Name: 마이크로 채널로 독특한 모세관 액션 뼈 같은 템플릿 대형 나폴레옹 결함의 복원에 대한 세포의 모집을 향상시킬 수 있습니다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 학습하세요 뼈 재생을 위한 마이크로채널이 설계된 뼈 유사 템플릿 제작 방법을. 폴리우레탄 스펀지를 수정하고 하이드록시아파타이트 슬러리로 코팅하여 세포 흡수 및 유지 능력을 향상시킵니다.

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템플릿으로 1. 폴리 우레탄 (PU) 스폰지 준비 <ol><li> 상호 연결 기공을 포함하는 하이드 록시 아파타이트 템플릿을 생성하기 위해 폴리 우레탄 스폰지를 사용합니다. 템플릿 스트러트의 형성뿐만 아니라 trabeculae 내의 마이크로 채널의 형성을위한 기본을 제공하는 trabeculae 각 스폰지 사용. </li><li> 잘라 길이 폭 X 1.5 cm에 X 5cm 높이 3.5 cm의 크기로 2 브리지 모양으로 (인치 당 모공) 스폰지 80 PPI 트림. 주 : 치수 및 형상이 선택 될 수있는 원하는 기본 기공 크기에있어서 100 PPI, PPI 80 및 60을 PPI. </li><li> 4 %의 100 mL로 (w / v)의 150 ㎖의 비커를 사용하여 NaOH 용액; 다음 담그고 준비 스폰지가 완전히 젖었 때까지 짠다. </li><li> 몸을 담근 후, 초음파 (42 kHz에서)에서 스폰지와 비커를 놓습니다. </li><li> 초음파 표면 특성을 수정하는 열없이 15 ~ 20 분 동안 폴리 우레탄 스폰지를 사전 처리합니다. </li><li> 증류수로 씻어5 ~ 10 분 동안 물. 세정하는 동안, 스폰지를 압착하고가 스폰지 안에 잔여의 NaOH를 제거하기 위해 5 내지 7 배 확대 할 수있다. </li><li> 여분의 물을 제거하기 위해 종이 타월과 스폰지를 짜내; 그런 다음 60 ~ 80 ℃의 오븐에서 건조한다. </li></ol> 코팅 2. 수산화 인회석 (HA) 슬러리 준비 <ol><li> HA 슬러리를하기 전에, 자기 교반 막대가 비커의 중량을 측정한다. 이 측정은, 분말 / 액체 비율을 계산하는 데 사용된다. </li><li> 나노 크기의 HA 분말 10g을 측정한다. </li><li> 50 ㎖ 비이커에 증류수 20 ㎖를 추가합니다. 120-140 ° C 및 교반은 자기 교반 가열판을 사용하는 열. </li><li> 300-400 rpm으로 교반하면서 증류수 당 분말을 폴리 비닐 알코올 (PVA) (89,000-98,000 MW) 0.3 g (w / w 3 %)를 첨가. </li><li> PVA가 완전히 용해 될 때까지 저어. PVA 용액을 완전히 용해 후 명백하다. </li><li> O십시오400-500 rpm으로 교반하면서 FF 열 및 나트륨 카르복시 메틸 셀룰로오스 (CMC) 분말 (매우 낮은 점도) 0.1 g (w / w 1 %)를 추가한다. PVA 용액을 완전히 용해 후 명백하다. </li><li> CMC가 완전히 용해 될 때까지 저어 실온까지 냉각. </li><li> 300-400 rpm으로 교반하면서 분말 당 암모늄 폴리 아크릴 레이트 분산제 0.3 g (3 % w / w)를 첨가. 완전히 용해 될 때까지 저어. </li><li> 300 ~ 400 rpm으로 교반하면서 분말 당 글리세린 0.2 G (W 2 % / W)를 추가합니다. 완전히 용해 될 때까지 저어. </li><li> 천천히 600-900 rpm으로 교반하면서 용액에 HA 분말을 분산, 5 분 동안 계속 교반. </li><li> HA 분말의 응집 임의의 분산을 위해 초음파를 사용하여 5 분 동안 초음파 처리. </li><li> 90-100 ℃에서 600-900 rpm으로 열에서 교반하면서 혼합물에 증류수를 추가로 5 ㎖를 추가한다. </li><li> ORD에서 90-100 ℃에서 600-800 rpm으로 자기 교반기를 사용하여 교반 유지ER은 수분을 증발. </li><li> 1.75에서 1.8 사이의 분말 / 액체 비율이 얻어 질 때까지 수시로 비이커 포함한 혼​​합물 전체 중량을 측정한다. </li><li> 분말 / 액체 비율을 포맷, 분말, 시약, 물, 마이너스 비이커 및 교반기 (2.1)의 중량, 및 마이너스 HA 분말을 포함한 혼​​합물 (2.14)의 합계 중량에 의해 분말의 중량을 나누어 (2.2). 