E3 / PTU로 전송해야합니다. </li></ol> 8. 구슬 주입 <ol><li> 원하는 테스트 분자 농도 또는 마이크로 비드 대응 차량들 부화적절한 볼륨에서 필요한 시간 olution. 참고 : 연구원은 멸균 페트리 3-6cm 직경에 이르기까지 요리, 또는 솔루션 내에서 마이크로 비드의 시각화를 가능하게 둘 다 잘 접시를 사용할 수 있습니다. 시간은 종류와 관심의 분자의 양에 따라 달라질 수 있으며, 연구원은 빛과 온도에 대한 민감도로 배양과 다른 측면의 기간 동안 제조업체 또는 게시 권고를 참조해야합니다. </li><li> 배아가 원하는 개발 시점에 도달하면, 미세 집게를 사용하여 chorions에서 배아를 제거합니다. </li><li> 용액에 이들을 적응 10 분간 항생제 여과 링거 용액 배아 부화. </li><li> 배아 acclimating하는 동안, 주입 용지함에 자리 잡고 마이크로 비드 판에 마이크로 비드를 전송하고 10 분 동안 링거 용액을 씻어. 참고 :이 점에 도달 한 후 50 분 내 구슬을 이식. 이 승한 병은 대상 분자의 작은 농도 비드를 이식 할 가능성을 감소시킨다. </li><li> 이식 될 마이크로 비드에 액세스 할 수있는 위치 때문에 관심의 영역을 그 방향을 돌보는 마이크로 비드 주입 트레이의 우물에 배아 배열입니다. </li><li> 텅스텐 바늘을 사용하여 배아에 작은 절개를합니다. </li><li> 마이크로 캐 필러 전송 피펫 사용하여 배아에 마이크로 비드로 이동 : 피펫의 전구를 우울을 부드럽게 모세관 컬럼에 마이크로 비드를 당긴 다음 원하는 목적지에 마이크로 비드를 전송하는 압력을 놓습니다. </li><li> 배아 내부의 마이크로 비드의 위치를​​ 수염 / 속눈썹 도구를 사용합니다. 참고 :이 치유로 마이크로 비드가 배아에서 추방되지 않도록 절개의 사이트에서 멀리 조직으로 마이크로 비드를 배치해야합니다. </li></ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

지난 세기 동안 몸 계획 패터닝 및 기관 형성의 이해는 기념비적 인 발전을 겪고있다. 조직의 조작 기술이 핵심 프로세스에 대한 주요 정보를 폭로 중요했다. 유전 적 변형은 유전자의 기능을 확인하는 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나이며, 이러한 세포 이식과 같은 모자이크 분석 방법은 유전자 기능의 자율성을 이해하는 유용한 방법을 제공한다. 마이크로 비드 주입이 방법은 신호 분자 또는 억제제를 도입하여 지방 조직 환경을 변경하는 연구원 수로, 발달 역학을 변경하는 방법을 특정 분자 심문하는 또 다른 장소를 제공합니다. 다른 마이크로 비드의 범위는 다양한 크기 및 다른 물리적 특성은 이들이 관심있는 실험 조건에 이용 될 수 있도록 (예를 들어, 전하)이 존재했는지, 시판되고있다. 따라서, 단백질 또는 CHEMI 침잠 마이크로 비드를 주입​​함으로써생물체 내에서 관심의 칼은, 연구자들은 개발 과정 지역화 효과를 조사하고 유전자 또는 관심과 특정 생물학적 표현형 (들)의 분자 사이의 연관성을 찾을 수 있습니다. 이러한 제브라 피쉬 (23)에 전방 뇌 머리 뼈 (ANC)의 골격에 패터닝 증가 헤지 호그 신호 전달의 효과를 평가하기 위해 마이크로 비드 주입을 사용하여 수행 한 와다 동료로서 연구. 이전의 연구 쉬가 ANC 형성 (14)에 필요한 것으로 나타났습니다. 사용 쉬 코팅 된 마이크로 비드의 연구자들은이 신호가 ANC의 연골 형성을 촉진 것을 확인했다. 