간단하고 컴퓨터 지원 마우스에 대한 후각 테스트를

다음 실험의 전반적인 목적은 마우스의 선천적 후각 식별 능력, 후각적 선호도 또는 회피 반응, 그리고 후각 민감도를 테스트하는 것입니다. 이는 마우스를 새로운 유인제 또는 혐오제와 중성 냄새인 물에 노출시킴으로써 수행됩니다. 그동안 비디오 카메라가 행동 세션을 기록합니다.

다음으로, 제공된 매크로를 사용하여 Image J에서 비디오를 분석함으로써 냄새 및 물 파라미터에서 보낸 시간을 구합니다. 결과는 사후 컴퓨터 보조 분석을 바탕으로, 서로 다른 유전자형 간의 물과 비교한 냄새에 대한 선호 또는 회피 행동을 보여줍니다. 전용 아레나와 후각 장치를 사용하는 것보다 이 후각 테스트의 주요 장점은 익숙한 아레나를 사용하므로 설정이 간단하고 빠르게 완료할 수 있다는 점입니다.

또한, 이 절차는 저비용 하드웨어를 사용하여 진행되며, 시연은 저희 연구실의 학생인 Emmanuel Abry가 맡았습니다. 본 실험에서는 3~5개월 된 수컷 C 57 black, six 야생형 및 형질전환 마우스를 사용하십시오. 이번 시연에서는 두 가지 녹아웃 라인과 리터메이트 대조군을 사용합니다.

실험 구역으로는 3cm 두께의 베딩이 깔린 깨끗하게 멸균된 마우스 케이지를 사용하십시오. 다음으로 카메라 설정을 준비합니다. 맞춤형 삼각대 마운트를 사용하여 케이지 바닥에서 58cm 높이에 카메라를 배치하십시오.

케이지가 위치해야 할 지점을 표시하기 위해 카운터에 표시를 합니다. 중앙 이미지를 얻으려면 카메라를 약 15 fps의 320 x 240 픽셀 비디오로 기록하도록 설정하십시오. 테스트를 준비하기 위해, 가능한 경우 각 향의 농축액을 용매에 저장해 두십시오.

선호도 테스트를 위해 피넛 오일에 피넛 버터를 10% w/v 농도로 녹인 용액을 조제합니다. 회피 테스트의 경우, 98% methyl butyric acid 용액을 준비합니다. 민감도 테스트를 위해, 테스트 1~2일 전에 동일한 계통의 생쥐로부터 암컷의 소변을 수집합니다.

암컷의 배가 케이지 그리드 위로 오도록 고정한 후, 플라스틱 접시에 소변 방울을 수집합니다. 정규화를 위해 여러 마리의 암컷으로부터 샘플을 수집하십시오. 개체 간 변이를 고려하여, 모든 샘플을 1.5 milliliter 튜브에 모아 -20 °C에서 보관하십시오.

동물 순화를 시작하려면 동물을 세척된 케이지에 넣고 탐색하게 합니다. 5분 동안 테스트 케이지의 환경은 홈 케이지와 동일하게 유지해야 합니다. 각 테스트 날마다 순화 단계를 한 번씩 반복하며, 순화 기간이 끝나면 기록을 시작하고 기분 좋은 향 60 µL를 피펫으로 분주합니다.

이 경우에는 한쪽 벽면에 피넛 버터를 바르고, 반대쪽 벽면에는 동일한 양의 물을 피펫으로 떨어뜨립니다. 중성 향의 경우, 각 벽면의 약 10cm 높이에 방울을 떨어뜨려 적용합니다. 이제 동물이 2분 동안 탐색하게 한 뒤, 녹화를 중단하고 마우스를 홈 케이지로 돌려보냅니다.

테스트 대상인 각 마우스에 대해 이 과정을 반복하십시오. 항상 새로운 테스트 케이지를 사용해야 합니다. 모든 선호도 테스트를 수행한 3~5일 후에 새로운 테스트 케이지를 사용하여 회피 테스트를 실시하십시오.

각 마우스에 대해 회피 테스트를 수행합니다. 유인 테스트와 마찬가지로, 쾌적한 향을 회피 향인 2-methyl butyric acid로 교체하기만 하면 됩니다. 민감도 테스트의 경우, 동일한 마우스의 실험 반복 시 하나의 케이지를 재사용할 수 있습니다.

따라서 케이지의 수조 쪽을 표시하고, 실험 간에 70% ethanol을 적신 종이로 짧은 벽면을 세척할 준비를 하십시오. 실험 당일에는 10배 희석 계열을 사용하여 네 가지 농도의 소변 용액을 제조합니다. 회피 테스트와 마찬가지로 2차 증류수를 사용하여 각 동물을 5분 동안 테스트 케이지에 적응시킵니다.

그런 다음 각 마우스를 가장 높은 희석 배수인 1:10,000의 소변에 먼저 노출시킵니다. 녹화하는 동안 테스트 케이지에 희석된 소변을 도포하고 반대편 벽에는 물을 도포합니다. 다른 테스트와 마찬가지로 동물이 탐색하도록 둡니다.

2분 동안 유지합니다. 그 후, 동물을 깨끗한 마우스 케이지로 옮깁니다. 모든 동물이 가장 낮은 농도에 노출된 후, 모든 테스트 케이지 벽면을 세척하고 다음으로 농도가 높은 소변을 사용하여 각 마우스에 대해 테스트를 반복합니다.

순수 소변을 테스트할 때까지 이 과정을 계속하십시오. 한 실험에 대한 모든 데이터를 수집한 후, Image J에서 비디오를 열어 조정하십시오. 조정 및 처리 세부 사항은 설명된 프로토콜을 사용하여 텍스트 프로토콜에 제공되어 있습니다. 두 가지 서로 다른 녹아웃 라인.

그룹 B와 C를 베딩으로 만든 대조군인 그룹 A와 비교하였다. 등분산 또는 이분산 가정 하의 비방향성 student's T-test를 사용하여 유전자형 내에서 냄새와 물 사이에 소비한 시간을 비교하였다. 유전자형 간의 행동 비교에는 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하였다. 실험군인 그룹 B와 C 모두 유인성 냄새에 대해 선호도를 보이지 않았다. 회피 테스트에서 혐오성 2-methyl butyric acid 냄새에 대한 반응은 그룹 A와 B에서는 예상대로 나타났으나, 그룹 C는 이 냄새에 대해 회피 행동을 보이지 않았다.

감도 테스트에서, 1:1000 희석 비율일 때 선호되는 소변과 물에 머문 시간의 차이를 계산하여 유인 임계값을 구했습니다. 반면, 실험군 B와 C는 선호도를 나타내기 위해 100배 더 높은 농도가 필요했습니다. 숙련되면 이 기술은 적절하게 수행할 때 몇 시간 내에 완료할 수 있으며, 이 절차에 따라 후각 학습 및 소멸과 같은 다른 방법을 통해 후각 가소성과 학습을 조사할 수 있습니다.