평면 그라데이션 확산 시스템은 3D 콜라겐 매트릭스에 화성을 조사하기 위해

이 절차의 전반적인 목표는 3D 콜라겐 매트릭스에서 화학율을 조사하기 위해 평면 구배 확산 챔버를 만드는 것입니다. 이는 먼저 살아있는 세포 이미징 챔버를 사용하여 3D 실리콘 몰드를 제작하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 친수성 및 소수성 커버 슬립을 만들고 이를 사용하여 3D 실리콘 몰드를 조립하는 것입니다.

다음으로, 콜라겐 세포 혼합물을 중앙 구획에 첨가하고 중합시킵니다. 마지막 단계는 배양 후 금형에서 소수성 커버 슬립을 제거하고 한 저장소에 일반 매체를 추가하고 다른 저장소에 화학 유인제가 있는 매체를 추가하는 것입니다. 궁극적으로, 컨포칼 현미경 검사는 시간 경과에 따른 세포 화학주성을 추적하고 콜라겐 매트릭스 내의 세포 움직임 변위를 시각화하는 데 사용됩니다.

boin chamber 및 micro athletics와 같은 기존 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 일회용 피펫을 사용하지 않고 간단한 확산 구배로 3D 공간에서의 마이그레이션을 조사할 수 있는 간단한 설정이 가능하다는 것입니다. 150마이크로리터의 아미노 셀린 A-P-T-M-S를 측정하고 50ml 튜브에 붓습니다. 그런 다음 두 번째 일회용 피펫으로 튜브에 30ml의 100% 에탄올을 넣고 뚜껑을 닫습니다.

완전한 혼합을 보장하기 위해 용액을 2분 동안 소용돌이치십시오. 그런 다음 유리 페트리 접시에 용액을 붓고 따로 보관하십시오. 다음으로 두 번째 페트리 접시에 15%에틸 알코올 100ml를 붓고 새 일회용 피펫을 사용하여 첫 번째 접시에 놓습니다.

30ml의 탈이온수를 측정하고 용액을 50ml 튜브에 붓습니다. 그런 다음 새 일회용 피펫을 사용하여 튜브에 1.875ml의 글루 알데히드를 추가하고 뚜껑을 닫습니다. 용액을 2분 동안 소용돌이친 다음 혼합물을 세 번째 페트리 접시에 붓습니다.

집게를 사용하여 1 22mm 원형 유리 커버 슬립을 꺼내 100% 에탄올 혼합물로 양면을 헹굽니다. 일회용 피펫을 사용하여 헹굼 유리 덮개 슬립을 아미노 셀린이 포함된 첫 번째 접시에 넣고 집게를 사용하여 용액에 5분 동안 그대로 둡니다. 유리 커버 슬립을 꺼내 100% 에탄올로 다시 헹굽니다.

그런 다음 헹군 유리 덮개를 떨어뜨리고 글루타르알데히드가 든 접시에 밀어 넣은 다음 30분 동안 따로 보관하십시오. 30분 후 유리 덮개를 제거하고 집게로 미끄러지며 탈이온수로 헹굽니다. 헹궈낸 커버 슬립을 티슈에 올려 실온에서 밤새 건조시킵니다.

소수성 커버 슬립을 준비하려면 먼저 500 밀리리터의 TTS, 100 마이크로리터의 아세트산, 19.4 밀리리터의 히엔을 50 밀리리터 튜브에 넣고 2 분 동안 와류로 가공합니다. 그런 다음 용액을 유리 페트리 접시에 붓고 깨끗한 집게를 사용하여 유리 덮개 하나를 떨어뜨리고 준비된 용액에 밀어 넣은 다음 2분 동안 그대로 두십시오. 2분 후 집게를 사용하여 유리 커버 슬립을 꺼내고 일회용 피펫을 사용하여 탈이온수로 헹구고 커버 슬립을 티슈에 놓고 실온에서 밤새 건조시킵니다.

건조된 커버 슬립을 시작해야 할 때까지 플라스틱 페트리 접시에 보관하고, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 라이브 셀 이미징 챔버를 조립합니다. 다음으로, 제조업체의 지침에 따라 실리콘 엘라스토머 용액을 혼합하여 5ml의 엘라스토머를 만듭니다. 그런 다음 일회용 실험실 주걱을 사용하여 실리콘 엘라스토머 용액을 라이브 셀 이미징 챔버 설정에 천천히 부어 곰팡이 구성 요소를 방해하지 않도록 합니다.

밤새 실내 온도를 조절할 수 있도록 금형을 안전한 장소에 보관하십시오. 다음날 아침, 집게를 사용하여 금형을 당겨 빼내고 금형에서 가공된 알루미늄 금속 큐브를 조심스럽게 꺼냅니다. 다음으로 싱크대로 이동하여 탈이온수로 금형을 헹군 다음 종이 타월에 금형을 올려 말리십시오.

