Name: 평면 그라데이션 확산 시스템은 3D 콜라겐 매트릭스에 화성을 조사하기 위해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 배우세요 3D 콜라겐 매트릭스에서 화성 이동을 연구하는 평면 그라데이션 확산 시스템 구축 방법을. 공초점 현미경을 활용한 이 기술은 세포 이동 메커니즘 이해에 활용됩니다.

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저자는 세포 실험에 대한 통찰력을 제공해 준 Jonathan Reichner 박사와 Angle Byrd 박사에게 감사를 표합니다. 미국 국립과학재단(National Science Foundation) 대학원 연구 펠로우십 프로그램(GRFP)이 이 작업을 지원했습니다.

1. 3 차원 금형 설계 및 부품 <ol><li> 곰팡이 <ol><li> 작업을 시작하기 전에, 실리콘 엘라스토머 키트 생균 촬상 챔버 22mm 유리 커버 슬립, 및 치수 10.07 mm X 3.95 mm X 5.99 mm와 가공 알루미늄 금속 큐브를 얻었다. 바닥 홀더 커버 슬립을 배치하고 공급 업체의 지시에 따라 실의 나머지 부분을 조립하여 성형 용 라이브 세포 이미징 챔버를 준비합니다. </li><li> 다음에, 집게를 사용하여, 생균 촬상 챔버 하우징의 중간과 커버 슬립 위에 가공 된 알루미늄 금속 덩어리를 배치 한 다음 방치. </li><li> 엘라스토머 5 mL로 제조자의 프로토콜에 따라 실리콘 엘라스토머 솔루션을 섞는다. </li><li> 일회용 랩 주걱을 이용하여, 생균 촬상 설정 챔버로 실리콘 엘라스토머 용액을 부어 배치 가공 된 알루미늄 금속 큐브를 이동하지 않도록 보장한다. 경화 안전한 위치 O / N에서, 실험실 벤치에 시스템을 놓습니다. </li><li> 다음날 아침, 해체라이브 세포 이미징 챔버는, 제조업체가 권장하고 집게를 사용하여 곰팡이를 잡아 당깁니다. 집게를 사용하여 조심스럽게 금형에서 가공 된 알루미늄 금속 큐브의 압축을 풉니 다. 싱크대로 가서 탈 이온수로 금형을 씻어. 건조 종이 타월에 금형을 놓습니다. </li><li> 일단 드라이, 취미 유틸리티 나이프를 사용하여, 금형을 통해 슬릿을 잘라 실리콘 몰드의 내부에, 각각의 길이 방향 끝에서 2.34 mm의 이격. 당신이 실험을 위해 시스템을 구축 할 준비가 될 때까지 안전하고 건조한 장소에 금형 숙박을 보장합니다. </li></ol></li><li> 친수성과 소수성 유리 Coverslips는 준비 <ol><li> 콜라겐 매트릭스, 표면에 부착 친수성 ​​된 커버를 만들 수 있도록 : <ol><li> 일회용 피펫을 사용하여, 3- 아미노 프로필 - 트리 메 톡시 실란 150 μL를 측정하고 50 ML 튜브에 솔루션을 붓는다. 두 번째 일회용 피펫으로 50 ㎖ 튜브에 100 % 에탄올 30 ML을 추가하고 뚜껑을 닫습니다. 완전한 혼합을 보장하는, 2 분 동안 용액을 소용돌이. 피우리의 유리 페트리 접시에 솔루션과는 별도로 설정. </li><li> 두 번째 페트리 접시에 100 % 에틸 알코올 15ml를 붓고 따로 설정 (요리 레이블을해야합니다). </li><li> 새로운 일회용 피펫을 사용하여 탈 이온수 30 ㎖를 측정하고 50 ㎖ 튜브에 용액을 붓는다. 다음으로, 글루 타르 알데히드의 1875 μl를 새로운 일회용 피펫 측정을 사용하고 동일한 50 ㎖ 튜브에 솔루션을 부어 뚜껑을 닫습니다. 완전한 혼합을 보장하는, 2 분 동안 용액을 소용돌이. 세 번째 페트리 접시에 혼합물을 붓고, 따로 설정합니다. </li><li> 집게 사용하여, 하나의 22mm 둥근 유리 커버 슬립을 꺼내 일회용 피펫을 사용하여 100 % 에탄올 혼합물 양면을 씻어. </li><li> 100 % 에탄올 용액 30 ㎖ 접시에 3- 아미노 프로필 - 트리 메 톡시 실란으로 세정 된 유리 커버 슬립을 넣고 5 분 동안 용액에 앉아 있도록. </li><li> 집게로, 유리 커버 슬립을 꺼내 일회용 피펫 100 % 에탄올 용액 다시 헹군다. </li><li> 1875로 세척 유리 커버 슬립을 드롭글루 타르 알데히드의 μL와 증류수 30 ml의 혼합물을 30 분 동안 방치. </li><li> 30 분 후, 집게로 유리 커버 슬립을 제거하고 탈 이온수로 씻어 실온에서 건조 건조 조직 O / N에 배치합니다. </li><li> 반복 coverslip에 찍기와 같은 생성 된 솔루션을 필요한만큼 커버 슬립을 위해 이동. </li></ol></li><li> 지정된 프로토콜에 의해 소수성 된 커버를 확인합니다. <ol><li> 트리 데카 - 1,1,2,2- tetrahydrooctyl 500 μL, 아세트산 100 ㎕, 2 분 50 ML 튜브와 소용돌이에 헥산 19.4 ML을 추가합니다. 유리 페트리 접시에 솔루션을 붓고 따로 설정합니다. </li><li> 깨끗한 집게 사용하여, 하나의 유리 커버 슬립을 꺼내 2 분간 준비 혼합 용액에 놓습니다. 2 분 경과 후, 집게로 유리 커버 슬립을 꺼내 실온에서 건조 건조 조직 O / N에 일회용 피펫과 장소 커버 슬립을 사용하여 탈 이온수로 씻어. 사용 할 때까지 플라스틱 페트리 접시에 보관 커버 슬립. </li><li> 반복 커버 슬립의 DIPP보내고과 같은 생성 된 용액에 필요한만큼의 이동을위한 커버 슬립. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 금형 조립 <ol><li> 일회용 피펫 화학 폐기물 용기 위에 90 %의 에틸 알코올로 린스하여 금형, 금형을 사용하기 전에. 다음, 탈 이온수 가득 페트리 접시에 금형을 배치하고 O / N 앉아 할 수 있습니다. </li><li> 금형 조립을 시작하기 전에 건조 공기에 수건에 핀셋과 장소를 사용하여 용액으로부터 금형을 가져 가라. </li><li> 주형은 공기를 건조시키는 동안, 고정밀 스크라이브 다이아몬드 공구를 사용하여 5.99 mm X 3.95 mm보다 약간 크게 두 사각형으로 사각형 친수성 ​​커버 슬립을 잘랐다. 실리콘 몰드로 잘라 슬롯에 각각의 컷 사각형 커버 슬립을 밀어 넣습니다. </li><li> 거꾸로 금형 플립과 일회용 피펫을 사용하여 실리콘 몰드 하단에 진공 그리스를 적용합니다. 다음, 다시 오른쪽을 위로 금형을 뒤집어 원형 친수성 ​​유리 커버에 금형의 바닥을 눌러도장을 만들 입술. </li><li> 일회용 장갑, 조립 형을 선택하고 일회용 페트리 접시에 다음 바이오 후드에 배치합니다. 