마이크로 비드 주입 공정은 ANC에 헤지 호그 시그널링 및 연골 형성 간의 분명한 연결을 보여주기 위해 사용되었다. 과학자들은 Erythroblastoma 26 개의 전사 제어를 조사 곳 제브라 피쉬에서이 조직 조작 기술의 또 다른 주요 예는 연구에서 관찰된다 (ETS) 도메인 F배우 ETS 관련 분자 (ERM) 및 초기 제브라 피쉬의 뇌 발달 19시 FGF 신호에 의해 폴리오 마 인핸서 활성화 3 (Pea3). 마이크로 비드 주입 실험을 통해, 그들은 Fgf8과 Fgf3는 ectopically 음과 pea3의 발현을 활성화 할 수 있다는 것을 보여줄 수 있었다. 이러한 예 41 유전자 발현을 평가하기 위해 방법의 사용에 의해 잘 특징 화 될 수있는 조직 형성 동안에 공동 개발 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하기 위해 마이크로 비드의 유틸리티를 나타낸다. 따라서, 마이크로 비드 이식은 신장을 일으킨다 중간 중배엽 (IM)와 같은 다른 조직을 탐험 실용적인 방법 일 수있다. 구체적으로는 네프론 (42) 분할 및 43, 44, 단지 피상적으로 현재 이해되는 과정을 세뇨관에 미치는 영향에 다른 분자를 조사하기 위해, 신장 발달 연구에 도움이됩니다. 또한, 마이크로 비드 주입 스터드 사용하기 시작했다제브라 피쉬 (29)]과의 Y 재생 공정은 대응 성인 구조로 연구를 수행하기 위해 제형 화 된 방법으로 네프론 45 함께 같은 배아 조직 다음 레이저 박리 등의 장기의 재생 모델의 숫자와 함께 사용하도록 적응 될 수있다 46-49. 마지막으로, 마이크로 비드 주입 암 50, 51 52, 53 또는 조직 퇴화와 같은 인간 질병의 모델에서 사용될 수있는 잠재력을 가지고있다. 본 프로토콜, 우리는 또한 마찬가지로 다른 연구자들에 의해 설명하지만, 비디오 프로토콜 (1)을 통해 도시하지 않음 된 제브라 피쉬 배아에서 마이크로 비드 주입의 방법을 보여줍니다. 최소한의 연습으로 우리는 연구자가 경험이되면이 절차의 타당성에 관한 8-10 배아의 대략적인 속도 / 시간에서 마이크로 비드를 이식 할 수 있었다. 본원에 나타낸 결과는 다양한 D의 비드를 보여imensions는 초기 단계에서 주입 될 수 있음을주의해서,이 조직 조작 기술은 배아에 최소한의 물리적 파괴로 구현 될 수있다. 강조되어야 하나 개선 배아에 마이크로 비드를 위치 위스커 / 래시 도구의 사용이다. 장비의 비교적 저렴​​하고 간단한 조각 마이크로 비드와 동일한 직경에 대해, 획득이 용이하고 주입 공정을 단축하는 데 도움이된다. 수염 / 속눈썹은 연구원의 손재주와 선호도에 따라, 아직 섬세한 구슬 처리 도구 회사를 생산하기 위해 원하는 길이로 절단 할 수 있습니다. 우리가 여기에 물리적으로 주입을 수행하기 위해 마이크로 비드와 제브라 피쉬의 배아를 조작하는 방법을 설명하면서 마지막으로,이 프로토콜은 다른 약물이나 펩타이드에 대한 구체적인 처리 절차를 간략하게 설명하지 않습니다. 일반적으로, 화학 처리 된 마이크로 비드는 유기체의 다른 영역에서의 바람직하지 않은 효과를 방지하기 위해, 편의와 동물에 주입해야하며, 연구자들은 잘이어야공부를 시작하기 전에 이러한 화학 물질과 관련된 가능한 안전 문제에 대해 형성. 결론적으로, 우리 실험실에서 쉽게 사용할 수있는 물질을 사용하여 다양한 애플리케이션과 비교적 간단하고 효율적인 마이크로 비드 주입 방법을 증명하고있다. 궁극적으로, 우리는이 매뉴얼은 제브라 피쉬 조직 조작의 섬세한 자연과 연구에 도움이되기를 바랍니다.

