Name: 철 산화물 나노 입자와 기능화 자기 세균 Nanocellulose의 제작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 배우세요 철 산화물 나노입자를 이용해 G. xylinus로 세균성 나노셀룰로스를 합성하고 자기 기능화하는 방법을. 이 기술은 혈관 재건 및 뇌동맥류 최소침습 치료에 활용됩니다.

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이 작업은 계약 번호 W81XWH-11-2-0067에 따라 국방부에서 자금을 지원했습니다.

세균 Nanocellulose 1. 준비 (BNC) 주 : 달리 지시되지 않는 한 모든 단계는 무균 조건 하에서 수행된다. <ol><li> 문화 매체를 준비합니다. <ol><li> 효모 추출물 25 g, 펩톤 15 g, 만니톨 125.0 g 및 고순도 물 500㎖를 결합하여 액체 배지 500㎖의 준비. 4 ℃에서 20 분 및 저장을위한 120 ° C에서이 혼합물을 압력솥. </li><li> 효모 추출물 5.0 g, 펩톤 3.0 g, 만니톨 25.0 g 및 고순도 물 100ml에 한천 15 g을 첨가하여 반고체 매체 100㎖를 준비. 20 분 동안 120 ℃에서 상기 혼합물을 오토 클레이브. 일단 90mm X 16mm 플라스틱 페트리 접시에 예금 혼합물을 5 ml를 멸균. 더 사용할 때까지이 온도에서 4 ° C에서 젤에 솔루션 및 저장을 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> G.을 재수 xylinus 변형 액체 배지 1 ㎖를 첨가하고, 피펫 팅하여 최대 동결 건조 바이알에 보존아래로 제조업체의 지침에 의해 표시. </li><li> 접종 루프를 사용하여 세균 현탁액의 작은 방울 반고체 미디어를 포함하는 배양 접시에 접종. 접종은 접시의 중앙에 가장자리에서 지그재그 방향으로 루프를 이동하여 전체 페트리 접시를 다루고 있는지 확인합니다. </li><li> CO 2없이 배양기에서 72 시간 동안 26 ° C에서 배양 접시를 품어. 배양 기간이 완료되면, 작은 흰색 콜로니를 볼 수 있습니다. 식민지 즉시 사용하지 않을 경우, 파라 필름으로 뚜껑을 밀봉하고 거꾸로 요리를 배치하여 4 ℃에서 페트리 접시를 저장합니다. 콜로니 최대 6 개월 동안 그 방법에 저장 될 수있다. </li><li> 전송 24- 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 상기 (1.1.1)에서 제조 된 배양액 2 ㎖. 단계에서 접종 배양 접시에서 접종 바늘 (1.3) 두 개의 식민지를 가지고 조직 배양 판의 첫 ​​우물에 배치합니다. 아르 자형나머지 23 웰에 대해 동일한 절차를 EPEAT. </li><li> 7 일간 30 ℃에서 조직 배양 플레이트를 인큐베이션. 도 1에 도시 된 바와 같이이 16mm 직경 약 2-3mm의 직경, 두께 24 BNC 펠리클의 합계를 산출한다. 주 : 판을 흔들어 예를 들어, 배양 기간 중 어느 시점에서 세균 배양을 방해하지 마십시오. 잠복기, G. 중 xylinus 정적 배양 조건 하에서 형상 플라스크의 크기를 채용 공기 - 액체 계면에서 중합체 성 망을 형성하는 글루 코피 라노스 당 분자를 압출한다. 세균 nanocellulose (BNC)로 알려진이 고분자 매트릭스는 잠복기의 끝에서 눈에 띄는입니다. </li><li> 성장 배지에서 BNC의 펠리클 모아서 G. 모든 흔적을 제거하기 위해 50 ℃에서 1 시간 동안 1 % NaOH 용액 200㎖에 이들을 살균 xylinus. 선택적으로, 자기 막대를 사용하여 300 rpm에서이 솔루션을 저어및 교반 판. NaOH 용액을 버리고 새로 제조 1 % NaOH 용액 200 ㎖를 추가합니다. 번 같은 과정을 반복하거나 솔루션에서 BNC의 펠리클 때까지 반투명 모양을 취득한다. </li><li> 물에 세 번 BNC의 펠리클을 씻어 RT에서 고순도의 물을 저장할 수 있습니다. 의 BNC 펠리클 완전히 물에 잠긴 것으로, 어떤 시간에 건조 할 수 없습니다 있는지 확인하십시오. </li><li> 20 분 동안 121 ° C에서 BNC의 펠리클을 압력솥. 참고 : Märtson 및 동료에 의해 ​​수행 된 쥐의 생체 피하 연구 60 주 주입 후 BNC의 비 저하의 징후를 보였다. 사실, BNC는 포유 동물에서 결석 미생물 및 곰팡이 효소에 의해 자연 분해입니다. 한편, BNC의 생분해 기계, 화학 및 생체 내 (4)의 마이크로 피 브릴 네트워크 약화 생물학적 과정의 결과 일 수있다. </li></ol> 2. 