실험이 발생하기 전에 금형을 소독하기 위해 1 시간 동안 자외선 바이오 후드 램프를 켭니다. </li></ol> 3. 콜라겐 혼합물 및 3D 매트릭스 <ol><li> 콜라겐 혼합물, 얼룩을 준비하고 표준 프로토콜 (28)에 따라 이미징 세포를 준비하기 전에. </li><li> 바이오 후드에서 표준 실험실 기술 및 프로토콜들 (29, 30)을 사용하여, 원하는 화학 유인 물질 농도에 15 ㎖의 튜브에 세포 화학 유인 물질 및 매체를 혼합한다. 피펫 5 15 ML 튜브에 특정 세포 미디어 화학 유인 물질 농도의 용액 ㎖의 가열 된 물을 욕조에 솔루션을 이동합니다. </li><li> 피펫을 사용하여, 현미경 실험에 대한 솔루션을 가열하는 가열 된 물을 욕조에 두 번째 15 ML 튜브 제자리에 바로 세포 미디어 5 ml의 압축을 풉니 다. </li><li> 배 인산염 완충액 바이오 후드, 30 μL 피펫마이크로 원심 분리기 튜브에 에드 솔루션 (PBS). 15 초 동안 동일한 마이크로 원심 분리 튜브 및 소용돌이에 1 N 수산화 나트륨 (NaOH) 6 μL를 추가한다. </li><li> 냉장고에서 콜라겐 나는 쥐의 꼬리 솔루션을 확보하고 표준 실험실 기술 및 프로토콜 29을 사용하여 바이오 후드로 이동합니다. 콜라겐은 여전히​​ 차가운 확인합니다. 같은 마이크로 원심 분리기 튜브에 콜라겐 168.3 μl를 피펫. </li><li> 다음, 같은 마이크로 원심 분리기 튜브에 피펫을 사용하여 노란색 - 녹색 형광 카르 복실 레이트 수정 마이크로의 18 μl를 추가합니다. 소용돌이 30 초에 대한 모든 솔루션을 마이크로 원심 분리기 튜브. </li><li> 마이크로 원심 분리기 튜브에 원하는 셀 미디어 세포 혼합물 (약 2 × 10 6 세포 / ㎖ 농도)의 77.7 μl를 추가하고 20 초 동안 피펫 팁을 사용하여 섞는다. 필요에 따라서, 형광 비드와 세포 생존율 테이블 (표 1)의 첨가에 적합한 맞춤형 콜라겐 혼합물을 수행하여 밀도 행렬을 변경. </li><li> 피펫 (300) &amp; #181 웰 중심으로 콜라겐 세포 혼합액의 L 준비된 몰드 어셈블리 (도 2). 일회용 페트리 접시 위에 주형을 배치하고, 5 % CO 2, 37 ℃에서 20 분 동안 표준 인큐베이터로 이동. </li><li> 인큐베이터에서 시스템을 제거하고 바이오 후드에 다시 배치합니다. 집게를 사용하여 각 coverslip에의 상단에 클램핑 멀리 금형에서 당겨에 의해 모두 소수성 커버 전표를 제거합니다. </li><li> 콜라겐 주형면이 평면 확산법 있도록 직선 여전히 보장하기 원하는 현미경과 화상 전체 시스템을 이동. </li><li> 100 μL 단일 채널 피펫을 사용하여 현미경 여전히 시스템으로 잘 # 1에 세포 미디어 100 μl를 추가합니다. 이어서, 100 ㎕의 단일 채널 피펫을 사용하여 잘 # 3에 원하는 화학 유인 물질 농도와 세포 배지 100 ㎕를 추가한다. </li><li> 즉시 모두 우물에 솔루션을 추가 한 후, 영상을 시작. </li></ol> 4. 이미징 및 확산모델링 <ol><li> 하나의 특정 농도를 계산하기위한 특정 콜라겐 밀도 확산 계수를 발견하고자하는 경우, 이하의 프로토콜을 따르 <ol><li> 대신 원하는 화학 유인 물질 농도와 세포 미디어를 생성하는 &quot;콜라겐 배합 및 3D 매트릭스&quot;위의 제목의 주어진 프로토콜을 따라 표준 계산 및 프로토콜 30을 사용하여 15 ML 튜브에 5 μm의 로다 민을합니다. </li><li> 공 촛점 이미지 시스템과 3D 콜라겐 매트릭스는 형광을 포착 아르곤 레이저 (488 nm의)을 사용하여 거꾸로 현미경에 장착. 이미지 최대 7 시간 동안 매 2 또는 3 초. </li></ol></li><li> 확산 모델링의 경우 : 아래의 수학적 모델을 사용하여, 다음과 같은 일반적인 단계를 처리 및 분석을위한 전산 소프트웨어 코드를 작성합니다. <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq1.jpg" /><ol><li> 최대 INTEN에 의해​​ 스케일링 및 정상화를위한 전산 소프트웨어로 가져 오기 이미지SITY. 모서리를 선택하는 이미지의 회색 색상 맵 이미지를 변환합니다. 중앙 우측과 중앙의 왼쪽에, 이미지의 중심 축을 따라 선택. </li><li> 연산 소프트웨어 코드를 이용하여, 진정한 강도 둘 사이의 차이와 함께 정규화 강도를 플롯. </li><li> 피팅 (농도, 시간 및 길이)에 필요한 다음, 입력 매개 변수. </li><li> 시간에 대한 농도 및 정규화 데이터를 다항식으로 X 축에 걸쳐 농도 프로파일 플롯. </li><li> 연산 소프트웨어 코드를 이용하여 확산 계수를 계산한다. </li></ol></li></ol> 5. 실험 측정 <ol><li> 다시 확산 방정식을 참조하면, 아래에 도시 된 바와 같이, 시스템 내의 임의의 위치에 특정 농도를 찾는 방정식을 다시. <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq2.jpg" /> 장소 : 일의 L = 길이전자 콜라겐 매트릭스 조사에서 X = 위치 확산 D는 = 계수 T = 경과 시간 </li><li> 화성 실험 동안, 순간 케모카인가 시스템에 추가 된 특정 시간을 기록 할 수 있도록. 세포 이동 운동이 발견되면, 공 초점 저속 기록을 기록하고, 영상 발생 가장자리에서 특정 시간 및 위치를 기록하도록 보장한다. </li><li> 데이터 분석 중에 확산 및 세포 실험 모두 콜라겐 내의 임의의 지점에서 정규화 특정 농도를 찾는 방정식으로 특정 셀에 대한 언급 경과 시간, 위치 및 확산 계수 플러그. </li></ol> TFM을 활용 6. 추적 세포 이동 <ol><li> TFM / DVC 기술은 아래의 프로토콜을 수행하여 세포 이동을 추적 할 수 : <ol><li> 잘 # 3에 원하는 화학 유인 물질의 농도를 첨가 한 후, 반전 MICR에 장착 공 초점 시스템 3D 콜라겐 매트릭스 촬상 시작할oscope는 셀이 조사를 찾을 수 있습니다. </li><li> 이동하는 세포가 발견되면, 시야의 중앙에 세포를 놓고 (Z 축에서 이미지), 압전 모터, 화상마다 1 또는 2 분을 이용한다. </li><li> 셀 구동력 발생 및 변형을 산출, TFM / DVC 프로토콜 31 다음 형광 비드의 변위를 찾는 연산 코드를 생성한다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

