절대 단백질 정량 질량 분석을 모니터링 선정 반응

이 절차의 전반적인 목표는 액체 크로마토그래피, 선택된 반응 모니터링 또는 L-C-S-R-M을 사용하여 복잡한 생물학적 샘플 내 표적 단백질의 절대 농도를 정량화하는 것입니다. 펩타이드 표적을 선택한 후, 미처리 외부 펩타이드 표준물질을 합성하고 액체 크로마토그래피, 질량 분석법 또는 LCM ms를 사용하여 SRM 분석을 개발하는 데 사용합니다. 생성된 분석은 준비된 생물학적 샘플의 정성적 lc, SRM 분석을 수행하는 데 사용됩니다.

생물학적 시료 유래 표적 펩타이드가 검출되면 내부 펩타이드 표준물질의 안정 동위원소 희석 시리즈를 추가하여 정량적 lc SRM 분석을 사용하여 생물학적 시료를 분석합니다. 궁극적으로 lc SRM은 다양한 생물학적 샘플에서 단백질을 정확하게 정량화하고 다양한 단백질 표적에 대한 조사를 지원하는 데 사용할 수 있습니다. 면역 분석법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 분석 개발이 상대적으로 빠르고 저렴하며 결과 분석이 다중화에 적합하고 항체 교차 반응에 취약하지 않다는 것입니다.

시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 동결건조 펩타이드 표준물을 준비합니다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 포름산 아세토 니트릴 용액을 동결 건조 된 펩타이드 표준의 각 M에 첨가하여 10 마이크로 몰의 펩타이드 농도를 생성합니다. 샘플을 2분 동안 소용돌이치고 목욕시킵니다.

펩타이드 용해가 완료되었는지 확인하기 위해 5분 동안 초음파 처리합니다. 용해된 펩타이드를 당기고 생성된 혼합물을 진공 농축기에서 최종 부피 80마이크로리터로 농축합니다. 침전된 펩타이드를 용해시키기 위해 20마이크로리터의 아세틸 니트릴을 첨가합니다.

샘플에는 이제 각 펩타이드의 10 마이크로 몰과 20 % 부피 대 부피 아세틸 니트릴이 포함되어 있으며 내부 및 외부 펩타이드 표준물을 준비하기 위해 트리플 4 배 질량 분석기에 결합 된 나노 플로우 HPLC 시스템을 사용하여 샷건 질량 분석법으로 주입 당 각 펩타이드의 약 1-10 피코몰에서 외부 펩타이드 표준물의 혼합물을 분석합니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명되어 있듯이 각 LCMS 실행에 60분 선형 그래디언트, 컬럼 재생성 단계 및 컬럼 ree 평형 단계가 포함되어 있는지 확인합니다. 데이터베이스를 사용하여 결과 산탄총 데이터를 분석하고 외부 펩타이드 표준의 염기서열을 검색합니다.

모든 펩타이드 식별을 수동으로 검토하여 모두 모호하지 않은지 확인하고 모호한 펩타이드 식별을 폐기합니다. 샷건 Ms 펩타이드 식별을 사용하여 Skyline Line과 같은 소프트웨어 프로그램을 사용하여 스펙트럼 라이브러리를 구성합니다. 전구체 이온당 3개에서 10개의 가장 강렬한 전이를 사용하여 lc SRM 전이 목록을 준비합니다.

결과 전이 목록을 사용하여 외부 펩타이드 표준물질 혼합물의 lc SRM 분석을 수행합니다. 결과 L-C-S-R-M 데이터를 수동으로 검토하고 성능이 좋지 않은 분석을 삭제합니다. 생물학적 샘플을 준비합니다.

먼저, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 수확합니다. 갓 준비한 요소 용해 완충액 400마이크로리터를 추가하고 부드러운 피펫팅을 사용하여 각 샘플을 혼합합니다. 각 샘플을 약 100마이크로리터의 0.1mm 지르코니아 실리카 비드, 라이스 세포를 포함하는 O-링이 있는 나사 캡이 있는 2밀리리터 튜브로 최대 속도 수조에서 5분 동안 샘플을 와류로 가열합니다.

