Name: 공포 성 대 세포질의 정량화 살모넬라 차동 투과성으로하여 기본 대 식세포에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 배우세요 뼈수파유래대식세포에서 디지토닌 차투과성을 이용한 세포질 및 소포체 내 살모넬라 정량화 방법입니다. FACS 분석으로 병원체 위치를 정확히 판별하여 숙주-병원체 상호작용 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 토론 마티아스 S. 딕, 롤랜드 F. DREIER과 세바스찬 RUHL을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 SNSF 교수 PP00P3_139120 / 1 PB에 대학 바젤의 프로젝트 보​​조금 ID2153162에 의해 지원되었다

살모넬라 균을 mCherry가 발현 1. 디기 토닌 분석 (분석 FACS 기반) <ol><li> 준비 박테리아 주 : 플라스미드 (PFPV가 rpsM 프로모터하에 mCherry을 코딩)에서 mCherry 발현 살모넬라 야생형 SL1344은 (스트렙토 마이신 내성)이 분석에 사용된다. mCherry의 구성 적 발현에 의해 변경되지 세균 증식 식세포 16 (데이터는 보이지 않음). <ol><li> 37 ° CO / N에서 통에 스트렙토 마이신 (90 μg의 / ㎖) 및 암피실린 (100 ㎍ / ml의 mCherry 발현 벡터)와 보충 LB 배지 3 ㎖에 감염되기 전에 변형 일일 접종. </li></ol></li><li> 감염 세포를 도금. <ol><li> 1.25 × 105 세포의 밀도로 24 웰 플레이트에 시드 야생형 BMDMs / 웰 주 식세포 배지 1 ㎖에가 (DMEM은 10 % 태아 송아지 혈청 (FCS, 열 - 불 활성화 된 56 ° C, 30 분간으로 보충 ), 1 % HEPES, 1 % 비 필수 아미노산 (NEAA), 1 % L 글루타민, 10 % L929 상등액 (대 식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF로부터의 조정 배지) L929 세포를 제조). 표 1에 따른 종자 우물은 개별 조건을 설명합니다. 컨트롤 (표 1)로 사용 된 우물로 된 커버를 추가합니다. </li><li> 37 ℃ 배양기에서 밤새 인큐베이션하고 세포를 5 % CO 2. </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> 투과성으로 </td><td colspan="3"> 염색 </td></tr><tr><td></td><td> 유리 커버 슬립 </td><td> 살모넬라 </td><td> 디기 토닌 </td><td> 사포닌 </td><td> 안티 살모넬라 </td><td> 안티 Calnexin </td><td> 안티 PDI </td></tr><tr><td> A1 (샘플) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A2 (샘플) </td><td> - / + * </td><td> + </td&gt; <td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A3 (샘플) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A4 (NO 투과성으로 제어) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A5 (완전 투과성으로 제어) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> B1 (calnexin에 대한 염색) </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B2 (calnexin에 대한 염색) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B3 (calnexin에 대한 염색) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> C1 (스테인드) PDI에 대한 </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C2 (PDI에 대한 염색) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C3 (PDI에 대한 염색) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td></tr></tbody></table> 표 1 : 살모넬라, 투과성으로하고, 염색과 이후의 감염 24 웰 형식의 골수 유래 대 식세포 (BMDMs)에 대한 도금 방식 * 프로토콜 1 프로토콜이 완료되어 있는지 여부에 따라 다릅니다.. <ol start="3"><li> 감염 박테리아를 준비. <ol><li> 다음날, PBS에 문화 1:10 희석 PBS 만 제어에 대한 외경 (600)를 측정하여 하룻밤 문화에 살모넬라 균의 농도를 결정한다. 