합성 고분자 코팅철 산화물 나노 입자와 세균 Nanocellulose 막에있는 그것의 증착 <ol><li> 버블 물에 용해 된 산소를 제거하고 질소로 대체​​하기 위하여 질소 가스를 고순도를 1,000 ml의 물. </li><li> 2의 용액을 조제 3 구 둥근 바닥 플라스크를 사용하여 철 (III) 클로라이드 헥사 하이드레이트 (의 FeCl3 · 6H 2 O), 철 (II), 염화 테트라 한 몰비 (50ml을 2 · 4H 2 O)로 희석 탈산 소화 고순도 물. 예를 들어, 50ml을 5.4 g을 사용 · 6H 2 O 및 탈산 소화 된 고순도의 물 10ml에서 50ml을 2 · 4H 2 O 1.98 g. 이 준비 저어 너무 점성이 어려운 켜지면, 탈산 소화 된 고순도의 물 20ml에 50ml을 0.54 g · 50ml을 2 6H 2 O 및 0.198 g · 4H 2 O를 사용합니다. 참고 :이 채널의 무게에 의해 2 O 공기에 50ml을 2 · 4H의 노출 시간을 감소가능한 한 빨리 emical 화합물. 이 질소 가스 공급 장치와 냉각 관에 접속 될 때까지 일단 3 구 둥근 바닥 플라스크에 도입 격벽 스토퍼와 3 구 둥근 바닥 플라스크를 닫는다. </li><li> 용기의 목에 격벽 스토퍼 펀칭 고정 바늘에 질소 가스 공급원을 접속하여 일정한 입구와 질소 가스의 출력을 제공하는 용기의 두 목을 사용한다. </li><li> 반응물과 용기에 이전 단계 1.5 (직경 15.6 mm, 두께 2-3 mm)를 제조 하였다 1 BNC 펠리클를 놓습니다. 시료가 완전히 액체에 잠긴되어 있는지 확인합니다. </li><li> 응축기 튜브 용기의 나머지 목 연결한다. 또한, 냉각 관의 상단에 무수 황산 칼슘 가득 건조 튜브를 사용합니다. 응축기 튜브를 통해 물을 실행합니다. </li><li> 진공 그리스와 유리 관절의 모든 인감. </li><li> 교반기를 이용하여 80 ℃의 실리콘 오일 욕의 용액을 가열핫 플레이트 단계 2.10까지이 온도를 유지. 5 분 동안 350 rpm에서 반응물을 혼합 작은 자기 교반 막대를 사용합니다. 있는지 확인 BNC 적절 철 용액을 함침하고, 반응물을 완전히 용해시킨다. 실험이 종료 될 때까지 교반을 유지한다. 주 : 실리콘 오일의 온도를 확인하는 온도계 활용. 그것은 80 ° C까지 안정해야한다. </li><li> 해온 피펫 팅 니들을 이용하여 철 용액 10 ㎖에 5 분, 수산화 암모늄 5 ㎖의 시간 간격 (NH 4 OH 14 %)에서 700 rpm으로 교반 속도를 증가시키고 (적하) 추가 또한 격막 마개에 펀칭. 암모늄 하이드 록 사이드를 첨가 한 후, 용액의 색은 검은 색으로 황색 / 오렌지로 변경합니다. </li><li> 또 다른 5 분 동안 80 ° C에서 상기 용액을 계속 교반 하였다. 샘플의 무결성을 유지하기 위하여 고속 되찾은 피한다. 높은 속도, 즉보다 높은 1,000 rpm으로, 파괴 할 수있다샘플. </li><li> 교반 열판의 온도를 제어하여 바닥을 30 ℃까지 용액의 온도를 낮추고 또 다른 5 분 동안 교반하면서 유지한다. 그 후, 핫 플레이트를 끕니다. 이때, IONP는 BNC 메쉬로 통합되었다. </li><li> RT까지 혼합물을 냉각시키고, 강한 영구 자석 (예를 들면, 1 테 슬러)를 이용하여 자성 나노 입자 (MNP) 및 BNC 분리. 이를 위해 선박 플라스크에 혼합물을 옮기고, 용기 부근에 자석을 유지하면서 상청액을 경사시키면서, 대신에 MNPS 및 BNC 개최. 참고 : 잘못 사용했을 때 그들은 해가 될 수 있기 때문에 강력한 자석을 처리 할 때주의해야합니다. 단계 (2.12)의 경우 - (2.14)과 (2.16) 산화에서 입자를 방지하기 위해 (2.1) 이전에 제조 된 환원 된 고순도의 물을 사용합니다. </li><li> 100 ml의 물에 MNPS와 BNC를 재현 탁. 부드럽게 강하게 BNC에 포함되지 않은 모든 MNPS을 제거 할 수있는 솔루션을 흔들. 의 S를 가만히 따르다자석을 사용하는 대신에 MNPS 및 BNC 채 다시 upernatant. </li><li> 상등액 중성 pH (약 pH 7)에 도달 할 때까지 비색 스트립을 이용하여 측정 한 물을 MNPS 및 BNC 수회 세척 하였다. </li><li> 핀셋을 사용하여 MNPS에서 BNC 작용 - 자기 또는 자기 박테리아 nanocellulose (MBNC)를 분리하고 물이 맑은 실행까지 물을 MBNC 여러 번 헹군다. </li><li> UV (110-280 ㎚)로 MBNC O / N을 노출시킴으로써 MBNC 멸균. </li><li> 20 분 동안 120 ℃에서 환원 된 고순도의 물 500 mL 및 압력솥이 물 20ml에 MBNC 저장한다. </li><li> 무균는 PEG의 1 %에 샘플을 담그고 실온에서 2 시간 (37 ° C) 동안 교반한다. 