참고 : 예를 들어 : (분체, 시약, 및 물을 포함하여 전체 혼합물) 49.05 g 인 경우, B (교반기는 비커) 33.5 g, 그 후 C (HA 분말) 10g이다. C / (ABC 방송) = 10 / (49.05-33.5-10) = 1.80 </li><li> 슬러리 코팅을 위해 사용하기 전에 실온까지 냉각시킵니다. </li></ol> 3. HA 코팅, 건조, 소결 <ol><li> 코트 슬러리까지 스테인레스 주걱을 사용하여 HA 코팅 슬러리 제조 PU 스폰지 균질 유리판 상 PU 스폰지에 걸쳐 분산된다. 참고 : 초과 비방를 제거한 후공예, 기공의 일부는 여전히 높기 때문에 슬러리 점도의 슬러리로 막혀 할 수있다. </li><li> 약간, 상호, 균일 성, 열린 모공을 보장 공기 압축기를 사용하여 HA 코팅 된 템플릿을 타격하기 위해. 이 프로세스 템플릿 균일 PU 스폰지의 내부 및 외부 표면 모두에 코팅되는 것을 보장한다. 주 : 균질 코팅이 달성되지 않으면, HA 코팅 된 템플릿을 소결 과정 중에 붕괴되고 낮은 기계적 강도로 인해 취급시에도 균열이있다. 또한, 균일 한 코팅은 trabeculae 내에 미세 통로를 만드는데 중요하다. </li><li> 부드러운 공기 순환과 냉각 조건에서 5 시간 (20 ~ 25 ℃로)의 최소 HA 코팅 된 템플릿을 건조. 그러나 주형의 크기에 기초하여, 건조 시간을 연장한다. 참고 : 건조 후, HA 코팅 된 템플릿은 일반적으로 각 차원에 약 8 % ~ 10 %를 축소합니다. </li><li> 건조 공정 후, HA 배치알루미나 도가니에 코팅 된 템플릿. 그리고, 고온 가열로에 배치하고 다음 단계 8 소결 프로파일을 사용한다. <ol><li> 예선 2 ℃ / 분까지 230 ° C. </li><li> 예선 1 ° C / 분까지 280 ° C. </li><li> 400 ° C를 때까지 0.5 ℃ / 분 가열한다. </li><li> 열 3 ℃ / 분까지 600 ° C. 1 시간 동안 600 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 열 5 ℃ / 분, 1230 ℃로 될 때까지. 3 시간 동안 1,230 ° C를 유지합니다. </li><li> 실온으로 냉각 5 ° C / 분. 참고 : 소결 더 약 22 % HA 코팅 스폰지 템플릿을 축소합니다 - 각 차원에서 25 %. </li></ol></li></ol> 템플릿으로 세포의 4. 수신 및 거주 <ol><li> 5 % CO 2를 함유하는 가습 분위기하에 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 항생 물질 (스트렙토 마이신 및 페니실린)이 보충 된 α-MEM으로 이루어진 비 - 골 형성 배지에서 배양 사전 골아 MC3T3 세포 . </li><li> 10 ML을 추가6- 웰 접시 내에서 단일 웰에 2 × 106 세포의 밀도로 세포 현탁액. </li><li> 6 웰 플레이트에 수직으로 3cm X 4cm X 1cm의 다리 모양의 템플릿을 놓습니다. 인접한 빈 웰에 세포 현탁액을 포함하는 플레이트에 서식하고, 다른 레그 중 하나의 다리를 놓는다. </li><li> 템플릿이 10 분 동안 세포 현탁액을 흡수 할 수 있습니다. </li><li> 그 후 원래 세포 현탁액으로 가득 차 있었다 잘 미디어의 5 ML을 추가합니다. </li><li> 칠일이 경과 할 때까지 매 2 3 일 모두 우물에서 매체를 보충. </li><li> 헤 마톡 실린 및 에오신 염색 (11)에 의해 세포 이동의 효과를 결정합니다. <ol><li> 20 ~ 30 분 동안 100 %의 EtOH에 침지하여 세포와 지지체를 수정합니다. </li><li> 1 ~ 2 분 동안 헤 마톡 실린으로 얼룩. </li><li> 두 번 1-2 분 동안 증류수로 씻어. </li><li> 다음, 70 %에 담가 95 %, 1 ~ 2 분마다 다음 100 % EtOH를 탈수. </li><li> 20 ~ 30 초 동안 에오신으로 얼룩. </li><li> 두 번 12 분 동안 증류수로 씻어. </li><li> 1-2 분마다 70 %에 침지하여 80 %, 90 % 및 100 % EtOH로 탈수. </li><li> 절편 및 이미징을위한 아크릴 수지의 발판을 포함시킵니다. </li></ol></li><li> 3- [4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일] -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT) 세포 생존력 분석법 및 라이브 / 죽은 분석 (생균 / 죽은 세포 염색 키트 MPTP)시 점 세포 생존을 결정 3 일, 7 (11). 주 : 뼈 형상 템플릿 제작 프로토콜 방식은 &quot;대표 결과&quot;세션에서 표현된다. </li></ol>