또는 세포없이 성공적으로 확산 실험을위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 올바르게 금형 조립을 설정하는 단계; 소수성 커버 슬립의 추출시 파손을 방지하기 위해 필요한 손재주를 현상하는 단계; 올바르게 확산 계수를 계산하기 매우 좋은 선형 시작 라인을 찾을 수 있도록; 콜라겐과 화학 유인 물질 모두의 실험적인 계산을 수정; 제대로 건조하지 않는 행렬을 보장하기 위해 라이브 세포 이미징 시스템의 사용; 및 멸균, 건강한 문화를 유지. 확산 실험을 실시하면, 확산 플롯 (도 4) 선형 확산 모델의 기존 형상과 일치하는지 확인하는 것이 필수적이다. 타행에보고 된 각 샘플에 여러 다른 위치에서 X-분석 실행, 그것은, 콜라겐의 다양한 농도의 로다 민위한 확산 계수의 평균을 산출 할 수있다<html> BLE 2. 콜라겐의 농도는 매트릭스의 다공성으로 인해 증가 감소 이러한...

화학 주성으로 공지 된 농도 구배를 향해 세포의 바람직한 움직임, 신체의 병리 생리 학적 과정에 중요한 역할을한다. 이러한 예로는 피부와 점막 상처 치유 1, 2 형태 형성, 염증 3 및 종양 성장 4,5-이다. 또한, 암세포가 모두 개인과 단체 셀 마이그레이션 전략 1-6 이주 할 수 있다는 것으로 알려져있다. 또한, 확산 불안정성 메커니즘 영양소 원을 향해 이민 따라서 넓은 영역 및 조직 7 침입 수 후 종양 바디 / 물체로부터 단일 클러스터 또는 세포의 분리를 유도하고있다. 또한, 다양한 이동 메커니즘으로 인해 부착 분자 (8)의 다른 역할로, 2 차원에서 3 차원으로 활성화 될 수 있음을 보여왔다. 따라서, 체외 분석에 생리 학적으로 관련에 이동 measureabl에서 세포 운동성을 조사하기 위해즉 간단한 방법은 세포 이동 현상 이해 9에 중요하다. 불행히도, 세포 이동을 분석하는데 어려움이 광범위한 정량 화성 분석은 일반적으로 공평한 세포 운동성 및 이동 현상 모델의 측정에 기초하고 긴 힘드는 방법을 필요로한다. 세포의 화학 주성을 조사하기 위해 과거의 실험 방법은 보이든 챔버 (10)와 아래 아가로 오스 분석 (11)를 포함한다. 그러나, 이러한 초기 분석에서, 세포 이동 실험은 시간에 관하여 움직임을 모니터하지 않았다. 더 중요한 것은, 실험에 사용 된 농도 기울기는 잘 정의되지 않은 또는 몇 시간보다 더 대한 시그널링을 유지하면서 완전히 이해했다. 또한, 초기 화성 챔버 시도는 두 가지 차원으로 세포의 이동을 제한 한 마이그레이션 (12)의 반응 속도를 모니터링하는 것을 허용하지 않았다. 보이든 챔버를 보면, 엔드 포인트 분석연구원은 시각적으로 마이그레이션을 관찰하는 것을 허용하지 것이다 직접 chemokinesis (랜덤 이동)에서 화성 (방향 이동)를 구별 할 수 없습니다. 또한, 기공의 크기와 두께의 여러 변수-차이 쉽게 재현하는 것은 매우 어렵다 챔버 막은 제 13, 14 및 케모카인에 세포 이주 반응을 은폐. 마이크로 유체의 새로운 이해와 함께, 새로운 챔버 및 마이크로 디바이스는 간질 흐름 조건 하에서 세포의 운동을 조사하기 위해 수단으로 조사 또는 15, 16 화학 주성되었다. 이 새로운 디바이스에서 새로운 셀 메트릭스 도입 및 셀 (17, 18)에 전단 응력의 ​​효과처럼, 조사했다. 불행하게도, 과거와 현재의 미세 유체 화성 챔버는 종양 세포의 침윤과 전이, 메신저 등 많은 생물학적 과정, 이후 2D 기판-중요한 후퇴로 세포 이동의 연구를 제한무네 세포 이동은, 3D 이동을 포함한다. 직접적인 관찰 챔버 - 여기서, 화학 유인 물질 용액은 세포를 포함하는 3 차원 겔과 접촉하고 또한도 19, 20를보고되었다. 이 챔버는 수평으로 서로 (21) 옆에 또는 동심 링 (22)로 결합되어, 두 개의 구획, 화학 유인 물질을 함유 한 세포를 포함하는 하나 있습니다. 이러한 시스템은 오른쪽 방향으로 지적되지만, 장기간의 화학 주성 시스템을 유지하지 않는다. 또한, 연구진은 투석 셀뿐만 아니라 정수압 23-25 ​​실시 콜라겐 샘플 트레이서 통해 분자의 확산 콜라겐 막을 통해 확산 성을 조사 하였다. 콜라겐 겔 일부 확산 실험은 자기장과 화학 결합 (26)을 이용하여 겔의 물리적 및 화학적 변형에 의존한다. COLLA에 확산 모델링을위한 인기있는 방법genous 조직 연속 포인트 광표백의 형광 이미징을 사용합니다. 이 방법은 중심의 콜라겐 조직에서 거대 분자의 확산 계수의 이방성을 밝혔다. 그러나, 광표백은 관절 연골에서 사용되지 행렬 콜라겐되었다. 유사하지만, 필요한 모델 실험은 특히 콜라겐 겔의 확산 계수의 이해를 통해 수행되어야한다. 더 중요하게, 시스템은 셀 구동력 발생을 측정하는 방법을 이용하지 않는다. 불행히도, 대부분의 시스템은 이상적인 시스템에 대한 하나 또는 두 핵심 요소가 누락 될 것 같다 : 셀 추적, 매트릭스, 재현성 용이 비교적 간단한 셋업의 최소화를 통해 화성 인자와 확산 그라데이션 이해의 허용 상호 작용 세포 - 세포, 및 치수 정량 단위 (즉, 속도, 힘, 특정 농도)를 측정 할 수있다. Moghe 등은. </em&gt; 27 세포가 초기에 겔을 통해 분산보다는 필터 표면에 농축 된 대부분의 요구 사항을 충족하는 시스템을 제안하지만, 세포가 생성하는 힘을 측정하는 것이 곤란했다. 이 목적을 위해, 우리는 하나의 셀을 측정하는 영상 분석 기술과 결합 경과 현미경에 기초 기존 분석법, 현대 확산 실 한계를 극복 할 수있는 3D 콜라겐 매트릭스의 주 화성을 조사하는 평면 구배 확산 시스템을 제시 3D 환경에서 힘. 