이 절차는 BNC 증착 산화철 나노 입자 표면에 노출 5-7 특히 이들의 생체 적합성 및 안정성을 향상시킨다. 페그 코팅은 MBNC 차원 네트워크를 통해 배포된다. 참고 : 벌거 벗은 IONP 쉽게 공기 중에 산화높은 화학적 활동 (8) 때문이다. PEG는 비 생분해 성 재료로 간주되는 경우에도 그것의 화학적 안정성은 수분량의 pH, 온도, 효소의 존재하에 활성 산소 반응성 질소 종 및 기타 9로인가 생물학적 조건에 의존한다. </li></ol> 의 BNC 및 MBNC 펠리클의 3 특성 <ol><li> 기계적 성질 <ol><li> 정상로드와 베르 코 비치 압자를 사용하여 하역 나노 압입 시험을 수행합니다. 바코 비치 압자 다이아몬드의 반경은 20 ㎚이다. </li><li> RT에서 압입 깊이의 함수로서 접촉 면적을 조정하는 용융 실리카 및 텅스텐을 사용한다. 시험하는 동안, 접착제를 사용하여 들여 쓰기에 샘플을 탑재합니다. 압자는 두께 방향으로 시료 접근했다. </li><li> 샘플 표면에 무작위로 선택 들여 쓰기 위치. 200-300mm 사이에 2 들여 쓰기 사이의 간격을 유지합니다. </li><li> 받는 하중을 적용단계 샘플은 압자의 해당 변위를 기록한다. 영률을 찾기 위해 깊이 대 부하의 그래프를 분석한다. </li><li> 0.01 Mn 및 0.60 MN 사이의 최대 부하로, 0.0001 MN / 초 0.005 MN / 초 사이의 하중 비율을 적용하여 탈 이온수 (DI 수), 테스트의 존재 하에서 시료의 나노 압입 테스트를 수행한다. </li><li> 액체 셀을 사용하고 액체 환경에서 샘플을 유지합니다. 유체 환경에 몰입 나노 기계 특성에 대한이 독특한 설정을 효과적으로 BNC 및 MBNC 세포막의 손이 닿지 생체 역학적 기능을 시뮬레이션하는 데 이상적이다. </li></ol></li><li> SEM에 의해 구조 특성 <ol><li> 주사 전자 현미경 (SEM)에 의해 nanocellulose 섬유 구조를 특성화. </li><li> -80 ° C에서 24 시간 동안 샘플을 동결 건조. 그런 다음, SEM 스터드에 장착 10 초 동안 금 - 팔라듐 필름 스퍼터 및 SEM을 사용하여 분석 할 수 있습니다. </li><li> 22,000X의 배율로 이미지를 이동합니다및 60,000X 5 kV의 가속 전압. </li></ol></li><li> 자기 도메인 <ol><li> 실온에서 완전히 건조에 MBNC의 펠리클을 허용하고,이어서 영구 자석 (1 테슬라)에 5 분 동안 노출. </li><li> 즉시, 제조자의 프로토콜에 따라 바이오 AFM을 이용한 자력 측정을 수행한다. </li><li> 각각의 측정을 위해 제 지형 기능을 캡처하고 두 번째 패스 동안에 자구를 획득. 비접촉 모드에서 바이오 AFM으로 모두 측정을 얻습니다. </li><li> 나노 입자의 자기 특성이 -10,000 10,000 오에 범위의 자기장, RT (300 K)에서의 물성 측정 시스템 양자 디자인 (PPMS)에 진동하는 샘플 자력계 (VSM)를 이용하여 수행된다. </li></ol></li><li> Cytocompatibility <ol><li> 1.0 ×의 밀도로 6 웰 조직 배양 접시에 종 인간 대동맥 평활근 세포 (HASMC) <sup&gt; 3 세포 / cm 2 및 시험 시료의 존재하에 24 시간 동안 배양 : BNC와 MBNC 펠리클 (직경 15.6 mm 각). </li><li> 각각 음성 및 양성 대조군으로 치료와 과산화수소 처리 된 세포의 인구를 사용합니다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜과 A. Azqueta 및 AR 콜린스 (10)에 의해 제안 된 지침에 따라 혜성 분석을 수행합니다. </li><li> 층간 삽입이 분석에서 핵산 염료 SYBR 금을 사용하여 형광 제조사의 프로토콜에 따라 전기 영동 시료에 함유 된 DNA 라벨. 참고 : BNC 및 MBNC 샘플의 존재에있는 DNA 손상을받지 않는 세포를 DNA 손상 세포가 긴 혜성해야합니다 반면, 형광 라운드 녹색 핵 양체를 표시합니다 - 긍정적 인 샘플 nucleoids (혜성의 머리)가됩니다 다음 (꼬리에서 DNA의 비율) 조각난 DNA 물질을 포함 꼬리. </li></ol></li></ol>