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등의 세포, 성장 인자, 영양소, 포함한 멀티 컴포넌트 템플릿은 성공적인 골 재생 및 임계 크기의 큰 골 결손의 수복 작용을 위해 필요하다. 이러한 요소 내에서 해부학 적으로 순응 생물학적 특성이 필수적이다. 생물학적 기능을 달성하기 위해, 템플릿은 생체 적합성, osteoconductivity, 기계적 완전성, 충분한 표면적, 적절한 표면 질감과 산소 및 영양을위한 전송 수단을 발휘한다. 용이하게 침투 템플릿에 (활성 모집), 템플릿 (유지)에 걸쳐 균일 한 분포, 가속 증식과 높은 생존 능력 (거주) : 세포 수준에서, 다음과 같은 기능은 대규모 골 결손의 기능 회복에 특히 중요하다. 마지막으로, 실질적인 세포 외 기질의 후속 형성 및 유전자 발현의 트리거링은 급속하게 혈관 필수 생물학적 과정에서 결정적인ND 골 형성. 합성 대체품의 많은 다른 유형은 자동 /으로 할당 할 뼈 이식 조직을 대체하기 위해 제안되어왔다. 그러나, 현재의 골격 조직 마이크로 채널 및 나노 기공을 함유하는 내부 미세 환경을 나타내지 않기 때문에 적극적 깊이 10mm보다 큰 합성 대체품으로 세포 침윤, 배포 및 inhabitance을 용이하게하지 않는다. 이들은 효율적으로 신속하고 균일 뼈 템플릿 깊숙이 마이그레이션 세포 선구 물리적 단서를 제공하지 않는다. 대신, 세포의 제한된 수동 모집 발판의 외부 및 내부 영역 사이의 불평등하게 분배 세포 집단을 만듭니다. 이는 주형의 내부 코어에 도달 세포의 초기 도전 악화뿐만 아니라 합성 대용의 타단 영양소 유동 세포 통신을 방해하지 만. 셀 D의 불균형 세포 모집 및 주거 이런 형태의비계 후 조정법과 불완전한 뼈 성장은 신체 14, 15에 이식되었습니다. 따라서, 우리는 이러한 장애를 해결하기위한 기본 물리적 큐로 모세관 작용의 개념을 도입하고있다. 우리는 충분히 적극적 BMT 깊숙이 세포를 모집 책임감 차 드래그 력 차지할 모세관 현상을 유도 BMT에 마이크로 채널을 설계했다. PU 스폰지 코팅 기술은 몇 가지 독특한 특성을 제공한다. 첫째, 자신이 미리 정의 된 템플릿 구조물에 의존 잘 제어 된 다공성 구조의 골소주 쉬운 제제를 허용 (즉, 300-400 μm의 템플릿에 대한 인치 당 세공 80). 이 조골 세포 침윤 15 기공 크기를 최적화하기위한 매우 중요하다. 둘째로, 기술은 셀 재 (11)를 초기화하는 데 중요한 역할을 차지 상호 접속 된 마이크로 채널의 구성을 가능하게. 사용자 정의 모양과 템플릿의 크기를 만드는 측면에서 우레탄 스펀지를 사용하는 경우 셋째, 거의 제한이있다. 메이커는 간단한 모양이나 복잡한 형상 심지어 계산 된 레이저 절단 가위를 사용할 수 있습니다. 이 정밀하게 제어 기술을 사용하여, 우리는 BMT를 만들었습니다. HA는 때문에 생체 적합성 및 osteoconductive 용량 (17)의 출발 물질로서 선택되었다. 이 연구에서 강조해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 온도가 너무 높아서 교반 속도가 너무 낮 으면 HA 슬러리 제조시, HA 슬러리를 비이커의 바닥 가장자리 붙어되고 건조된다. 과량의 HA 슬러리를 불어 코팅 공정 후에, 공기 압력이 너무 높은 BMT의 표면에 균열을 유도 할 수있다. 제대로 HA 과잉 슬러리를 공기 만 밖으로 비교적 낮은 공기압을 유지하는 것이 중요하다. 소결 공정의 마지막으로, 두 번째 및 세 번째 단계가장 중요한 (예선 1 ° C / min으로 280 ° C 및 열 0.5 ° C / 분까지 400 ° C까지)이다. HA가 조밀하게하면서이 온도 범위에서, 우레탄 스펀지가 완전히 타 버릴 것입니다. 이 프로토콜 밀접 따르지 않으면, BMT 붕괴 또는 소결 후에 부서진한다. 이 연구에 기술 BMT은 몇 가지 장점을 제공한다. 첫째,-간 연결 매크로 기공 (300 ~ 400 μm의)는 인간의 소주 골의 사람들을 모방하고 부드러운 골수 흐름 수 있습니다. 둘째, 템플릿은 모세관 작용을 통해 골 세포의 초기 진입을 촉진하기 위해 각 격벽 섬유주 내의 미세 채널 (25-50 μm의)로 구성된다. 템플릿이 300 μm의 기공 (주 모공)없이 마이크로 채널이 있다면, 전산 시뮬레이션 (13)를 사용하여 알 수 있듯이, 모세관 작용은 골수와 템플릿의 전체 채도에 충분하다. 특히 L을 필요로 대형 결함을 성립 것ARGE 크기 템플릿. 마이크로 미터 크기의 채널을 나타낸다 매우 효과적인 유체 흡수하고, 따라서 우리는 마이크로 채널이 연구에서 모세관 작용에 주된 책임이 될 것으로 기대. 셋째, 우리의 BMTs 전략적으로 나노 기공을 배치했다. 문학의 데이터는 세포가 나노 패턴 (18, 19)을 특히 민감 것을 나타냅니다; 따라서, 우리는 세포 부착을 증가시키는 역할을하는 마이크로 채널의 벽에 나노 기공을 예상. 소주 격막의 표면에 나노 크기의 기공 (100-400 nm의)는 앵커 세포를 고정화 허용했다. 전반적으로,이 세 가지 내부 구조의 결합 된 효과는 템플릿을 통해 강화 된 세포 동원 및 접착 결과. 그러나 프로토콜의 몇 가지 제한과 완벽한 BMT를 제조 할 수있는 중요한 단계가 있습니다. 예를 들어, 코팅 동안 균질 점성을 유지의 어려움으로 인해 제조 HA 슬러리 다량 종종있다. 또한 제작에 한계가있다때문에 코팅하는 동안 시간을 작업에 볼륨에서 5cm 3보다 큰 템플릿. 코팅 두께는 머신의 기술에 따라 변화하는 중요하다. 우리의 연구 결과는 제안이 흡수하고 기존의 alloplastic (또는 합성) 발판을 통해 잠재적 인 이점을 제공 할 것입니다 세포를 유지 할 수있는 BMT. 전향 적 연구는 뼈 - 관련 성장 인자와 함께 골 형성 및 / 또는 혈관 신생에 BMT의 이점을 확인하기 위해 고려되고있다. 따라서, 우리는 우리의 고유 한 기능을 갖춘 BMT의 발판이 큰 결함의 합성 구조와 불완전 골 재생에 충분 골수 침투의 주요 장벽을 해결할 수 있다고 주장한다. 본 연구의 궁극적 인 목표는 시간 - / 노동 집약적 골수 기질에 대한 필요성을 제거하여 임계 크기 결함 경골 뼈 재구성 및 복원 기능에 생명 공학의 현재 패러다임을 단순화하는 것이다L 세포의 분리 및 확장 프로세스. 마지막으로, 우리는 뼈의 재건을 위해 빠른 세포 흡수, 균일 한 분포 및 inhabitance을 유도 마이크로 채널 및 나노 기공과 3 차원 구조를 따르는 해부학 적으로 활용하는 것을 목표로하고 있습니다.