발달 생물학 연구자들은 유기체를 형성하는 방법을 제어 메커니즘을 밝히기 위해서, 세포 분자 및 유전 적 방법의 광대 한 배열을 사용한다. 이러한 방법 중 조직 조작은 세포의 운명, 세포 이동 및 조직의 조직에 대한 복잡한 질문을 해독하는 핵심 도구입니다. 지방 조직 환경을 변경하는 하나의 방법은 단백질 또는 기타 신호 분자 (1)의 초점 소스를 제공하기 위해 사용되는 마이크로 비드의 적용을 통해 수술이다. 실험 조작이 유형 널리 개구리 및 병아리 2 클래식 척추 발생학 모델로 구현되었다. 제브라 피쉬는 기관 형성의 연구에 중요한 척추 모델 생물이되고 그들은 인간 6 높은 유전자 보존을 공유하는 또한 질병 모델링 3-5 많은 독특한 장점을 제공하고있다. 특히, 광학 투명성 및 회만제브라 피쉬 배아의 영원한 발전은 조직의 개체 발생 3-5의 관찰에 대한 타의 추종을 불허하는 관점을 제공합니다. 대규모 순방향 유전자 스크린의 구현은 더 많은 연구 7,8, 효율적으로 단일 실험실 9,10-에 축척에서 수행 될 수있다 대안 적 스크리닝 기법의 식별 제브라 변이주의 강력한 저장소를 생성했다. 또한 제브라 피쉬와 실험 연구는 형질 전환 방법의 발전을 촉진하고 유전 적 접근 방법 11, 12,뿐만 아니라 화학 유전학 13-15 역전되었다. 이러한 마이크로 비드의 구현과 같은 조직 조작 기술은 널리 제브라에 채용으로하고 있지만, 그럼에도 불구하고 발전하는 동안 세포 신호를 이해하기 위해 유용한 도구를 제공하지 않았다. 마이크로 비드 주입 제브라 망막 기관 형성의 프로세스를 심문 사용되고16, 17, 18 심장, 뇌 19-22, 신경 능선 (23), 그리고 24, 25 핀. 이들 및 다른 연구에서는, 비드 그라디언트 세포 이동 (27) 및 축 (28) 패터닝에 미치는 영향 신호 분자 (26)의 확산을 이해하기 위해 개발하는 동안 적용되었다. 더 최근에, 마이크로 비드는 제브라 피쉬 성인 (29)에 재생 메카니즘을 평가하기 위해 이용되어왔다. 발달 연구에서, 예를 들어, 제브라 피쉬 마이크로 비드의 작품은 가슴 지느러미 (25)의 연구를 통해 사지 형성의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고 있습니다. 제브라 피쉬의 가슴 지느러미 봉오리 마우스 (30)와 여자 (31)의 앞다리 봉오리에 동성이다. 척추 동물의 사지 꽃 봉오리가 두 가지 중요한 신호 노드가 : 편광 활동 소닉 고슴도치의 표현을 통해 전방 - 투 - 후방 축 설정 (ZPA) (쉬)와 하류 혹스 유전자 대상의 영역,및 섬유 아세포 성장 인자의 발현 (Fgfs)를 통해 사지의 말단 정체성 근위을 설정하는 역할을 사지 꽃 봉오리의 끝에 존재하는 정점 외배엽 능선 (AER). 제브라 피쉬 쉬 유전자 돌연변이, 연구자에 FGF 배어 마이크로 비드를 주입하여 척추, 다리 (25)의 세포주기와 성장에 필수적으로 진행 FGF를 식별. 이외에 위치 정체성을 확립 FGF와 쉬 신호 폭포, 정체성 (32) 전치부을 설정하는 편광 지역의 작용을 모방 할 수있는 분자로 레티노 산 (RA)에 의해 식별 병아리 사지 꽃 봉오리를 사용하는 선구적인 연구. 병아리 사지로 RA-젖은 와트 종이의 작은 스트립을 배치 관련이 실험은 자리 패터닝 (32)을 평가한다. 또한, 연구진은 마이크로 비드의 사용을 이용하는 다른 고급 연구를 수행 한, 세포 이식 및 외인성제브라 피쉬의 류마티스 관절염 치료는 류마티스 관절염은 제브라 피쉬 후뇌과 중배엽 (28) 내에서 장거리 위치 신호를 제공하는 역할을 것을 확인합니다. 그러나 현재 많은 질문은 척추 동물 개발의 여러 측면 중 FGF와 RA 등의 요인 신호의 역할에 대해 남아있다. RA의 시그널링 효과는 morphogen 역할, 예컨대 RA는 근위 신장 세포의 운명을 35-39을 입력 지정 현상 심장 (34) 및 신장 선조, ​​많은 기관 (33), 충격. 