이 프로토콜은 서로 다른 셀에서 3D 화성을 조사하는 데 사용될 수있는 간단한 3D 확산 실을 만드는 간단하면서도 혁신적인 방법을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Dow Corning Corp</td><td>182 SIL ELAST KIT .5KG</td><td>10:1 믹스</td></tr><tr><td>라이브 셀 이미징 챔버</td><td>라이브 셀 기기</td><td>CM-B18-1</td> CMB가 있는 두 부분으로 구성된 미스터리 <td>18&nbsp; mm 라운드 커버슬립</td></tr><tr><td>22&nbsp; mm 유리 커버슬립</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>NC0180281</td><td>Neuvitro Corp. 커버 슬립 22&nbsp; mm 1.5</td></tr><tr><td>가공 알루미늄 금속 큐브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>취미 유틸리티 나이프</td><td>X-Acto</td><td>X3201</td><td></td></tr><tr><td>3-(아미노프로필) 트리메톡시실란</td><td>시그마-알드리치</td><td>281778-5ML</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00216A-10</td><td>글루타르알데히드, EM 등급, 8%</td></tr><tr><td>50ml 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>표준 바닥 모델 및 탁상용 원심분리기</td></tr><tr><td>유리 페트리 디쉬</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747A</td><td>재사용 가능한 페트리 디쉬: 완전한 (60 x 15&nbsp; mm)</td></tr><tr><td>펜치</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327-379</td><td>파인 포인트 펜치</td></tr><tr><td>커버 안경</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-105A</td><td>직사각형; 30 x 22&nbsp; 밀리미터; 두께 번호 1</td></tr><tr><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>아세트산 ACS 시약, &ge; 99.7%</td></tr><tr><td></td><td>Hexane Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td>무수, 95%</td></tr><tr><td>에틸 알코올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof, 분자생물학용</td></tr><tr><td>고정밀 다이아몬드 스크라이빙 도구</td><td>Lunzer</td><td>PV-081-3</td><td>직선 확장 팁 스크라이브, .020" (.50&nbsp; mm) 직경이 .200"(5.0&nbsp; mm) 팁 길이</td></tr><tr><td>진공 그리스</td><td>Dow Corning</td><td>14-635-5C</td><td>고진공 그리스</td></tr><tr><td>15 ml 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>15 ml 원추형 원심분리기 튜브, 소수성, 생물학적으로 불활성 표면</td></tr><tr><td>10x 인산염 완충 용액</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-500</td><td>1.37 m 염화나트륨, 0.027 m 염화칼륨 및 0.119 m 인산염 버퍼</td></tr><tr><td>1&nbsp; N 수산화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38215</td><td>수산화나트륨 콘센트레이트</td></tr><tr><td>콜라겐 I, 쥐 꼬리</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>쥐 꼬리&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-332</td><td>용량: 2.0 ml; O.D. x L: 13&nbsp; 엑스&nbsp; 40&nbsp; 밀리미터; 멸균; single-wrapped</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Carboxylate-modified microspheres</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; F-8813</td><td>카르복실레이트 변성 마이크로스피어, 0.5 &마이크로; m, 황록색 형광등(505/515), 형</td></tr>광용 2% 고체 <tr><td>Rhodamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83689</td><td>Rhodamine B</td></tr></tbody></table>