합성 구조체를 사용한 뼈 조직 공학의 궁극적인 목표는 구조체를 숙주 뼈에 통합하고, 숙주 세포로 구조체를 다시 채우고, 정상적인 뼈 기능을 회복하기 위해 가스 및 체액 교환을 재구성하는 것입니다. 지난 10년 동안 스캐폴드 생산을 위한 고분자 및 세라믹 생체 재료의 사용에 대한 상당한 연구가 보고되었습니다1,2. 그러나 최적의 뼈 조직 재생을 위한 이상적인 재료와 제조 기술은 아직 확인되지 않았습니다. 또한, 이러한 기술을 임상에 도입하는 데에는 전반적으로 성공적이지 못하며, 특히 큰 뼈 결손의 재건 및 복원을 위해 그러합니다. 따라서 임계 크기의 뼈 결손물을 복원하는 것은 여전히 임상적 과제1-5로 남아 있습니다. 
이상적으로, 뼈 조직 재생을 위한 골격은 염증 반응이나 이물질/독성 반응을 일으키지 않고 생체 적합성을 나타내야 하고, 천연 뼈와 비교할 때 기계적 특성이 밀접하게 일치해야 하며, 이온 및 영양소의 확산 및/또는 운반을 허용하는 메커니즘을 가지고 있어야 합니다. 숙주 뼈와의 강력한 결합, 역동적인 뼈 성장, 혈관 성장 및 골격의 생분해도 똑같이 바람직합니다. 생분해성 고분자 골격의 사용은 조직 성장 측면에서 진전을 보였지만 뼈 재생에 사용하는 것에 대해서는 논란이 있습니다. 
이러한 광범위한 노력에도 불구하고, 고도로 조직화된 구조적 합성 구조체는 여전히 수동 세포 침투의 장애물을 극복하는 데 제한된 잠재력을 가지고 있습니다. 이러한 접근법의 대부분은 외부 표면에서 수 μm에서 수 mm의 단면을 가진 체외 조직 성장, 숙주 뼈와의 불완전한 통합, 생체 내 부분적인 뼈 재생만을 초래했습니다 6,7. 선구적인 세포는 세포 집락화가 시작되기 전에 그들을 내부로 끌어당기는 초기 힘이 부족하기 때문에 구조체 속으로 깊숙이 이동하지 않습니다. 결과적으로, 세포 집락화는 엄격하게 골격 주변에서 발생하여 주변에서 골격 중심까지 장애물이 됩니다. 따라서, 산소와 영양분이 주형의 내부 부분으로 확산되는 것이 제한된다8. 그러므로, 골격 전체에 걸친 물질의 수송 및 확산에 영향을 미치는 골격의 구조(공극 크기, 다공성, 상호 연결성 및 투과성)가 잘 분포된 세포 증식 및 분화를 달성하는 데 중요하다는 것이 분명합니다9,10. 인산칼슘은 과거에 스캐폴드 제작에 사용되었지만, 다른 프로세스와 절차로 인해 종종 다양한 아키텍처를 가진 인산칼슘 스캐폴드가 생성되었습니다. 따라서 제조 공정의 선택은 성공적인 뼈 조직 재생에 필요한 골격 구조를 지시하는 데 중요해집니다.
결론적으로, 뼈 조직 공학에는 여전히 해결해야 할 두 가지 주요 단점이 있습니다: 세포 부착 및 집락화 전에 템플릿으로의 초기 세포 모집과 템플릿 안팎으로 물질이 흐르는 품질의 품질입니다.