이러한 항목의 추가의 이해는 조직 조작 마이크로 비드 및 주입 기술을 사용하여 실험 연구에서 상당히 유익 할 수있다. 병아리와 같은 모델에 비해 적은 연구 제브라 피쉬, 마이크로 비드에 주입하여 수행되었지만, 수행 된 것과 매우 유익한왔다. 제브라 피쉬 배아에서 마이크로 비드 주입 기반-연구의 소수에 대한 하나의 이유는 likel입니다Y 방해가 성공적으로 조작을 수행하도록 구성 배아의 크기에 기초하여, 어려운 기술적 과제가 있다는 개념. 그러나, 제브라 피쉬 배아 마이크로 비드 주입 학습 및 연습의 기술을 이용한 육안 관찰을 통해, 따라서 발전의 메커니즘을 심문하는 수단으로 추구 될 수있다. 여기서는 조직 형성 및 세포 형태 형성에 분석의 다양한 실시에 이용 될 수 지브라 피쉬 배아 내로 마이크로 비드의 정확한 적용을 보여준다.

<table><tbody><tr><td>염화나트륨</td><td>미국 생물 분석</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>염화 칼륨</td><td>미국 생물 분석</td><td>AB01652</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>미국 생물 분석</td><td>AB00366</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마 생명 과학</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4333-20ML</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Aldrich 화학</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>에틸 3-아미노벤조에이트(트리카인)</td><td>Fluka Analytical</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리</td><td>셔터 Instruments Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>화염/갈색 마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Mo. P097</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>황산 마그네슘</td><td>시그마-알드리치</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>메틸렌 블루</td><td>시그마-알드리치</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>250ml 삼각 플라스크</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>FB-500-250</td><td></td></tr><tr><td>팔콘 디버저블 페트리 접시, 멸균</td><td>코닝</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>Saint-Gobain Chemware Microspatula</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-401-50B</td><td></td></tr><tr><td>P-1000 마이크로 피펫 팁</td><td>Fischer Scientific</td><td>2707402</td><td></td></tr><tr><td>저온 인큐베이터</td><td>Fischer Scientific</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>Dimethly Sulfoxide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435</td><td></td></tr><tr><td>Microbeads (45-106 &micro; m)</td><td>Biorad</td><td>140-1454 AG1-X8</td><td></td></tr><tr><td>마이크로비즈(45 &마이크로; m)</td> <td>Polysciences</td><td>7314</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 해부 핀셋</td><td>Roboz 수술 기구 Co.