평면 그라데이션 확산 시스템은 3d 콜라겐 매트릭스에 화성을 조사하기 위해

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

세포 이동의 중요성은 인간 생명의 발달을 통해 볼 수 있습니다. 세포가 이동할 때 힘을 생성하고 이러한 힘을 주변 영역으로 전달하여 세포의 이동과 이동을 유도합니다. 세포 이동을 변경 및/또는 영향을 미칠 수 있는 메커니즘을 이해하기 위해 이러한 힘을 연구할 수 있습니다. 이론적으로 세포 이동의 기저에 있는 근본적인 메커니즘과 힘을 이해하는 것은 질병을 치료하고 세포 이식을 촉진하기 위한 효과적인 접근 방식을 약속합니다. 안타깝게도 개발된 최신 화학주성 챔버는 일반적으로 2차원(2D)으로 제한되며 복잡한 확산 구배를 가지고 있어 실험을 해석하기 어렵습니다. 이를 위해 우리는 화학주성 연구를 위한 직접 관찰 챔버를 개발했으며, 이 백서에서는 이를 통해 3D 환경에서 챔버 내 세포력과 특정 농도를 측정할 수 있는 최신 화학주성 챔버 장애물을 극복하고 세포 3D 이동을 연구할 수 있다고 설명합니다. 더욱 매력적인 이 접근 방식을 사용하면 3D 콜라겐 매트릭스를 통한 확산을 성공적으로 모델링하고 다양한 콜라겐 농도를 통한 화학유인물질의 확산 계수를 계산하는 동시에 견인력 현미경(TFM) 및 디지털 부피 상관(DVC) 분석을 위해 시스템을 단순하고 사용자 친화적으로 유지할 수 있습니다.