<table><tbody><tr><td>폴리우레탄 스펀지</td>, <td>플라스티폼,</td><td>PU-3215</td><td></td></tr>, <tr><td>수산화나트륨</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>, 167176</td><td></td></tr><tr><td>하이드록시아파타이트 분말</td>, <td>오젠</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>폴리비닐 알코올</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>, 341584</td><td></td></tr><tr><td>카르복시메틸셀룰로오스, 나트륨염</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>,</td> 360384 <td></td></tr><tr><td>암모늄, 폴리아크릴레이트</td><td>밴더빌트</td><td>다반 821A</td><td></td></tr><tr><td>글리세린</td><td>시그마-알드리치</td><td>G2289</td><td></td></tr></tbody></table>

마이크로 채널로 독특한 모세관 액션 뼈 같은 템플릿 대형 나폴레옹 결함의 복원에 대한 세포의 모집을 향상시킬 수 있습니다

Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

잘 분산 안정적으로 삽입 된 템플릿에 고정하는 활성, 번성하는 세포 집단이 없으면, 뛰어난 골 재생가 발생하지 않습니다. 종래 템플릿 깊은 템플릿 내부 세포 침윤, 배포 및 inhabitance 부족 내부 마이크로 채널 결과의 부재. 따라서, 마이크로 채널 다공성 및 균일 상호 소주 뼈 같은 템플릿 (생물 미세 템플릿, BMT)이 장애물을 해결하기 위해 개발되었다. 신규 BMT 혁신적인 개념 (모세관)에 의해 생성 및 스폰지 템플릿 코팅 기술로 제조 하였다. 간 연결 차 공극 (300 ~ 400 μm의)에 소주 뼈에 구멍, 각 trabecula 내에서 마이크로 채널 (25-70 μm의), 및 나노 기공 (100-400 nm의) 모방 : BMT는 몇 가지 구조적인 구성 요소로 이루어져 있습니다 세포를 고정 할 수 있도록 표면. 또한, BMT는 시뮬레이션이 기계적 시험 연구에 의해보고되었다인간의 소주 골 (~ 3.8 MPa의) (12)의 것과 ILAR 기계적 강도 특성. BMT는 다리 모양 (Π) 템플릿 (3cm 높이 4cm 길이)에 걸쳐 높은 흡수, 보유, 세포의 거주를 보였다. 처음이었다 세포는 즉시 셀 미디어 BMT의 모세관 작용에 의해 타 단부 ​​(10 × 거리) 동원 템플릿의 일단에 시드. 4 시간 후, 세포를 균일하게 전체 BMT를 점유하고 정상 세포의 거동을 나타냈다. 모세관 작용은 미디어 및 BMT 걸쳐 분포 (활성 마이그레이션)에 현탁 세포의 침투를 차지했다. BMT의 이러한 기능을 관찰하는 데, 우리는 BMTs 생리적 조건 하에서 외주로부터 골수 세포, 성장 인자, 영양소 흡수 것으로 예상된다. BMT는 빠른 침투, 균일 한 분포와 inhabita를 통해 현재의 한계를 해결할 수 있습니다큰 부피 템플릿에서 세포의 후부는 거대한 골격 결함을 복구합니다.

BMT의 전체 구조는 뼈 골소주 같은 내부 구조와 고유 입체 템플릿을 나타낸다. BMT는 매크로 기공, 마이크로 채널, 나노 기공을 포함하고 있습니다. 맑은 완전히 상호 연결된 매크로 기공의 구성 (320 μm의 평균 크기), 마이크로 채널들 (50 ㎛의 평균 직경), 및 나노 기공 (100 nm의 평균 크기)를 주 사형 전자 현미경으로 확인 하였다 (EVO-40; ZEISS)뿐만 아니라 마이크로 단층 촬영을 통해. 그림 1은 BMT를 만드는 단계적으로 상세한 프로토콜을 보여줍니다. 소결 공정에 PU 스폰지 (P1 - P7;도 1)의 제조에서의 정확한 제어 프로토콜을 통해, 다음의 기능은 달성 될 수있다 : 매우 치밀하고 매끄러운 표면 HA 코팅 및 건조 후, 정확하게 모양과 3-D 템플릿을 크기; 소주 골 유사한 완전히 상호 연결된 기공 섬유주 네트워크; 마이크로 채널의 지혜힌 같은 Haversian 운하와 Volkmann의 운하 (그림 2 &amp; 3)로 내 뼈의 채널을 모방 각 trabecula. 또한, 상대적으로 높은 기계적 강도 (~ 3.8 MPa의) 인간 뼈 골소주 유사한는 압축 강도 시험에 의해 측정 하였다. 소주 뼈 척추 인간의 척추의 것과 매우 유사한 조직 형태 학적 매개 변수는 마이크로 CT 분석 (12)에 의해 확인되었다. 모세관 작용의 다른 크기는 시뮬레이션 연산을 이용하여도 4에 상이한 모세관 직경을 통해 입증되었다. 이러한 시뮬레이션을 통해, 우리는 BMT 차 공극 (300-400 μm의) 및 직경에 기초하여 마이크로 채널 (25-70 μm의) 내의 다양한 흡수 속도를 나타낼 것으로 예상. 작은 모세 혈관을 강하게 흡수 능력을 보였다. 도 5에 도시 된 바와 같이,이 가정은이 실험에서 확인되었다. 골수 이식은 매우 효과적인 전시미세 채널 구조의 모세관 작용을 통해 유체를 흡수 및 보유; stevenel의 청색 염색 용이 플로우 (도 5)를 추적하는 유체 매체로서 사용 하였다. 