</td><td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td>텅스텐 바늘</td><td>Roboz 수술 기구 Co.</td><td>RS-6065</td><td></td></tr><tr><td>모세관 홀더</td><td>Globe Scientific Inc.&nbsp;</td><td>51674</td><td></td></tr></tbody></table>년

zebrafish의 배아에 주입 마이크로 비드

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

제브라 피쉬는 발달 생물학과 질병의 연구를위한 귀중한 유전자 모델 시스템으로 떠오르고있다. 제브라 피쉬는 인간을 포함한 척추 동물과 다른, 세포 분자, 및 생리적 과정에서 높은 보존 정도 게놈뿐만 아니라 유사성을 공유한다. 개체 발생 중 조기, 제브라 피쉬 배아 연구자들은 단순한 실체를 이용 기관 형성 역학을 가시화 할 수 있도록 광학적으로 투명하다. 마이크로 비드 주입 로컬 환경 요인의 변화를 통해 조직 조작을 가능하게하는 방법이다. 이 연구는 배아 내의 특정 공간 및 시간 지점에서 분비 된 펩티드와 같은 관심 신호 분자, 임의의 수의 효과를 분석 할 수있다. 여기, 우리는 세부 초기 제브라 피쉬의 개발 과정에서 조작하고 임플란트 구슬하는 방법에 대한 프로토콜입니다.

조작 도구의 여러 유형의 응용 연구 (도 1) 중 마이크로 비드를 처리하는데 유용하다. 또한, 작은 우물 간단한 아가 주형은 적절하고 효율적인 방법 (도 1)에서 이들 실험을 수행하는 것이 중요하다 지브라 피쉬 배아를 유지하도록 이용 될 수있다. 마이크로 비드의 주입 연구자 대상 분자를위한 조치의 특정 윈도우를 좁힐 수 있도록 공간적 위치 및 관심 시간적 단계에서 수행 될 수있다. 여기서, 하나의 마이크로 비드는 꼬리 꽃 봉오리 단계에서 제브라 피쉬 배아로 또는 somitogenesis 단계 (그림 3) 중 나중에 지점에 이식 하였다. 단독 링거액으로 세정 두 개의 다른 크기의 마이크로 비드는,이 프로토콜 데모 (도 3A, 3B 및 3C)에 사용 하였다. 어떤 복합의 부재에서이 마이크로 비드 주입소분자는 비드 주입은 제브라 피쉬 배아 (도 4)의 적절한 개발 중에 심한 형태 영향없이 달성 할 수 있음을 확인할 수 있었다. 실험자들은 배아 꼭대기 텅스텐 바늘에 의해 만들어진 구멍 구멍에 마이크로 비드를 기동하여 문제가 발생할 수 있습니다. 일단 미세 니들에 의해 배아에 배치 마이크로 비드를보다 효율적으로 처리를 달성하기 위해, 위스커 / 래시 도구가 사용될 수있다. 다른 천연 또는 합성 속눈썹 필라멘트는 (그림 1) 이용 될 수 있지만 이것은 자연적으로 고양이 또는 개 수염을 흘리다로 제작 될 수있다. 텅스텐 바늘이나 수염 도구 중 하나와 마이크로 비드의 부드러운 푸시는 마이크로 비드가 금형의 링거액에 침몰 볼 수 있습니다. 마이크로 비드를 금형에 침몰되면 그것은 필요하다면 텅스텐 바늘을 이용하여 먼 거리를 이동해야 한번 배아 꼭대기 바늘 또는 휘스커 공구로 사용하여 위치 될 수있다배아로 마이크로 비드를 명. 비드 안정적 조직에 위치하는 상태를 유지하므로 마이크로 비드 주입 성공 즉시 실체에서 시각화를 통해 계측 될 수있다. 