건조되면 취미용 다용도 칼을 사용하여 실리콘 몰드 내부의 각 세로 끝에서 2.34mm 떨어진 슬릿 공간을 자릅니다. 사용하기 전에 실험에 필요할 때까지 곰팡이가 안전하고 건조한 장소에 유지되는지 확인하십시오. 90% 에탄올로 금형을 헹구고 탈이온수를 채운 페트리 접시에 금형을 넣어 밤새 그대로 둡니다.

다음날 아침, 금형을 종이 타월로 옮기고 금형이 건조되는 동안 자연 건조시킵니다. 고정밀 다이아몬드 스크라이빙 도구를 사용하여 사각형을 자릅니다. 친수성 덮개는 3.95mm x 5.99mm보다 약간 큰 두 개의 직사각형으로 미끄러집니다.

그런 다음 절단된 직사각형 덮개 슬립을 각각 슬롯에 밀어 넣고 실리콘 몰드로 자르고 몰드를 거꾸로 뒤집고 일회용 피펫을 사용하여 실리콘 몰드 바닥을 따라 진공 그리스를 바릅니다. 그런 다음 금형을 다시 오른쪽으로 뒤집고 금형 바닥을 원형 친수성 유리 커버 슬립에 밀어 넣습니다. 밀봉을 만들려면 15ml 튜브에 원하는 농도의 배지와 화학 유인제의 혼합물을 준비하고, 혼합물 5ml를 새 밀리리터 튜브에 피펫팅하고, 5ml의 일반 배지를 두 번째 튜브에 피펫합니다.

두 튜브를 모두 섭씨 37도로 가열된 수조로 옮깁니다. 다음으로 10 XPBS의 30 마이크로리터를 마이크로 원심분리 튜브에 피펫팅합니다. 6마이크로리터의 일반 수산화나트륨 용액을 동일한 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 15초 동안 와류로 가열합니다.

그런 다음 18마이크로리터의 황록색 형광 카르복실레이트, 변형된 마이크로스피어를 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 168.3마이크로리터의 얼음처럼 차갑게 만듭니다. 1형 쥐꼬리 콜라겐. 혼합물을 30초 동안 소용돌이

다음으로 원하는 셀 77.7 마이크로 리터를 추가합니다. 매체의 밀리리터당 6개 셀에 10을 두 번 입력하고 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 혼합합니다. 피펫 팁을 20초 동안 사용하여 콜라겐 세포 혼합물 300마이크로리터를 준비된 금형 어셈블리의 중앙 웰에 피펫으로 넣습니다.

그런 다음 금형을 일회용 페트리 접시에 놓고 20% 이산화탄소로 섭씨 37도에서 5분 동안 표준 인큐베이터로 옮깁니다.배양 기간이 끝나면 집게를 사용하여 각 커버 슬립의 상단에 클램프를 끼워 소수성 커버 슬립을 모두 제거한 다음 금형에서 위로 당겨 빼냅니다. 전체 시스템을 현미경으로 이동하고 챔버를 검사하여 콜라겐 몰드의 측면이 여전히 직선인지 확인하여 현미경 아래에 있는 시스템에서 평면 확산 구배를 허용합니다. 100마이크로리터의 세포 배지를 첫 번째 웰에 추가합니다.

다음으로, 원하는 화학 유인 물질 농도를 가진 100마이크로리터의 세포 배지를 매트릭스의 다른 쪽에 있는 웰에 추가합니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 형광으로 표지된 마이크로스피어를 참조하여 세포 이동을 추적합니다. 여기에 제시된 일련의 이미지는 밀리리터 콜라겐 겔당 1밀리그램을 통해 이동하는 반추위의 확산을 보여줍니다.

이 예는 시스템의 실제 평면 확산 구배를 표시하며, 이는 도입된 모든 화학 유인물질에서도 예상할 수 있습니다. 여기에 표시된 예에서 반추위 신호의 강도는 빨간색 사각형으로 식별된 위치에서 시간 경과에 따라 측정되었습니다. 이러한 각 위치에서의 농도는 이 그래프에 별도의 선으로 표시되며, 정상 상태에서 측정하면 겔 내 위치에 따라 선형 농도 구배가 생성됩니다.

이 관계는 다양한 콜라겐 매트릭스 농도 전반에 걸쳐 선형으로 유지되므로 이 시스템은 세포 실험에 매우 유용합니다. 이 이미지에서는 빨간색으로 표시된 호중구가 위치 기준으로 사용되는 형광 녹색 미세구가 흩어져 있는 콜라겐 매트릭스 내에 표시됩니다. 다음 세 이미지는 호중구가 화학 유인 구배를 따라 올라갈 때 호중구의 지시된 이동을 보여주며, 이는 흰색 화살표로 표시됩니다.

이 동영상을 시청한 후에는 3D 콜라겐 매트릭스에서 세포 이동을 조사하기 위해 간단한 확산 챔버를 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.