정확하게 세포의 이동을 평가하기 위해이 분석의 능력은 시스템의 좋은 설정에 의존한다. 따라서, 정확하게 확산 시스템 금형을 설계하고,도 1에 도시 된 바와 같이, 소수성과 친수성을 모두 커버 슬립을 배치에 상당한주의를 기울 반드시 중요하다. 시스템이 적절하게 설계하고 매우를 찾을 보장 확산 모델링 단계에서되면 시스템의 확산을 분석하기 위해,도 2에 도시 된 바와 같이 하나의 좋은 달성 할 수있는 선형 시작 라인 좋은 이미지를 형광. 성공적인 세포 주 화성 분석의 핵심은 확산 모델링 및 소프트웨어 연산으로 생성 된 코드를 통해 확산 및 특정 농도 방정식의 계수를 발견하는 일반적인 확산 방정식을 해결한다. 분석을 계산 소프트웨어로 이미지를 가져 오기 및 실행 한 후 (그림 3), 확산 계수평가 될 수있다 (표 2).도 4는 다섯 테스트 콜라겐 농도의 로다 민 ...

세포 이동은 인간의 발달과 생활에서 중요한 부분을 차지합니다. 세포 이동을 변경할 수 있는 메커니즘을 이해하기 위해 3D 콜라겐 매트릭스에서 화학주성을 조사할 수 있는 평면 구배 확산 시스템을 제시하여 기존 분석법의 최신 확산 챔버 한계를 극복할 수 있습니다.