시간이 지남에 따라 비드 위치를 평가하기 위해, 각각의 배아 샘플 라이브 타임 코스 그래피를 통해 이미지화 될 수 있거나 (도 4에 도시 된 바와 같이) 비드 위치 인한 내인성 조직을 실험의 지속 기간 동안 이동되지 않았는지 확인하기 위해 주기적으로 체크 형태 형성. 시간이 지남에 비드의 위치를​​ 이해하면 이러한 표적 조직 또는 발달 과정에서 작은 분자의 효과의 평가 결과 등의 정보를 해석 가장 중요하다. 이러한 위의 단계의 사용은 원하는 시간과 위치에 제브라 피쉬 배아에 마이크로 비드를 임베드에 적합한 환경을 제공 할 것이다. 우리의 경험에 의하면,이 마이크로 비드 주입 프로토콜의 초보 사용자는 일반적으로 기술 NE를 얻었다연습 약 한 주 후에 제브라 피쉬 배아에 마이크로 비드의 일관성 외과 이식을 수행 할 cessary. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig1.jpg" /> 그림 1. 도구 마이크로 비드 주입을 수행하는 데 사용. () 비드 주입 트레이 (왼쪽, 15cm 직경) 배아 금형과 (왼쪽)과 마이크로 비드 배양 트레이 (오른쪽, 6cm 직경). 이 작업 트레이 연구원 마이크로 비드 주입 원하는 방향으로 배아를 배치하고, 현미경 역에서 가까운 거리에 주입 준비된 마이크로 비드를 가질 수 있습니다. 마이크로 비즈는 작은 분자 및 / 또는 차량에 배양 한 후 현미경 스테이션 아래에 위치하는 비드 주입 트레이를 배치하기 전에 별도의 마이크로 비드 플레이트 (오른쪽)에 세척해야한다. (B) 미세 겸자 두 쌍은 초리를 제거하는 데 사용될마이크로 모세관 바늘 끝을 깰 각 지브라 피쉬 배아를 둘러싸고에. (C) 텅스텐 바늘은 마이크로 비드의 위치에 제브라 피쉬 배아에 매우 미세한 구멍을 위해 사용됩니다. (D) 전사 마이크로 모세관 피펫을 픽업하여 천자 부위 근처 지브라 피쉬 배아의 상부에 마이크로 비드를 위치 시키는데 사용된다. (E) 이전에 텅스텐 바늘에 의해 만들어진 배아 내 절개 사이트에 마이크로 비드의 부드러운 위치를 수 수염 / 속눈썹 도구입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig2.jpg" /> 마이크로 비드 주입 순서를도 2 회로도. (A)의 마이크로 비드 soaki와 마이크로 비드 주입 트레이원하는 세척 용액에 ng를은 실체 현미경 역에서 설정하고, 배아는 조직이 위쪽으로 향하도록 위치한다. 텅스텐 바늘을 사용하여 (B)는, 배아에 작은 절개가 아직 약간의 강제 이동에 만들어 질 수있다. 마이크로 모세관 전달 피펫을 사용하여 (C)는, 원하는 마이크로 비드는 오른쪽에있는 트레이의 마이크로 비드 인큐베이션 챔버로부터 픽업하고, 배아 작업 영역이 소재 좌측 구획하게된다. 마이크로 비드는 절개 부위 근처에 증착되어야 부드럽게 위스커 / 래시 도구를 사용하여 텅스텐 바늘에 의해 만들어진 절개 부위에 위치. 마이크로 비드가 절개 부위에 였는데되면, 안정 마이크로 비드를 배치 및 개발을 계속하기로 배아로부터 후속 이동을 방지하기 위해 (절개 거리에서) 조직으로 꿰매어한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig2large.jpg" target="_blank">P</a>임대이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig3.jpg" /> 그림 3. 마이크로 비드는 서로 다른 발달 단계에서 배아에 이식 할 수있다. () Zebrafish의 배아는 꼬리 꽃 봉오리 단계에서 트렁크에 마이크로 비드 (약 50 μm의 직경)에 이식 하였다. 24 시간 후 비드 임플란트 (HPBI)에 조사되면, 통상적으로는 배아 발달하였고 마이크로 비드 발달 시간 경과시 최소의 이동을 보여 주었다. 3 체절 스테이지 (SS)에 난황로 (약 50 ㎛의 직경) 마이크로 비드 이식 (B) Zebrafish의 배아는 시간이 지남에 따라 상대적으로 작은 구슬의 움직임 정상 발달을 표시. (C) 큰 마이크로 비드 (약 70 μm의 직경)은 유사하게 정상 이후의 개발뿐만 아니라 미니를 보여 7 SS 배아에 이식 하였다말은 이식의 사이트에서 어떤 움직임이. 