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의 BNC 펠리클의 두께 및 크기를 쉽게 배양 시간과 정적 배양 중에 성장시킨 플라스크의 크기를 변경함으로써 조작 될 수있다. 의 BNC의 microproperties, 예컨대 기공률 같이, 정적 배양에서의 산소 비율을 변화시킴으로써 변경 될 수있다. 높은 산소 농도는 BNC 11 강하다 얻을. A. 보댕 및 동료 G. 발효 과정에서 100 %의 산소 분위기에서 산소의 산소 비율을 변화시킴으로써 880mm 수은 최대 파열 압력 BNC의 튜브를 제조 xylinus 12. 마찬가지로, BNC의 다공성은 또한 발효 공정에 파라핀 왁스 등의 미소 포로 겐을 포함하여 도입 될 수있다. 이 경우, 생성 된 다공성 및 기공 상호은 기공 크기 (13)에 의존 할 것이다. 의 BNC의 다공성 네트워크는 약물 전달을 위해 그들을 예를 들면 나노 입자로 작용 화 될 수 있도록자치령 대표. ...

bacterian nanocellulose (BNC)도 Gluconacetobacter의 xylinus라고도 아세토 xylinum 균주에 의해 합성하고, 정치 배양 동안 공기 - 액체 계면에서 필름 또는 펠리클의 형태로 증착된다. 이러한 BNC의 펠리클은 재배 용기의 형태를 채용하고, 그 두께는 배양의 일수에 의존한다. A.을 xylinus 중합 후속 결정화 과정 셀룰로오스 마이크로 피 브릴의 합성 배지 중의 글루코스를 사용한다. 글루코오스 잔기의 중합은 사슬 글루칸은 세포 외피 분산 단일 기공 압출 박테리아 세포 막에서 수행된다. 셀룰로오스 마이크로 피 브릴의 결정화는 H-1 본딩 시트의 적층이어서 반 데르 발스 결합하여 글루칸 체인 시트의 형성, 세포 외 공간에서 일어난다. 자석BNC 매트릭스 집적 IC 나노은 동맥 벽의 손상된 부위에서 자성 나노 입자를 포함하는 지시 및 평활근 세포를 한정하는 데 필요한 힘 (SMCs)을 증가시키기 위하여 외부 자기장에 의해 쉽게 조작 될 수있다. 이 전략은 SMCs 떨어진 다른 조직에서 유지하고, 혈류에 의해 가해진 힘에 대항 장소에서 세포를 유지한다. SMCs 그들이 중막이 주로있는 풍부한 층을 형성하는 혈관의 vasoelasticity에 중요한 역할을하는 것으로 밝혀졌다. MBNC의 합성에 사용 된 방법은 BNC 펠리클을 침지하고, 80 ℃에서 철 (III) 클로라이드 수화물 및 철 (II) 클로라이드 수화물의 용액에 교반 포함한다. 수산화 암모늄은 BN​​C 메쉬 내부에 산화철 나노 입자를 형성하기 위해 첨가된다. 수산화 암모늄의 첨가는 블랙 오렌지색의 용액의 색상을 변경한다. 함께 BNC 피 브릴을 따라 IONPs 컴팩트불균일 한 분포의. 이 프로토콜은 누락, 손상 또는 부상 작은 직경의 혈관을 대체 사용하기위한 것입니다 우리가 자기 박테리아 nanocellulose (MBNC)라는 이름의 한 세균 nanocellulose 자성 나노 입자 박막, 설계에 초점을 맞추고있다. HS Barud 동료 최근 PEG 및 초상 자성 산화철 나노 입자 (3)의 안정한 수성 분산액 BNC의 펠리클을 혼합하여 BNC 기반 플렉시블 자기 종이를 생산하는 유사한 연구를 발표했다. 여기, 우리는 박테리아 셀룰로오스의 생산 및 자성 나노 입자와 현장에서의 함침을 설명합니다. 하나의 DNA 가닥 나누기의 검출에 기초하여 세포 독성 분석은 BNC와 MBNC 펠리클의 생체 적합성을 테스트하기 위해 사용되었다.