계산 시뮬레이션에 기초하여, 이러한 구성으로 BMT 흡수하고 10 초 이내의 거리에서 총 8.5 cm에 세포 현탁액을 유지하는 것으로 하였다. 때문에 내부 구조에 의한 강한 모세관, 염색 배지 3cm (높이)의 대향 단부에 도달 4cm (길이)이 1 분 40 초 이내에 1cm (폭) 브리지 형상 템플릿 X X. 또한, BMT에 활성 셀 동원과 통합 (그림 6)이 관찰되었다. 그 후, 균일 한 세포의 동원과 첨부 파일이 고르게 분포 형성에 향상된 증식과 매트릭스 형성의 결과. BMT이 세포 현탁액으로 포화 된 후 또한 BMT 통해 세포의 장거리 (~ 10cm) 이동은 즉시 검증 하였다. 괜찮다<html> eded 세포를 공기에 노출하고 배양 배지에 침지되지 않은 템플릿 세그먼트 살아 남았다. 이 실험에서는, 배양 배지는 지지체의 다리를 만지고 웰에 의해 독점적으로 세포에 제공 하였다. 마이크로 의해 나타나는 모세관 작용은 지지체의 상부 다리 부에 도달하는 새로운 배지에 허용. 문화 3 일 후, 템플릿은 빠르게 증식 세포를 점령되었다. 문화 7 일 후, 각 trabecula는 세포 외 매트릭스 래핑 된 세포 (13)와 임베디드. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig1.jpg" /> 도 1 P7은 양호한 기계적 강도를 달성하는데 중요하다 후에 정확한 소결 프로파일을 유지하는 최종 열처리 (P7)에 PU 스폰지 (P1)의 전처리에서 전체적인 뼈 형상 템플릿 제작 프로토콜..F = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig1large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig2.jpg" /> . 그림 2 대표 스테레오 현미경, 80 PPI의 (AmScope SM-2TZ-M) 이미지 (4 개)는 폴리 우레탄 스폰지 (왼쪽), HA 코팅 및 BMT (가운데), 소결 BMT (오른쪽) 건조 크기 (크기 : 3. 길이 x 폭 1cm)에 높이 x 4cm의 CM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig3.jpg" /> 생물 서식 그림 3. SEM 마이크로 CT 영상 (A) 생물 서식의 전체 이미지, <st<html> 룽&gt; 마이크로 채널 (B, C, D) 이미지. trabeculae 분명 마이크로 채널을 강조하기 위해, 템플릿은 입자 화했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig4.jpg" /> .도 상이한 채널 직경 모세관 4. 전산 계산 같은 기간 (0.4 MS), 큰 모세관 동안 이내에서 0.16 mm까지 매체 (블루)를 흡수 (D = 300 μm의 기본 기공을 지칭) 높이가 가장 작은 모세관 : 높이 0.415 mm까지 매체를 흡수 (D = 30 μm의 마이크로 채널을 의미한다). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> NT &quot;FO : 유지 - together.within 페이지 =&quot;항상 &quot;&gt; <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig5.jpg" /> 470 μm의 80 PPI ≈ 320 μm의 100 PPI의 ≈ ≈ 60 PPI :도 5 이미지는 기본 기공 및 마이크로 채널 (차 공극 크기가 평균 직경을 지칭의 다른 크기에 기초하여 모세관 작용의 흡수 능력의 차이를 보여 주었다 )이 200㎛이. 황색 라인 프라이 기공 및 마이크로 채널의 조합에 의해 유도 된 모세관 작용을 나타낸다. 적색 선은 각 trabecula 전시 주로 미세 채널에 의해 유도 된 모세관 작용을 나타낸다. (F)에 도시 된 바와 같이, 템플릿 (100) PPI는 39 초 이내에 템플릿의 완전한 포화 결과 강한 모세관 작용을 유도. 80 PPI 60 PPI 템플릿은 후 시험 하였다. (B) 0 초, (C) 0.5 초, (D) 1.5 초, (E) 17.0 초, (F) 39.0 초, (G) 50.0 초, 및 (H) 1 분 침지 후 18 초. (템플릿 차원 : 1CM X 1cm X 높이 입방에 4cm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig6.jpg" /> 그림 6. 초기 시드 세포가 시드 화 다리의 끝에 도달 시드 우물 모세관 작용에 의해 유도 된 생물 서식을 통해 시드 화 우물 (부품 V)에 (1 부).에서 수신 및 세포의 이민 (부품 V) 직후 전체 채도. 3일 후, 세포의 합류는 템플릿 전체에 걸쳐 분명했다. 후 7 일, 시공간 콜라겐 매트릭스 형성은 세포 집단 (H &amp; E 염색) 내에서 발생 하였다. (템플릿 치수 : 높이 길이 폭 X 1cm의 X 4cm에서 3cm가). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig6large.jpg" target="_blank">카스티하세요</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 ICK.