경우에 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig4.jpg" /> 제브라 피쉬 배아 그림 4. 총 개발은 72 HPBI를 통해 마이크로 비드의 존재에 의해 교란이다. Zebrafish의 배아는 7 체절 스테이지 (SS)에서 (약 50 ㎛의 직경) 링거액에 담가 마이크로 비드에 이식 하였다. 각각의 마이크로 비드 수술 somites 3과 4 사이에, 트렁크에 삽입 된 비드의 존재는 24 시간 후 비드 임플란트에 명백한 발달 결함 (HPBI), 48 HPBI, 72 HPBI과 관련되지 않았습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig4large.jpg" target="_blank">를 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.</a>

제브라피쉬는 유전 및 발달 연구를 위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 비드 이식은 국소 세포 환경에 변화를 일으켜 발달 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있는 귀중한 조직 조작 기술입니다. 이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 마이크로비드 이식을 수행하는 방법을 설명합니다.

Zebrafish의 배아에 주입 마이크로 비드

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

다음 실험의 전반적인 목표는 마이크로비드 이식을 사용하여 제브라피시 배아 발생 과정 중 특정 공간적 및 시간적 지점에서 국소 조직 환경의 변화를 유도하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마이크로비드의 정밀한 조작과 이식을 용이하게 하는 비드 이식 트레이를 준비합니다. 두 번째 단계로, 제브라피시 알을 원하는 발생 단계까지 배양합니다.그런 다음 마이크로 비즈를 적절한 실험 용액에 준비하여 배아 내의 원하는 위치로 조심스럽게 옮깁니다. 결과적으로, 마이크로 비즈 이식은 제브라피시의 정상적인 발달을 방해하지 않고 수행될 수 있으며, 이를 통해 관심 분자가 제브라피시 배아 발생에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다. 이 방법은 서로 다른 분자들이 기관 형성 과정에 어떻게 영향을 미치는가와 같은 발생 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.일반적으로, 이 방법이 처음인 개인은 마이크로비즈를 다루는 숙련도를 높이기까지 연습이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 마이크로비즈 이식 트레이를 준비하려면, 먼저 새로 조제한 2% aro 용액을 90초 동안 가열하십시오. 250 milliliter 삼각 플라스크에 넣고, 젤이 넘쳐흐르지 않도록 30초마다 플라스크를 흔들어 줍니다.다음으로 60 by 15 millimeter 페트리 접시의 뚜껑을 150 by 15 millimeter 접시 안에 뚜껑의 안쪽 면이 위를 향하도록 놓습니다. 그런 다음 검지 손가락으로 작은 페트리 접시의 뚜껑을 고정합니다. 뜨거운 aros gel을 더 큰 접시에 붓습니다.응결 현상을 방지하고 agros가 식으면서 현미경으로 비드를 더 쉽게 관찰할 수 있도록, 작은 뚜껑 아래에 agros의 얇은 층이 형성되게 합니다. 