<table><tbody><tr><td>Glucoacetobacter xylinus</td><td>ATCC</td><td>700178</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1296-500G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol Bioxtra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9546-250G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>세균학 펩톤</td><td>시그마 알드리치</td><td>P0556</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨, 물 속 50% 용액</td><td>시그마 알드리치</td><td>158127-100G</td><td></td></tr><tr><td>철(III) 염화 헥사하이드레이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>236489-100G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>수산화암모늄&nbsp;</td><td>마크롱 파인 케미컬</td><td>6665-46</td><td></td></tr><tr><td>폴리(에틸렌 글리콜), 평균 Mn 400</td><td>시그마 알드리치</td><td>202398-250G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>철 (II) 염화물 테트라하이드레이트</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44939-250G</td><td></td></tr><tr><td>일회용 페트리 디쉬</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BR452000</td><td></td></tr><tr><td>일회용 접종 루프</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-604&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>무수 황산칼슘</td><td>W.A. Hammond Drierite&nbsp;</td><td>13001</td><td></td></tr><tr><td>고진공 그리스</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z273554-1EA</td><td></td></tr><tr><td>실험실용 피펫팅 바늘 90도; 무딘 끝</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CAD7937-12EA</td><td></td></tr><tr><td>pH 테스트 스트립&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4786-100EA</td><td></td></tr><tr><td>둥근 바닥 세 목 각도 타입 증류 플라스크</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4965250</td><td></td></tr><tr><td>오일 목욕용 실리콘 오일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85409-250ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>건조 튜브</td><td>Chemglass</td><td>CG-1295-01</td><td></td></tr><tr><td>격막 마개, 슬리브 유형</td><td>Chemglass</td><td>CG-3022-98</td><td></td></tr><tr><td>자기 교반 막대</td><td>Chemglass</td><td>CG-2001-05</td><td></td></tr><tr><td>콘덴서</td><td>Chemglass</td><td>CG-1218-01</td><td></td></tr><tr><td>온도 조절기</td><td>BriskHeat</td><td>SDC120JC-A</td><td></td></tr><tr><td>교반 핫 플레이트</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>11-100-49SH&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Comet Assay Kit</td><td>Trevigen</td><td>4250-050-K</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>bio-AFM</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoWizard 4a BioScience AFM</td><td></td></tr><tr><td>Nanoindenter</td><td>Micro Materials Ltd</td><td>다중 모듈 기계 테스터&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>주사 전자 현미경 (SEM)</td><td>Hitachi High Technologies America</td><td>Hitachi S-4800</td><td></td></tr></tbody></table>

철 산화물 나노 입자와 기능화 자기 세균 nanocellulose의 제작

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

본 연구에서는, 박테리아의 Gluconacetobacter xylinus 의해 생산 세균 nanocellulose (BNC)의 합성 및 자성 박테리아 nanocellulose (MBNC)을 수득 산화철 나노 입자 (IONP) (4의 Fe 3 O)와 동일계 함침. MBNC의 합성은 정확하고 설계된 다단계 공정이다. 간단히, 박테리아 nanocellulose은 (BNC) 펠리클이 유지 G.에서 형성된다 크기와 형태의 우리의 실험 요구 사항에 따라 xylinus 변형. 철 (III) 클로라이드 헥사 하이드레이트 (의 FeCl3 · 6H 2 O)과이 철 (II) 클로라이드 수화물 (50ml을 2 · 4H 2 O) 용액 : 1의 몰비로 준비하여 탈산 소화 고순도 물로 희석한다. BNC 펠리클이어서 반응물 용기에 도입된다. 이 혼합물을 침전 적하하여 교반 한 후, 첨가되는 실리콘 오일 욕 암모늄 하이드 록 사이드 (14 %)에서 80 ° C로 가열철은 BNC 메쉬에 이온. 이 마지막 단계는 BNC 펠리클에 자기 특성을 부여하는 박테리아 nanocellulose 메쉬 내부 현장 마그네타이트 나노 입자 (O 4의 Fe 3)에 형성 허용한다. 독성 분석은 BNC-IONP 펠리클의 생체 적합성을 평가하기 위해 사용되었다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 생체 적합성을 향상시키기 위해 IONPs을 커버하는데 사용되었다. 주사 전자 현미경 (SEM) 이미지는 IONP가 BNC 매트릭스의 공간을 인터레이스 피 브릴에 우선적으로 위치했지만, 그들 중 일부는 또한 BNC 리본을 따라 발견 된 것으로 나타났다. MBNC에서 수행 자기 현미경 측정은 MBNC의 박막의 자기 특성을 확인, 높은 약한 강도의 자기장이 존재 자구를 발견했습니다. 이 연구에서 얻어진 영률 값이 이전의 연구에서 여러 가지 혈관보고 그와 잘 일치도이다.