평면 그라데이션 확산 시스템은 3D 콜라겐 매트릭스에 화성을 조사하기 위해

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

이 절차의 전반적인 목표는 3D 콜라겐 매트릭스 내에서 화학주성을 조사하기 위한 평면 구배 확산 챔버를 제작하는 것입니다. 이는 먼저 살아있는 세포 이미징 챔버를 사용하여 3D 실리콘 몰드를 제작함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 친수성 및 소수성 커버슬립을 제작하고, 이를 사용하여 3D 실리콘 몰드를 조립하는 것입니다.다음으로, 콜라겐 세포 혼합물을 중앙 구획에 넣고 중합되도록 둡니다. 마지막 단계는 배양 후 몰드에서 소수성 커버 슬립을 제거하고, 한쪽 저장조에는 일반 배지를, 다른 쪽 저장조에는 화학 유인 물질이 포함된 배지를 추가하는 것입니다. 최종적으로, 공초점 현미경을 사용하여 시간에 따른 세포 화학주성을 추적하고 콜라겐 매트릭스 내에서의 세포 이동 변위를 시각화합니다.보인 챔버(boin chamber) 및 마이크로 애슬레틱스(micro athletics)와 같은 기존 기술과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 일회용 피펫만을 사용하여 단순한 확산 구배를 통해 3D 공간에서의 이동을 조사할 수 있는 간단한 설정을 가능하게 한다는 점입니다. amino seline A-P-T-M-S 150 µL를 측정하여 50 mL 튜브에 붓습니다. 그런 다음, 두 번째 일회용 피펫을 사용하여 100% ethanol 30 mL를 튜브에 추가하고 뚜껑을 닫습니다.용액을 2분 동안 볼텍싱하여 완전히 혼합되도록 합니다. 그런 다음 용액을 유리 페트리 접시에 붓고 그대로 둡니다. 다음으로, 두 번째 페트리 접시에 100% 에틸 알코올 15 milliliters를 붓고, 새로운 일회용 피펫을 사용하여 첫 번째 접시의 내용물을 옮겨 담습니다.탈이온수 30 milliliters를 측정하여 50 milliliter 튜브에 붓습니다. 다음으로, 새로운 일회용 피펫을 사용하여 glu aldehyde 1.875 milliliters를 튜브에 넣고 뚜껑을 닫습니다. 용액을 2분 동안 볼텍싱한 후, 혼합물을 세 번째 페트리 접시에 붓습니다.포셉을 사용하여 22mm 원형 유리 커버슬립 1개를 꺼내 양면을 100% ethanol 혼합액으로 헹굽니다. 일회용 피펫을 사용하여 헹군 유리 커버슬립을 amino seline이 들어 있는 첫 번째 디쉬에 넣고, 포셉을 이용해 용액 내에서 5분 동안 둡니다. 유리 커버슬립을 꺼내어 다시 100% ethanol로 헹굽니다.그런 다음 헹군 유리 커버슬립을 glutaraldehyde가 담긴 배양 접시에 넣고 30분 동안 방치합니다. 30분 후, 핀셋으로 유리 커버슬립을 꺼내 탈이온수로 헹굽니다. 헹군 커버슬립을 티슈 위에 올려놓고 상온에서 하룻밤 동안 건조합니다.소수성 커버슬립을 준비하려면, 먼저 50 mL 튜브에 TTS 500 µL, 아세트산 100 µL, 헥산 19.4 mL를 넣고 2분 동안 볼텍싱합니다. 그 다음 용액을 유리 페트리 접시에 붓고, 깨끗한 핀셋을 사용하여 유리 커버슬립 하나를 준비된 용액에 넣은 후 2분 동안 둡니다. 2분 후 핀셋으로 유리 커버슬립을 꺼내 일회용 피펫을 사용하여 탈이온수로 헹구고, 커버슬립을 티슈 위에 올려 실온에서 하룻밤 동안 건조시킵니다.건조된 커버 슬립을 사용할 때까지 플라스틱 페트리 접시에 보관하고, 동봉된 텍스트 프로토콜에 따라 생세포 이미징 챔버를 조립하십시오. 다음으로, 제조사의 지침에 따라 실리콘 엘라스토머 용액을 혼합하여 5 mL의 엘라스토머를 만듭니다. 그런 다음 일회용 실험용 스패튤라를 사용하여 몰드 구성 요소가 흐트러지지 않도록 실리콘 엘라스토머 용액을 생세포 이미징 챔버 장치에 천천히 붓습니다.몰드를 안전한 곳에 두고 하룻밤 동안 실온에서 경화시킵니다. 다음 날 아침, 포셉을 사용하여 몰드를 꺼낸 후, 가공된 알루미늄 금속 큐브를 몰드에서 조심스럽게 추출합니다. 그 다음, 싱크대에서 탈이온수로 몰드를 헹구고, 종이 타월 위에 올려 건조시킵니다.건조 후, 호비용 커터칼을 사용하여 실리콘 몰드의 각 세로 끝부분 내부에서 2.34 millimeters 간격으로 슬롯을 절개합니다. 실험에 사용하기 전까지 몰드를 안전하고 건조한 곳에 보관하십시오. 몰드를 90% ethanol로 헹군 다음, 탈이온수가 채워진 페트리 접시에 넣고 하룻밤 동안 둡니다.다음 날 아침, 몰드를 종이 타월로 옮겨 공기 중에서 건조시킵니다. 고정밀 다이아몬드 스크라이빙 툴을 사용하여 친수성 커버 슬립을 3.95 millimeters by 5.99 millimeters보다 약간 더 큰 두 개의 직사각형 모양의 정사각형으로 절단합니다.그런 다음 절단된 직사각형 커버슬립을 실리콘 몰드에 파인 슬롯에 각각 밀어 넣고, 몰드를 뒤집은 후 일회용 피펫을 사용하여 실리콘 몰드 바닥을 따라 진공 그리스를 도포합니다. 다음으로, 몰드를 다시 정방향으로 뒤집고 몰드 바닥을 원형 친수성 유리 커버슬립 위에 눌러 고정합니다. 밀봉을 위해, 15 milliliter 튜브에 원하는 농도의 배지와 화학 유인 물질 혼합물을 준비하고, 새로운 milliliter 튜브에 혼합물 5 milliliter를, 두 번째 튜브에는 일반 배지 5 milliliter를 피펫으로 분주합니다.두 튜브를 37 °C로 가열된 항온수조로 옮깁니다. 다음으로, 마이크로 원심분리 튜브에 10 XPBS 30 µL를 피펫으로 분주합니다. 동일한 마이크로 원심분리 튜브에 1 N 수산화나트륨 용액 6 µL를 추가하고 15초 동안 볼텍싱합니다.그런 다음 마이크로 원심분리 튜브에 황록색 형광 카르복실레이트 변형 미세구체 18 µL와 얼음처럼 차가운 Type one 쥐 꼬리 콜라겐 168.3 µL를 넣습니다. 혼합물을 30초 동안 볼텍싱합니다.다음으로, 배지 내 세포 농도가 2 × 10⁶ cells/mL인 원하는 세포 77.7 µL를 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 혼합합니다. 피펫 팁을 사용하여 20초 동안 콜라겐 세포 혼합물 300 µL를 준비된 몰드 어셈블리의 중앙 웰에 피펫팅합니다.그런 다음 몰드를 일회용 페트리 접시에 놓고 표준 배양기에 넣어 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 20분 동안 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 핀셋을 사용하여 각 커버슬립의 상단을 집어 몰드에서 위로 들어 올려 소수성 커버슬립 두 개를 모두 제거합니다. 전체 시스템을 현미경으로 옮기고 챔버를 검사하여 콜라겐 몰드의 측면이 여전히 직선을 유지하고 있는지 확인함으로써, 시스템이 현미경 아래에 있는 상태에서 더 평면적인 확산 구배가 형성될 수 있도록 합니다. 첫 번째 웰에 세포 배지 100 µL를 넣습니다.다음으로, 원하는 화학 유인물질 농도가 포함된 세포 배양액 100 µL를 매트릭스 반대편 웰에 첨가합니다. 동반된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 형광 표지 마이크로스피어를 기준으로 세포 이동을 추적합니다. 여기에 제시된 일련의 이미지는 1 mg/mL 콜라겐 겔을 통해 이동하는 rumine의 확산을 보여줍니다.이 예제는 시스템의 실제 평면 확산 구배를 보여주며, 이는 도입된 모든 화학 유인 물질에서도 동일하게 나타날 것으로 기대됩니다. 여기에 제시된 예제에서는 빨간색 사각형으로 표시된 위치에서 시간에 따른 rumine 신호의 강도를 측정하였습니다. 이러한 각 위치의 농도는 이 그래프에 개별 선으로 표시되며, 정상 상태에서 측정했을 때 겔 내의 위치에 따른 선형 농도 구배를 생성합니다.이 관계는 다양한 콜라겐 매트릭스 농도 범위 전반에서 선형성을 유지하므로 세포 실험에 매우 유용합니다. 이 이미지에서 적색으로 염색된 호중구가 위치 참조점으로 사용되는 형광 녹색 마이크로스피어가 흩어져 있는 콜라겐 매트릭스 내에 나타나 있습니다. 다음 세 장의 이미지는 흰색 화살표로 표시된 화학 유인 물질 농도 구배를 따라 상향 이동하는 호중구의 방향성 이동을 보여줍니다.이 영상을 시청하고 나면, 3D 콜라겐 매트릭스 내에서의 세포 이동을 조사하기 위한 간단한 확산 챔버를 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