하지만 젤이 응고되기 전에 웰 몰드를 젤 상단에 천천히 기울여 넣어 배아를 더 쉽게 배치할 수 있도록 합니다. 젤이 응고되면 마이크로 스패튤라를 사용하여 웰 몰드를 조심스럽게 제거하십시오.그다음 배양 접시에 E3 용액을 넣고 4 °C에서 보관하십시오. 제브라피쉬 배아를 수집하려면 교배 챔버를 시스템 워터로 채웁니다. 그다음 챔버 중앙에 구분판을 설치하고, 챔버의 각 적절한 쪽에 성체 수컷과 암컷 제브라피쉬를 넣습니다.다음 날 아침, 미세 와이어 메시 체를 사용하여 수정란을 수집합니다. 깨끗한 10 centimeter 페트리 접시 안에 체를 뒤집어 놓고, 체에 알이 남지 않을 때까지 E three를 가늘게 흘려 씻어내어 접시에 약 25 milliliters의 E three 용액이 담기게 합니다. 그 다음, 과밀 상태를 방지하기 위해 알을 접시당 50 to 60개씩 여러 개의 접시에 나누어 담고, 마이크로비드를 이식하기 전까지 28.5 degrees Celsius의 E three 용액에서 배양합니다. 이후 적절한 부피의 테스트 대상 분자 또는 대조군 용매에서 적정 시간 동안 배양합니다.그 후 배아가 원하는 발달 시점에 도달하면, 미세 핀셋을 사용하여 배아의 각막을 제거하고 여과된 링거액(ringer solution)에서 제브라피쉬를 배양합니다. 배아가 적응하는 동안 10분 동안 항생제를 첨가합니다. 마이크로 비드를 이식 트레이 내에 배치된 이전에 준비한 마이크로 비드 플레이트로 옮기고, 비드와 링거액을 10분 동안 헹굽니다.비즈 세척 후 50분 이내에, 마이크로비즈 이식 부위에 접근할 수 있도록 이식 트레이의 웰 내에 배아를 한 번에 하나씩 배열합니다. 텅스텐 바늘을 사용하여 배아에 작은 절개를 낸 다음, 마이크로 모세관 전이 피펫의 벌브를 눌러 마이크로비즈를 모세관 컬럼 안으로 부드럽게 끌어당기고, 압력을 해제하여 마이크로비즈를 이식 트레이에 전달함으로써 마이크로비즈를 더 쉽게 다룰 수 있도록 합니다. 비즈를 부드럽게 밀어 몰드 내의 링거액 속으로 가라앉힙니다.그 다음 마이크로니들을 사용하여 마이크로비드를 배아 위의 절개 부위 안으로 이동시킵니다. 마지막으로, 위스커 툴(whisker tool)을 사용하여 마이크로비드를 절개 부위에서 멀리 이동시켜, 상처가 치유되는 동안 비드가 밖으로 밀려 나오지 않도록 합니다. 마이크로비드가 조직 내에 안정적으로 위치하므로, 실체 현미경을 통해 마이크로비드 이식 성공 여부를 즉시 확인할 수 있습니다.본 실험에서는 링거 용액으로만 세척한 두 가지 서로 다른 크기의 단일 마이크로비드를 꼬리아기(tail bud) 단계의 제브라피쉬 배아 또는 근형성 과정 중의 후기 시점에 이식하여, 내생적 조직 형태 형성으로 인해 실험 기간 동안 비드의 위치가 이동하지 않도록 하였습니다. 배아 샘플은 시계열 사진 촬영을 통해 시각화하거나, 이미지에 나타난 마이크로비드 이식 상태를 주기적인 간격으로 확인할 수 있습니다. 접합된 물질이 없는 경우, SPR 제브라피쉬 배아의 정상적인 발달 과정 동안 거시적인 형태학적 영향 없이 소분자의 전달이 가능합니다.이 절차 이후, Microbead가 유전자 발현에 미치는 영향을 연구하기 위해 Whole Mount In situ hybridization과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 전반적으로, 시간에 따른 비드의 위치를 파악하는 것은 표적 조직이나 발달 과정에 대한 저분자 화합물의 효과를 평가하는 등 결과 해석에 있어 매우 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

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Zebrafish의 배아에 주입 마이크로 비드

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