G.의 잠복기 xylinus 9 일 총했지만, 펠리클 앞서 형성되기 시작하고 약 2 주 후에 분명했다. 의 BNC의 거시적 인 외관은 그림 1에 표시됩니다, 그 접시 성장 문화의 어떤 모방의 형태.이 그림뿐만 아니라 위의 프로토콜과 관련된 주요 단계를 요약하고있는 BNC-IONP의 펠리클의 제조 방법을 설명합니다 주요 구성 요소의 구성. SEM 이미지는 미세 구조, 형태, 및 BNC (도 3)에 작용 BNC IONP 분포 섬유의 공간적 분포 (도 4)을 확인하는 데 사용 하였다. 의 BNC는 정의 된 패턴없이 전체 네트워크에 걸쳐 열린 기공을 형성 미세 리본 (직경 약 50 ㎚)...

여기에서는 손상된 혈관 재건에 응용하기 위해 박테리아 나노셀룰로오스(BNC)를 자성화하는 프로토콜을 제시합니다. BNC는 G. xylinus 균주에 의해 합성되었습니다. 한편, BNC의 자화는 BNC 메쉬 내부의 Fe2+ 및 Fe3+ 철 이온의 현장 침전을 통해 실현되었습니다.

철 산화물 나노 입자와 기능화 자기 세균 Nanocellulose의 제작

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 박테리아 나노셀룰로오스(BNC)를 합성하고, 산화철 나노입자를 제자리(in situ)에서 함침시켜 자성을 부여하는 것입니다. 자성 BNC 막은 혈역학적 흐름에 대항하여 자성화된 세포를 국소적으로 끌어당기고 유지하도록 설계되었습니다. 이 절차를 통해 합성된 자성 BNC의 주요 장점은 뇌동맥류 인근에서 최소 침습적 치료를 제공한다는 점입니다.클리핑, 신경 및 혈관 코어 유화술과 같은 뇌동맥류의 기존 치료법은 침습적이고 외상성이며, 위험도가 높은 대부분의 환자에게는 적합하지 않습니다. 이 기술의 영향은 혈관 질환 치료로까지 확장될 수 있는데, 자성 지지체로 제작된 혈관 이식편이 손상 부위의 세포 유지력을 향상시켜 치유 속도를 높일 수 있기 때문입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 액체 배양 배지를 준비하는 것으로 이 절차를 시작하십시오.24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 액체 배양 배지 2 mL를 옮깁니다. 백금이를 사용하여 이전 단계에서 접종한 페트리 접시로부터 콜로니 2개를 채취하여 조직 배양 플레이트의 첫 번째 웰에 넣습니다. 나머지 23개 웰에 대해서도 동일한 절차를 반복합니다.조직 배양 플레이트를 30 °C에서 7일 동안 배양합니다. 이렇게 하면 직경 16 mm, 두께 약 2~3 mm의 BNC 펠리클이 총 24개 생성됩니다. 배양 배지에서 BNC 펠리클을 수집한 후, 1% 수산화나트륨 용액 200 mL에서 50 °C로 1시간 동안 멸균하여 G.Xylinus의 모든 흔적을 제거합니다.용액을 버리고, 갓 제조한 1% 수산화나트륨 용액 200 milliliters를 첨가합니다. 용액 내의 BNC 펠리클이 반투명한 외관을 띨 때까지 동일한 과정을 한 번 더 또는 반복해서 수행합니다. BNC 펠리클을 물로 3회 세척한 후, 실온의 고순도 증류수에 보관합니다.BNC 펠리클이 물에 완전히 잠겨 있는지 확인하고, 어느 시점에서도 건조되지 않도록 주의하십시오. 그 다음, BNC 펠리클을 121 °C에서 20분 동안 오토클레이브합니다. 합성을 시작하려면, 1000 mL의 고순수 물에 질소 가스를 버블링하여 물속의 용존 산소를 제거하고 이를 질소로 대체합니다.3구 라운드 바닥 플라스크를 사용하여 염화 철(III) 6수화물과 염화 철(II) 4수화물을 2:1 몰 비율로 혼합하고, 탈산소 고순도수로 희석하여 용액을 준비합니다. 플라스크의 입구 2개에 세프텀 스토퍼에 꽂힌 바늘을 통해 질소 가스를 공급하고 연결하여 질소 가스가 지속적으로 유입되고 배출되도록 합니다. 반응물이 담긴 플라스크 안에 BNC 펠리클 1개를 넣습니다.시료가 액체에 완전히 잠겼는지 확인하십시오. 그다음, 모든 유리 조인트를 진공 그리스로 채웁니다. 용기의 남은 목 부분을 무수 황산칼슘이 채워진 건조관이 상단에 부착된 냉각관에 연결하십시오.냉각관에 물을 흘려보내십시오. 다음으로, 교반 핫플레이트를 사용하여 실리콘 오일 배스에서 용액을 80 °C까지 가열하고 이 온도를 유지하십시오. 작은 마그네틱 바를 사용하여 반응물을 350 R.P.M.에서 5분 동안 혼합하십시오.BNC가 철(II) 용액에 적절히 함침되고 반응물이 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 교반 속도를 700 R.P.M.