엔지니어링된 마이크로 채널이 있는 뼈대와 같은 템플릿을 만드는 단계별 일반 프로세스가 제공됩니다. 템플릿의 높은 흡수 및 유지 능력은 마이크로 채널을 통한 모세관 작용으로 입증됩니다.

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

본 절차의 전체적인 목적은 소실되거나 손상된 뼈를 복구할 수 있는 골 템플릿 미세환경을 조성하는 것입니다. 이는 먼저 폴리우레탄 스펀지를 결손 부위에 맞게 성형 및 수정함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 점성이 있는 하이드록시아파타이트 슬러리로 폴리우레탄 스펀지를 고르게 코팅한 후 건조시키는 것입니다.마지막 단계는 고온 근육 가마(muscle furnace) 내에서 하이드록시아파타이트 코팅을 중앙에 배치하는 것입니다. 최종적으로 높은 세포 흡수 및 유지 능력을 갖춘, 정밀하게 설계된 미세 채널이 포함된 뼈 유사 템플릿이 제작됩니다. 염 침출(salt leaching)이나 3D 프린팅 기술과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 유도된 모세관 현상으로 인해 미세 채널의 설계가 가능하다는 점입니다.이 방법은 두개악안면 및 분절성 골 결손의 재건과 같은 재생 의학 분야의 주요 과제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 영향은 선천적 기형의 치료까지 확장됩니다. 템플릿은 모양과 크기를 완전히 맞춤 설정할 수 있으며, 모세관 현상은 장거리 세포 이동을 촉진할 것입니다.이 방법은 재생 골에 대한 통찰을 제공하지만, 3D 암 세포 배양 플랫폼과 같은 다른 배양 시스템에도 적용할 수 있습니다. 먼저 인치당 80개의 기공을 가진 폴리우레탄 스펀지를 높이 3.5 centimeters, 너비 5 centimeters, 깊이 1.5 centimeters 크기의 브리지 모양으로 자릅니다. 그다음, 4% 수산화나트륨 용액 100 milliliters를 제조합니다.150 milliliter 비커를 사용합니다. 스펀지를 수산화나트륨 용액에 담그고, 스펀지가 완전히 젖을 때까지 갇혀 있는 공기를 짜내어 제거합니다. 포화되면, 스펀지가 담긴 비커를 초음파 세척기에 넣고 가열하지 않은 상태에서 42 kilohertz로 15~20분 동안 처리합니다.완료되면, 증류수로 5~10분 동안 헹구면서 스펀지를 짜내고 5~7회 팽창시켜 스펀지 내부의 잔류 수산화나트륨을 제거합니다. 페이퍼 타월로 스펀지의 과잉 수분을 제거한 후, 60~80°C의 오븐에 넣어 완전히 건조시킵니다. 하이드록시아파타이트 슬러리 제조를 시작하려면, 먼저 마그네틱 바가 들어 있는 50mL 비커의 무게를 측정합니다.다음으로, 비커에 증류수 20 milliliters를 넣습니다. 120 to 140 degrees Celsius로 설정된 핫플레이트 위에서 가열하며 마그네틱 스터러로 교반합니다. 물이 끓기 시작하면 300 to 400 RPMs로 교반하면서 폴리비닐 알코올 분말 0.3 grams를 증류수에 첨가합니다.분말이 완전히 녹아 용액이 투명해질 때까지 교반합니다. 그런 다음 가열을 중단하고, 용액이 투명해질 때까지 400~500 RPM으로 계속 교반하면서 초저점도 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스 분말 0.1g을 첨가합니다. 마찬가지로, 분말이 다 녹으면 혼합물을 실온까지 냉각합니다.다음으로, 300~400 RPM으로 교반하면서 폴리아크릴산 암모늄 분산제 0.3 grams를 첨가합니다. 완전히 용해될 때까지 교반한 후, 다시 300~400 RPM으로 교반하면서 글리세린 0.2 grams를 첨가합니다. 혼합물이 완전히 용해될 때까지 교반합니다.그런 다음 나노 크기의 하이드록시아파타이트 분말 10 g을 정밀하게 측정하여 600~900 RPM으로 교반하는 비커에 천천히 첨가합니다. 5분 동안 계속해서 교반합니다. 다음으로, 혼합물을 초음파 세척기에 넣고 5분 동안 초음파 처리하여 하이드록시아파타이트 분말의 응집물을 완전히 분산시킵니다. 그 후 600~900 RPM으로 교반하면서 증류수 5 mL를 추가로 넣고 90~100 °C로 가열하며, 마그네틱 스터러를 사용하여 600~800 RPM, 90~100 °C 조건에서 혼합물을 계속 교반합니다.수분 함량을 증발시키기 위해, 분말 대 액체 비율이 1.75에서 1.80이 될 때까지 비커와 혼합물을 포함한 전체 무게를 수시로 측정하십시오. 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로, 코팅에 사용하기 전에 슬러리를 실온까지 식히십시오. 유리판 위에서 스테인리스 스패튤라를 사용하여 준비된 폴리우레탄 스펀지에 하이드록시아파타이트 슬러리가 균일하게 분포될 때까지 도포하십시오. 그런 다음, 상호 연결성, 균일성 및 오픈 포어(open pores)를 확보하기 위해 에어 컴프레서를 사용하여 스펀지를 가볍게 불어내십시오.균일한 코팅이 이루어지지 않으면, ING 과정 중에 하이드로겔이 코팅된 템플릿이 붕괴될 수 있으며, 낮은 기계적 제약으로 인해 취급 중에 균열이 발생할 수도 있습니다. 또한, 균일한 코팅은 내부의 미세 채널을 정밀하게 생성하는 데 매우 중요합니다. HA가 코팅된 템플릿을 부드러운 공기 순환이 되는 20 to 25 °C 환경에서 최소 5시간 동안 건조하십시오.템플릿의 크기가 더 큰 경우 이 시간을 늘리십시오. 건조 과정 후, HA가 코팅된 템플릿을 Illumina 도가니에 넣습니다. 그런 다음 이를 고온 전기로에 넣고 첨부된 텍스트 프로토콜에 설명된 8단계 센터링 프로파일을 따르십시오.6-well plate의 단일 웰에 10^6 cells 농도의 전골세포 mc3t3 cells 10 milliliters를 첨가합니다. 그런 다음 3 cm x 4 cm x 1 cm 크기의 브리지 형태 템플릿을 6-well plate에 수직으로 배치합니다. 템플릿의 한쪽 다리는 세포 현탁액이 들어 있는 웰에, 다른 쪽 다리는 인접한 빈 웰에 넣습니다.생물안전작업대 내에서 템플릿이 세포 현탁액을 10분 동안 흡수하도록 둡니다. 그 다음, 처음에 세포 현탁액을 채웠던 웰에 배지 5 mL를 추가로 넣습니다. 5분이 더 지난 후, 처음에 세포 현탁액을 채우지 않았던 다른 웰에 배지 5 mL를 넣습니다.그런 다음 장치를 인큐베이터에 넣습니다. 7일 동안 이틀에 한 번씩 배지를 교체합니다. 실험이 끝나면, 100% ethanol이 채워진 비커에 담가 세포와 스캐폴드를 20~30분 동안 고정합니다.헹군 스캐폴드를 헤마토실린 염색액으로 1~2분 동안 염색합니다. 그다지 스캐폴드를 증류수가 담긴 비커에 두 번 담가 1~2분 동안 다시 헹군 후, 스캐폴드를 70% ethanol에 1~2분 동안 담가 세포 내 스캐폴드를 탈수시킵니다. 이어서 스캐폴드를 95% ethanol로 옮겨 1~2분 동안 추가로 처리합니다.마지막으로, 스캐폴드를 100% ethanol에 2분 동안 담급니다. 다음으로, 구조물을 e, s 및 Y로 1~2분 동안 대조 염색합니다. 그런 다음 스캐폴드를 증류수가 담긴 비커에 두 번 다시 담가 1~2분 동안 헹굽니다.세척 후, 레진 포매 전 단계별 농도의 에탄올 시리즈에 담가 스캐폴드를 탈수시킵니다. 마지막으로, 절편 제작 및 이미징을 위해 스캐폴드를 아크릴 레진에 포매합니다. 다양한 제작 단계를 통해 보여지는 여기 생체 모방 미세환경 템플릿은 해면골과 유사한, 완전히 서로 연결된 다공성 소주 네트워크로 구성되어 있습니다.이 템플릿은 지름 300~400 µm의 상호 연결된 1차 기공, 지름 25~70 µm의 미세 채널, 그리고 세포가 부착될 수 있도록 표면에 형성된 지름 100~400 nm의 나노 기공을 포함한 여러 구조적 구성 요소로 이루어져 있습니다. 생체 유래 미세환경 템플릿은 모세관 현상을 통해 스캐폴드의 모든 영역에 세포가 파종될 수 있도록 지원합니다. 완전히 포화된 직후, 스캐폴드를 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin)으로 염색하고 절편화하면 세포 분포를 명확하게 확인할 수 있습니다.배양 3일 후 템플릿의 각 영역에 있는 세포 수를 정량화하고 추적하였습니다. 배양 7일 후에는 빠르게 증식하는 세포들이 템플릿을 채웠으며, 각 소주(trabecula)는 세포외 기질로 둘러싸이고 세포들이 그 안에 매립되었습니다. 숙련된 경우, 이 기술은 적절히 수행된다면 3일 만에 완료될 수 있습니다.이 절차를 수행할 때는 분말과 물의 정확한 비율을 유지하고, 절차에 따라 균질한 코팅 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 세포 반응과 관련된 추가적인 질문을 해결하기 위해 동적 로킹 시스템(dynamic rocking system)이나 회전 배양 시스템(spinning culture system)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