planar-gradient-diffusion-system-to-investigate-chemotaxis-3d

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

라이브 셀 마이그레이션 연구에 대한 현미경 챔버의 접착제 및 가용성 그라디언트의 조립 방법이 설명되어 있습니다. 엔지니어링 환경 솔루션 기울기와 antifouling 표면과 접착제 트랙을 결합하기 때문에 하나가지도 단서의 상대적 중요성을 확인할 수 있습니다.

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

세포 이동은 암과 같은 상처 치료 및 면역 반응 및 병태 생리 학적 과정으로, 생리의 과다에 관여하는 생물학적 현상이다. 3D-콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 3 차원 형상의 생리적 환경 내에서 다른 세포 유형의 이동성 특성을 분석하는 다용도 공구이다.

세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

기계적 특성 및 세포 외 매트릭스의 미세 강하게 세포의 3 차원 이동에 영향을 미칩니다. 시험 관내 방법은 개별 세포 집단 수준에서 모두 biophysically 변수 환경에서 시공간 세포 이동 동작을 연구하기 위해, 설명한다.

동심 젤 시스템은 3 차원 세포의 이동에 매트릭스 미세 환경의 생물 물리학 역할을 연구하는

콜라겐은 ECM의 핵심 구성 요소이며, 이전의 분화와 증식에 이르기까지 여러 세포 과정에 대한 중요한 단서를 제공한다. 3D 콜라겐 히드로 겔 내에 세포를 포함하는 프로토콜 및 PDMS 마이크로 채널을 사용하여 무작위 또는 정렬 된 콜라겐 매트릭스를 생성하는 더 진보 된 기술이 여기에 제공된다.

3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

카메라 화학 주성 분석 화학 주성은 매개 세포 이동 방향을 제어하는​​ 방법에 진핵 세포의 이해에 필수적이다. 1) 실시간 다중 화학 주성 분석법 고해상도 모니터링 및 2)에 동시에 화학 유인 그라데이션 시각화 및 호중구와 같은 HL60 세포의 이벤트 신호의 시공간 역학 : 여기서는 대한 구체적인 방법을 설명한다.

이미징 G의 호중구와 같은 HL60 세포에서 화성과 시그널링 이벤트 수용체가 매개 단백질 결합

이 기사에서는 전혈에서 온 칩 호중구 분리와 단일 마이크로 유체 칩의 화학 주성 테스트를 통합하여 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을 수행하는 자세한 방법을 제공합니다.

혈액 방울로부터의 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을위한 올 온칩 (all-on-chip) 방법

이 프로토콜 셀 셀 microenvironment를 유지 하면서 3 차원 설정의 마이그레이션 및 침입 기능을 계량 하는 데 사용할 수 있는 반전된 세로 침공 분석 결과를 설명 합니다. 이 분석 결과 희소 한 또는 민감한 세포에 적합 합니다.

위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜

우리는 셀과 다중 세포 소기관으로 3D 문화와 실험을 위한 장치를 구성 하는 방법을 설명 합니다. 이 장치는 정의 된 화학 유인 구배가 있는 3D 미세 환경에서 가용성 신호에 대 한 셀룰러 응답을 분석 할 수 있습니다. 유기 체는 약한 시끄러운 입력의 검출에 단일 세포 보다 낫다.

화학 유인 그라데이션에 대 한 다중 세포 반응의 3D 분석

여기서는 3D 매트릭스에서 축산이 자라는 동작을 분석하여 자연 발달을 모방하는 방법을 제공합니다.

신경계 발달 중 축산 성장과 행동을 분석하는 3-D 콜라겐 기반 하이드로겔 생성

개발에 집단 세포 이동, 상처 치유, 그리고 암 전이 종종 성장 인자 또는 신호 분자의 그라데이션에 의해 유도. 여기에 설명된 견인 현미경과 미세 유체 시스템을 결합한 실험 시스템과 생화학 구이도하에서 집단 이동의 역학을 정량화하는 방법에 대한 데모입니다.

화학적 집단 이동을 위한 미세 유체와 통합된 견인 현미경 검사법

여기에서 우리는 화학 전술 보완 C5a 구배를 이미지 마우스 상주 복막 대식세포에 시간 경과, 위상 대조 현미경 검사법을 사용하여 방법을 설명합니다. 프로토콜은 그밖 면역 세포로 확장될 수 있습니다.

마우스 대식세포 화학의 시간 경과 화상 진찰

배우세요 3D 콜라겐 매트릭스에서 화성 이동을 연구하는 평면 그라데이션 확산 시스템 구축 방법을. 공초점 현미경을 활용한 이 기술은 세포 이동 메커니즘 이해에 활용됩니다.

평면 그라데이션 확산 시스템은 3D 콜라겐 매트릭스에 화성을 조사하기 위해

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