으로 높입니다. 격막 마개(septum stopper)에 꽂힌 피펫팅 바늘을 사용하여, 5분 간격으로 10 mL의 철(II) 용액에 수산화암모늄 5 mL를 첨가하십시오. 수산화암모늄을 첨가하면 용액의 색상이 황색-오렌지색에서 검은색으로 변합니다.용액을 80 °C에서 5분 더 계속 교반합니다. 샘플의 무결성을 유지하기 위해 고속 교반은 피하십시오. 스터링 핫플레이트의 온도 조절 버튼을 사용하여 용액의 온도를 30 °C로 낮춘 후 5분 더 계속 교반합니다.그런 다음 핫플레이트를 끕니다. 이 시점에서 산화철 나노입자가 BNC 메쉬에 통합되었습니다. 다음으로 혼합물을 실온까지 냉각하고, 이를 플라스크로 옮겨 강력한 영구자석을 사용하여 자기 나노입자(MNPs)와 BNC를 분리합니다.이를 위해, 상층액을 따라내는 동안 자석을 용기 가까이 두어 MNPs와 BNC가 제자리에 유지되도록 합니다. MNPs와 BNC를 100 milliliters의 물에 다시 현탁시킵니다. 용액을 부드럽게 흔들어 BNC에 강하게 결합되지 않은 모든 MNPs를 제거합니다.그런 다음, 자석을 사용하여 MNP와 BNC를 고정시킨 상태에서 상층액을 다시 데칸테이션합니다. 색도 측정 스트립으로 확인했을 때 상층액이 중성 pH에 도달할 때까지 MNP와 BNC를 물로 여러 번 세척합니다. 핀셋을 사용하여 자성 기능화 BNC(MBNC)를 MNP로부터 분리하고, 물이 투명해질 때까지 MBNC를 물로 여러 번 헹굽니다.MBNC를 밤새 U.V.에 노출시켜 멸균합니다. 120 °C에서 20분 동안 오토클레이브 처리한 탈산소 고순수 20 milliliters에 MBNC를 보관합니다. 무균적으로 샘플을 1% 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 담그고 상온에서 2시간 동안 교반합니다. PEG 코팅은 MBNC 3D 네트워크 전체에 분산되어 BNC에 침착된 산화철 나노입자의 생체 적합성과 안정성을 향상시킵니다.BNC의 거시적 외형이 여기에 나타나 있습니다. 배양 용기가 펠리클의 형태를 결정합니다. 주사 전자 현미경 분석 결과, 직경 약 50 nanometers의 미세한 리본들이 BNC의 미세 구조를 형성하며, 이는 전체 네트워크에 걸쳐 개방형 기공을 생성하는 것으로 나타났습니다.BNC의 자기적 기능화는 BNC와 비교하여 덜 조밀한 피브릴 구조를 형성합니다. 산화철 나노입자는 피브릴 간의 얽힘으로 형성된 기공 사이에 우선적으로 위치합니다. 원자간력 현미경 지형 분석을 통해 MBNC 표면 전체에서 두 개의 도메인으로 특징지어지는 자기력 구배가 검출되었습니다.노란색으로 표시된 고강도 자기장과 녹색으로 표시된 저강도 자기장입니다. MFM으로 관찰된 자기 도메인의 존재는 진동 시료 자력계 데이터로 확인되었으며, 이는 산화철 나노입자가 초상자성을 띠어 BNC를 자성으로 만든다는 것을 보여줍니다. BNC 또는 MBNC의 유무 상태에서 배양했을 때, 과산화수소 처리군과 비교하여 인간 대동맥 평활근 세포의 DNA 무결성이 24시간의 배양 기간 후에도 유지됨이 확인되었습니다.이 영상을 시청하고 나면, 손상된 혈관 재건 응용 분야를 위해 박테리아 나노셀룰로오스를 자성으로 만드는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 저희는 박테리아 나노셀룰로오스 네트워크의 복잡한 매트릭스 내에 분산되어야 하는 자성 나노입자의 밀도 구배를 유도해야 했을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다. 이 네트워크에 산화철 나노입자를 통합하기 위해서는 BNC 합성 과정 중에 특정 방법을 수행해야 했습니다.일반적으로, BNC에 산화철 나노입자를 함침시키는 과정에 여러 복잡한 단계가 포함되어 있어 이 방법을 처음 접하는 사람들은 어려움을 겪을 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

출처: Arias, S. L. 외 산화철 나노입자를 이용한 기능화된 자성 박테리아 나노셀룰로오스 제조. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 글루코나세토박터 자일리누스가 생성하는 박테리아 나노셀룰로오스 펠리클 내에서 자철석 나노입자를 현장에서 합성하는 과정을 시연합니다. 이 연구는 자기 박테리아 나노셀룰로오스가 철 이온 주입, 알칼리 침전, 정제를 통해 생성되는 과정을 설명합니다.