실온에서 10분 동안 샘플을 초음파 처리하여 균질화와 단백질 성숙을 돕습니다. 그런 다음 정성 분석을 위한 bissy acid assay와 같은 lysates의 단백질 농도 분석을 수행합니다. 안정적인 동위원소 희석 시리즈를 위해 200마이크로그램의 세포 용해액 분취액을 준비합니다.

내부 펩타이드 표준물질의 에코 몰 혼합물의 안정 동위원소 희석 시리즈를 시료에 첨가합니다. 각 샘플에 0.7마이크로리터의 1몰 DTT를 첨가하고 섭씨 60도에서 30분 동안 샘플을 배양하여 단백질 시스테인 잔류물을 줄입니다. 각 샘플에 7마이크로리터의 완충된 ITO 아세트아미드를 첨가하고 샘플을 실온에서 어둠 속에서 20분 동안 배양하여 알킬레이트 단백질 시스틴

각 샘플에 대해 수산화나트륨으로 조정된 100밀리몰 히스 482마이크로리터를 추가하여 최종 요소 농도가 1몰이 되도록 합니다. 다음으로, 단백질을 펩타이드로 소화합니다. 세포 용해물을 포함하는 각 샘플에 마이크로리터당 0.5마이크로그램의 염기서열분석 등급 트립신 8마이크로리터를 추가합니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 18시간 동안 샘플을 배양합니다. 배양 다음, 2% 부피의 440 마이크로리터를 부피 포름산 원심분리에 추가하고, C 18 SPE 카트리지 고체상을 막을 침전물을 펠릿화하기 위하여 실온에 20 분 동안 000 G에 모든 표본을 추가합니다. 일회용 C 18 SPE 카트리지 버스트를 사용하여 각 SUP natin을 추출합니다.

1ml의 버퍼 B를 적용하여 컬럼을 적시고 1ml의 버퍼 A를 두 번 적용하여 평형을 이룹니다. 평평한 표면을 사용하여 C 18 SPE 카트리지를 통해 고무 전구와 추출 매니폴드에 이동상을 강제로 밀어 넣습니다. 샘플을 적용한 다음 1ml의 완충액으로 카트리지를 세척하고 A: 1ml의 완충액 B를 적용하여 펩타이드를 두 번 용리합니다.진공 농축기의 각 ilu를 최종 부피 100μl까지 천천히 농축하여 아세틸 니트릴을 증발시킵니다.

그런 다음 각 샘플에 아세틸 니트릴의 포름산 부피에 5% 부피인 2마이크로리터를 추가합니다. 이전과 같이 정성적 L-C-S-R-M을 사용하여 샘플을 분석합니다. 정량적 L-C-S-R-M 분석을 위해 외부 펩타이드 표준물을 분석하기 위해 사용된 각 생물학적 시료 샷건 질량 분석법의 동위원소 희석 시리즈를 실행합니다.

전구체당 가장 강렬한 전이 상위 10개는 L-C-S-R-M에 대해 선택되었습니다. 그런 다음 L-C-S-R-M을 사용하여 외부 펩타이드 표준을 분석했습니다. 그 결과로 도출된 펩타이드 식별은 명확해야 합니다.

생물학적 샘플에 대한 정성적 L-C-S-R-M 분석은 일반적으로 더 많은 배경 신호를 생성했지만 대부분의 펩타이드 표적은 자신 있게 식별되었습니다. 정량적 L-C-S-R-M은 생물학적 샘플에 스파이크된 내부 펩타이드 표준물질을 사용하여 수행되었습니다. 그 결과 단백질 존재량 값은 생물학적 복제물과 표적 단백질당 두 개의 표적 펩타이드 전반에 걸쳐 일관되었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 복잡한 생물학적 시료 내 표적 단백질의 절대 농도를 정량화하기 위해 L-C-S-R-M 분석을 개발하고 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.