distinctive-capillary-action-micro-channels-bone-like-templates-can

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

인간 perivascular 줄기 세포는 (PSCs) mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)와 유사한 골격 조직 재생을위한 소설 줄기 세포 클래스입니다. PSCs는 표준 지방 흡입 절차 동안 조달 지방 조직에서 FACS (형광 활성 세포 분류)에 의해 격리 수 있습니다 다음, 뼈 형성을 달성하기 osteoinductive 비계와...

뼈 재생을위한 인적 Perivascular 줄기 세포의 이용

이 프로토콜은의 고립을 설명 지방 - 파생 lipoaspirate과 골격 재생을 평가하는 4mm 중요한 크기 calvarial 결함의 생성의 stromal 세포를.

Lipoaspirate에서 수확 지방 - 파생 Stromal 셀을 사용하여 임계 크기 Calvarial 결함 모델의 수리

골전도성과 생체 활성을 나타내면서 두개-악안면(CMF) 뼈 결점에 맞을 수 있는 골격이 관심 대상입니다. 이 프로토콜은 융합염 템플릿을 사용하고 생체 활성 폴리도파민 코팅을 적용하기 위해 용매 주조 미립자 침출(SCPL) 방법을 사용하여 폴리카프로락톤 디아크릴레이트(PCL-DA)를 기반으로 하는 형상 기억 스캐폴드를 준비하는 방법을 설명합니다.

생리 활성, PCL 기반 &quot;셀프 피팅&quot;형상 기억 폴리머 비계의 제작

자가 및 동종 골 이식의 주입은 주요 두개 안면 뼈 손실을 치료하는 방법을 받아 구성한다. 그러나 혈관 신생, 세포 분화 및 골 형성 간의 상호 작용에 그래프트 조성물의 효과는 불분명하다. 우리는 이식 근접에서 혈관 신생 골 형성의 상호 의존성을 규명하는 것을 목표로 멀티 모달 이미징 프로토콜을 제시한다.

컴퓨터 단층 촬영 및 골 형성 - 혈관 신생 커플 링의 광학 이미징 두개골 뼈자가 이식과 동종 이식 통합을 평가하기 위해

지방 유래 기질 세포는 환자 자신의 세포에서 새로운 조직을 엔지니어링하는 데 유용할 수 있습니다. 우리는 골형성 잠재력이 증가된 인간 지방 유래 기질 세포(ASC)의 하위 집단을 분리하기 위한 프로토콜을 제시한 다음 in vivo calvarial healing assay에서 세포를 적용합니다.

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여기, 선물이 혈관 형성에서 vivo에서 시각화 하는 프로토콜에 multiphoton 현미경 검사 법에 의해 3 차원 건설 기계에서 실시간. 유전자 변형된 건설 기계에서 신생 murine calvarial 중요 한 뼈 결함 모델에서 연구 했다. 더 많은 새로운 혈관 컨트롤에서 보다 처리 그룹에서 발견 했다.

Calvarial 중요 한 뼈 결함 수리 다 현미경 Vivo에서 유전자 변형 3D-PLGA/nHAp 비 계에 의해 신생 시각화

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이 연구에서는 식물 기반 생체 재료의 탈세포화, 물리적 특성화, 이미징 및 생체 내 이식 방법과 스캐폴드의 세포 파종 및 분화 방법을 자세히 설명합니다. 설명된 방법을 통해 뼈 조직 공학 응용 분야를 위한 식물 기반 생체 재료를 평가할 수 있습니다.

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중간엽 줄기세포에서 생산된 인공 연골 조직을 이식하여 내연골 골화를 통한 뼈 치료는 기존 치료법의 단점을 우회할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 히알루론산 하이드로겔은 균일하게 분화된 연골 이식편을 확대하고 생체 내에서 융합된 이식편 사이에 혈관을 형성하여 통합된 뼈를 만드는 데 효과적입니다.

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Ex vivo 모델에서 조직 광물화의 포괄적인 특성 분석

우리는 다양한 계층적 수준에서 뼈 재생을 평가하는 프로토콜을 제안합니다. 이 다중 모달 접근법은 다양한 길이 척도에서 구조 분석을 가능하게 하여 시료 준비의 문제를 효과적으로 해결합니다. 또한 생체 재료가 뼈 재생을 촉진하는 효과를 평가하는 신뢰할 수 있는 워크플로우를 제공합니다.

골 재생 및 스캐폴드 성능 평가를 위한 다중 모드 접근법

학습하세요 뼈 재생을 위한 마이크로채널이 설계된 뼈 유사 템플릿 제작 방법을. 폴리우레탄 스펀지를 수정하고 하이드록시아파타이트 슬러리로 코팅하여 세포 흡수 및 유지 능력을 향상시킵니다.

마이크로 채널로 독특한 모세관 액션 뼈 같은 템플릿 대형 나폴레옹 결함의 복원에 대한 세포의 모집을 향상시킬 수 있습니다

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