이것은 OD 600 리터로 측정되는 것을 보장분광 광도계의 inear 범위. </li><li> ml의 당 살모넬라 균의 농도를 계산한다. 하나의 OD600은 1 × 109 박테리아에 대응한다. </li><li> 1.25 × 106 세포 / ㎖의 살모넬라의 농도에 도달 할 식세포 배지에서 세균을 희석. </li></ol></li><li> 살모넬라 균과 세포의 감염. <ol><li> BMDMs에서 매체를 제거합니다. 감염되지 않은 제어 우물 (B1-B3, C1-C3)에 대 식세포 매체의 1 ML을 추가합니다. 웰스 A1에 살모넬라 균 현탁액 1 ML을 추가 - A5는 셀 당 10 세균의 감염 (MOI)의 다양성에 도달 할 수 있습니다. </li><li> 감염을 동기화하기 위해 37 ° C에서 300 XG에 15 분 동안 플레이트를 원심 분리기. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 겐타 마이신과 세포 외 살모넬라 균을 죽이는. <ol><li> 1 시간 후 감염에, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 0.1 ㎎ / ㎖ 젠타 마이신을 포함하는 대 식세포 매체의 0.1 ml에 추가세포 외 박테리아를 죽일. 모든 셀들이 동일한 방식으로 처리되도록, 짝수 비감염 컨트롤에, 모든 웰에 추가 젠타 마이신. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 세포를 세척. <ol><li> 2 시간 게시물 감염에서 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 모든 우물 일반 DMEM의 1 ml의 2 배 세척 (미리 예열 37 ° C까지)와 대 식세포 매체로 교체 10 ㎍ / ml에 포함 (37 ° C로 미리 예열) &#160; 겐타 마이신은 남아있는 세포 외 박테리아의 성장을 방지합니다. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 세제 및 항체와 신선한 버퍼를 준비. <ol><li> 다만 분석 원하는 시점 전에 1 밀리그램 / KHM 완충액 ㎖ (110 mM의 아세트산 칼륨, 20 mM의 HEPES, 2 mM의의 MgCl 2, 7.3의 pH)에서의 디기 토닌 신선한 스톡 용액을 제조 하였다. 작업 농도 버퍼 주식을 필터와 KHM에 희석50 μg의 디기 토닌 / ㎖의. 또한, 버퍼 KHM, KHM에서 1/100에서 1/100 또는 항 PDI에서 1/500, 안티 calnexin에 FITC (CSA-1-FITC)에 커플 항 살모넬라 항체 0.1 % 사포닌 용액을 조제 버퍼는 3 % BSA로 보충. </li></ol></li><li> 세포 투과성으로. <ol><li> 인큐베이터에서 접시를 제거하고 세척 우물은 KHM 버퍼의 0.5 ㎖로 (37 ° C로 미리 예열) 배. A3 우물의 A5과 B3에 사포닌과 B2 / C2 또는 KHM 버퍼 / C3 (표 1에 따라) - KHM 버퍼를 제거하고 웰스 (A1)에 디기 토닌과 우물 A4와 B1 / C1, KHM 버퍼에 0.25 ㎖의 일반 KHM 버퍼를 추가합니다. 모든 우물이 KHM 버퍼의 0.5 ㎖로 3 배 씻어 즉시 실온에서 정확히 1 분 동안 품어 (37 ° C로 미리 예열). </li></ol></li><li> 차 항체 염색. <ol><li> 적절한 우물에 차 항체 솔루션 (염소 항 살모넬라 -FITC, 250 μL / 웰, 0.1 μg의 / ㎖) KHM 버퍼를 제거하고 추가 (그림 1 </st룽&gt; 표 1). 37 ℃ 배양기에서 15 분 동안 플레이트를 인큐베이션, 5 % CO 2. </li><li> 1 mL의 PBS로 1X 세포를 씻으십시오. </li></ol></li><li> 감염된 세포 (웰스 A1 - A5) : FACS 분석 <ol><li> 워시 세포는 PBS로 3 배 및 0.1 % 트리톤을 포함하는 얼음처럼 차가운 PBS 0.5 mL를 넣어. 세포 집합체를 헤어 셀 스트레이너 캡 5 ㎖ 외과 튜브에 전송합니다. 얼음에 샘플을 유지합니다. </li><li> 외과의 샘플을 분석 할 수 있습니다. 