자철석 내재 박테리아 나노셀룰로오스 펠리클 생성

출처: Arias, S. L. 외 산화철 나노입자를 이용한 기능화된 자성 박테리아 나노셀룰로오스 제조.  J. Vis. 경험 (2016년).이 영상은 만니톨이 포함된 영양 배지에서 셀룰로오스 생성 박테리아를 배양하여 나노셀룰로오스를 생산하는 과정을 시연합니다. 박테리아는 만니톨을 포도당으로 대사하고, 포도당은 중합되어 글루칸 사슬로 압출되어 셀룰로오스 시트로 결정화되어 공기-액체 계면에서 3차원 매트릭스를 형성합니다. 생성된 젤라틴성 펠리클은 수확하여 알칼리성 및 물 세척으로 정제한 후 오토클레이빙으로 멸균하여 추가 적용을 위해 사용한다.

셀룰로오스 생성 박테리아로부터 나노셀룰로오스 펠리클 제조

표적 세포 전달은 다양한 생체 의학 응용 분야에서 유용합니다.  이 프로토콜의 목표는 초상자성 산화철 나노입자(SPION)를 사용하여 세포를 라벨링함으로써 세포 전달 및 국소화를 높은 수준으로 제어할 수 있는 자기 세포 표적화 접근 방식을 가능하게 하는 것입니다.

셀 라벨 및 초상 자성 산화철 나노 입자로 타겟팅

코발트 도핑된 마그네토페리틴의 합성 및 양이온화를 위한 프로토콜과 양이온화된 마그네토페리틴으로 줄기세포를 빠르게 자화하는 방법을 제시합니다.

세포의 초고속 자화에 대한 양이온 Magnetoferritin의 합성

이 작품에서, 우리는 템플릿으로 사용되는 다공성 알루미나 멤브레인의 형성, 전해질 용액을 사용하여 템플릿으로의 전착, 용액으로 나노 와이어의 방출을 포함하여 철 나노 와이어를 제조하는 프로토콜을 설명합니다.

나노 다공성 양극 산화 알루미늄및 그 특성화에 의한 철 나노 와이어 제조

이 작품은 자기 나노 입자의 제조를위한 프로토콜을 설명,SiO2로코팅, 그 아민 기능화 (3-아미노 프로필) triethoxysilane (APTES) 및 링커로 수치 닐 모니티를 사용하여 deferoxamine와의 그 연상. 모든 중간 나노입자 및 최종 컨쥬게이트에 대한 Y. 장골염을 이용한 깊은 구조적 특성화 설명 및 포획 박테리아 분석법도 상세히 설명한다.

기능성 자기 나노 입자의 합성, 사이드로포레 페록사민과의 그들의 융합 및 박테리아 검출에 대한 평가

산화철 나노입자는 비수성 솔 젤 시술을 통해 합성되고 음이온 짧은 분자 또는 폴리머로 코팅된다. 인간 줄기 세포 내부의 자기 나노 입자의 통합 및 생체 변환을 모니터링하기 위한 자기 측정의 사용은 진동 시료 자력계(VSM)를 사용하여 입증된다.

자기 측정을 사용하여 화학적으로 합성된 산화철 나노 입자의 세포 통합 및 후속 생분해를 모니터링합니다.

이 연구에서는 특정 세포 표적화를 위한 항체로 자성 나노물질을 생체 기능화하는 프로토콜을 제공합니다. 예를 들어, 우리는 암세포를 표적으로 삼기 위해 철 나노 와이어를 사용합니다.

자성 나노 물질의 생체 기능화

이 작품은 신경 조직의 제어를위한 지역 자기력의 엔지니어링에 상향 식 접근 방식을 제시한다. 자기 나노 입자 (MNPs)로로드 된 뉴런 과 같은 세포는 수직 자화와 마이크로 패턴 플랫폼에 의해 도금및 제어됩니다. 또한 자기 특성화, MNP 세포 섭취, 세포 생존 가능성 및 통계 분석이 설명되어 있습니다.

상호 연결된 뉴런의 마이크론 규모의 조직을 위한 자기 플랫폼 제작

이 프로토콜은 결정성 나노셀룰로오스(CNC)/아가로즈 복합 하이드로겔 생체재료 잉크를 마우스 골수 유래 마스트 세포와 함께 세포 표면 수용체의 세포 생존성 및 표현성 발현, 키트(CD117) 및 고친화도 이에 수용체(FcθRI)의 생체 적합성을 신속하게 평가하는 방법을 강조한다.

골수 유래 마스트 세포 배양을 위한 결정성 나노셀룰로오스 내장 아가로즈 생물재료 잉크의 제조

배우세요 철 산화물 나노입자를 이용해 G. xylinus로 세균성 나노셀룰로스를 합성하고 자기 기능화하는 방법을. 이 기술은 혈관 재건 및 뇌동맥류 최소침습 치료에 활용됩니다.

철 산화물 나노 입자와 기능화 자기 세균 Nanocellulose의 제작

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