Zebrafish의 배아에 주입 마이크로 비드

다음 실험의 전반적인 목표는 마이크로비드 이식을 사용하여 제브라피시 배아 발생 과정 중 특정 공간적 및 시간적 지점에서 국소 조직 환경의 변화를 유도하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마이크로비드의 정밀한 조작과 이식을 용이하게 하는 비드 이식 트레이를 준비합니다. 두 번째 단계로, 제브라피시 알을 원하는 발생 단계까지 배양합니다.

그런 다음 마이크로 비즈를 적절한 실험 용액에 준비하여 배아 내의 원하는 위치로 조심스럽게 옮깁니다. 결과적으로, 마이크로 비즈 이식은 제브라피시의 정상적인 발달을 방해하지 않고 수행될 수 있으며, 이를 통해 관심 분자가 제브라피시 배아 발생에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다. 이 방법은 서로 다른 분자들이 기관 형성 과정에 어떻게 영향을 미치는가와 같은 발생 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

일반적으로, 이 방법이 처음인 개인은 마이크로비즈를 다루는 숙련도를 높이기까지 연습이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 마이크로비즈 이식 트레이를 준비하려면, 먼저 새로 조제한 2% aro 용액을 90초 동안 가열하십시오. 250 milliliter 삼각 플라스크에 넣고, 젤이 넘쳐흐르지 않도록 30초마다 플라스크를 흔들어 줍니다.

다음으로 60 by 15 millimeter 페트리 접시의 뚜껑을 150 by 15 millimeter 접시 안에 뚜껑의 안쪽 면이 위를 향하도록 놓습니다. 그런 다음 검지 손가락으로 작은 페트리 접시의 뚜껑을 고정합니다. 뜨거운 aros gel을 더 큰 접시에 붓습니다.

응결 현상을 방지하고 agros가 식으면서 현미경으로 비드를 더 쉽게 관찰할 수 있도록, 작은 뚜껑 아래에 agros의 얇은 층이 형성되게 합니다. 하지만 젤이 응고되기 전에 웰 몰드를 젤 상단에 천천히 기울여 넣어 배아를 더 쉽게 배치할 수 있도록 합니다. 젤이 응고되면 마이크로 스패튤라를 사용하여 웰 몰드를 조심스럽게 제거하십시오.

그다음 배양 접시에 E3 용액을 넣고 4 °C에서 보관하십시오. 제브라피쉬 배아를 수집하려면 교배 챔버를 시스템 워터로 채웁니다. 그다음 챔버 중앙에 구분판을 설치하고, 챔버의 각 적절한 쪽에 성체 수컷과 암컷 제브라피쉬를 넣습니다.

다음 날 아침, 미세 와이어 메시 체를 사용하여 수정란을 수집합니다. 깨끗한 10 centimeter 페트리 접시 안에 체를 뒤집어 놓고, 체에 알이 남지 않을 때까지 E three를 가늘게 흘려 씻어내어 접시에 약 25 milliliters의 E three 용액이 담기게 합니다. 그 다음, 과밀 상태를 방지하기 위해 알을 접시당 50 to 60개씩 여러 개의 접시에 나누어 담고, 마이크로비드를 이식하기 전까지 28.5 degrees Celsius의 E three 용액에서 배양합니다. 이후 적절한 부피의 테스트 대상 분자 또는 대조군 용매에서 적정 시간 동안 배양합니다.

그 후 배아가 원하는 발달 시점에 도달하면, 미세 핀셋을 사용하여 배아의 각막을 제거하고 여과된 링거액(ringer solution)에서 제브라피쉬를 배양합니다. 배아가 적응하는 동안 10분 동안 항생제를 첨가합니다. 마이크로 비드를 이식 트레이 내에 배치된 이전에 준비한 마이크로 비드 플레이트로 옮기고, 비드와 링거액을 10분 동안 헹굽니다.

비즈 세척 후 50분 이내에, 마이크로비즈 이식 부위에 접근할 수 있도록 이식 트레이의 웰 내에 배아를 한 번에 하나씩 배열합니다. 텅스텐 바늘을 사용하여 배아에 작은 절개를 낸 다음, 마이크로 모세관 전이 피펫의 벌브를 눌러 마이크로비즈를 모세관 컬럼 안으로 부드럽게 끌어당기고, 압력을 해제하여 마이크로비즈를 이식 트레이에 전달함으로써 마이크로비즈를 더 쉽게 다룰 수 있도록 합니다. 비즈를 부드럽게 밀어 몰드 내의 링거액 속으로 가라앉힙니다.

그 다음 마이크로니들을 사용하여 마이크로비드를 배아 위의 절개 부위 안으로 이동시킵니다. 마지막으로, 위스커 툴(whisker tool)을 사용하여 마이크로비드를 절개 부위에서 멀리 이동시켜, 상처가 치유되는 동안 비드가 밖으로 밀려 나오지 않도록 합니다. 마이크로비드가 조직 내에 안정적으로 위치하므로, 실체 현미경을 통해 마이크로비드 이식 성공 여부를 즉시 확인할 수 있습니다.

본 실험에서는 링거 용액으로만 세척한 두 가지 서로 다른 크기의 단일 마이크로비드를 꼬리아기(tail bud) 단계의 제브라피쉬 배아 또는 근형성 과정 중의 후기 시점에 이식하여, 내생적 조직 형태 형성으로 인해 실험 기간 동안 비드의 위치가 이동하지 않도록 하였습니다. 배아 샘플은 시계열 사진 촬영을 통해 시각화하거나, 이미지에 나타난 마이크로비드 이식 상태를 주기적인 간격으로 확인할 수 있습니다. 접합된 물질이 없는 경우, SPR 제브라피쉬 배아의 정상적인 발달 과정 동안 거시적인 형태학적 영향 없이 소분자의 전달이 가능합니다.

이 절차 이후, Microbead가 유전자 발현에 미치는 영향을 연구하기 위해 Whole Mount In situ hybridization과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 전반적으로, 시간에 따른 비드의 위치를 파악하는 것은 표적 조직이나 발달 과정에 대한 저분자 화합물의 효과를 평가하는 등 결과 해석에 있어 매우 중요합니다.