완전히 투과성이 컨트롤을 사용하여, 총 순방향 기반 박테리아 제 및 측면 산란 (FSC / SSC)를위한 게이트를 설정하고 mCherry 신호 (610 ± 20 nm의 나노 필터). </li><li> 다음, 세포질 박테리아 게이트 (FITC + mCherry +)와 액포 박테리아 (FITC-, mCherry +) (그림 3)을 설정하기 위해 충분히 투과성이 아닌 투과성이 컨트롤을 사용하여 총 세균 집단의 FITC 신호를 분석 할 수 있습니다. </li><li> 게이트 설정으로, 시료를 분석 및 대 세포질의 비율을 결정제조사의 프로토콜에 따라 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 액포 박테리아. </li></ol></li><li> 감염되지 않은 투과성으로 컨트롤 (우물 B1 - B3, C1 - C3) : 현미경 <ol><li> 정착 <ol><li> PBS를 제거하고 PBS에 PFA 4 %의 250 μl를 추가합니다. 37 ℃에서 10 분 동안 품어. </li><li> 우물은 1 ml의 PBS로 2 배 세척 및 정착을 해소하기 위해 10 분 동안 PBS 0.1 M 글리신의 250 μl를 추가합니다. 워시 웰 PBS 1 ㎖로 2 배. </li></ol></li><li> 이차 항체 염색. <ol><li> PBS에 적합한 형광 물질에 결합 이차 항체와 함께 1 시간 동안 실온에서 얼룩 투과성으로 컨트롤 사포닌 0.1 % 3 % BSA 완전히 Permeabilize 하시려면 세포로 보충. </li><li> 워시는 1 ml의 PBS로 3 배를 커버 슬립과 DAPI (1.5 μg의 / ml)로 매체를 장착에서 분석 된 커버를 탑재합니다. </li></ol></li><li> 현미경 분석. <ol><li> 공 초점 FLUO을 사용하여 40X 또는 63X 배율에서 컨트롤 된 커버 분석rescence 현미경. 투과성으로 일한 경우, digitonin- 사포닌 투과성이 세포와 PDI는 사포닌 투과성이 세포 (그림 4) 만 염색 모두에 대한 비 투과성이 세포 염색, Calnexin 염색이 없어야합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 레이블이없는 살모넬라 (현미경 기반 분석) 2. 디기 토닌 분석 <ol><li> O / N 문화에 대한 박테리아를 준비합니다. <ol><li> 레이블이없는 살모넬라 야생형 SL1344 접종 (스트렙토 마이신 내성) 37 ° CO / N에서 통에 스트렙토 마이신 (90 ㎕ / ml)이 첨가 된 LB 배지 3 ㎖에 감염 1 일 전. </li><li> 감염 세포를 도금. <ol><li> 1.25 × 105 세포의 밀도로 멸균 된 유리 커버 슬립을 함유하는 24 웰 플레이트에 시드 BMDMs / 웰 식세포 배지 1 ㎖ (DMEM은 10 % 태아 송아지 혈청 (FCS와 디 보완, ​​56 ° C를 보충에,30 분), 1 % HEPES, 1 % L 비 필수 아미노산 (NEAA), 1 % L- 글루타민 및 10 % 상등액 L929). 표 1에 따른 종자 우물은 개별 조건을 설명합니다. </li><li> 37 ℃ 세포 배양기에서 O / N을 부화 및 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 감염 박테리아를 준비. <ol><li> 다음날, PBS에 문화 1:10 희석 PBS 만 제어에 대한 외경 (600)를 측정하여 O / N 문화에서 살모넬라 균의 농도를 결정한다. 이것은 OD 600 분광 광도계의 선형 범위에서 측정되는 것을 보장한다. </li><li> 밀리리터 당 살모넬라 균의 농도를 결정합니다. (1)의 OD (600)는 1 × 109 박테리아에 대응한다. </li><li> 1.25 × 106 세포 / ㎖의 살모넬라의 농도에 도달 할 식세포 배지에서 세균을 희석. </li></ol></li><li> 살모넬라 균과 세포의 감염. <oL&gt; <li> 모든 우물에서 매체를 제거합니다. 감염되지 않은 제어 우물에 일반 식세포 매체의 1 ML을 추가 (B1 - B3, C1 - C3). 웰스 A1에 살모넬라 균 현탁액 1 ML을 추가 - A5는 셀 당 10 세균의 감염 (MOI)의 다양성에 도달 할 수 있습니다. </li><li> 감염을 동기화하기 위해 37 ° C에서 300 XG에 15 분 동안 플레이트를 원심 분리기. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 겐타 마이신 외 살모넬라 균을 죽이는. <ol><li> 1 시간 후 감염에, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 모든 우물에 세포 외 박테리아를 죽일 1 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신을 포함하는 대 식세포 매체의 0.1 ml를 추가합니다. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 세포를 세척. <ol><li> 2 시간 게시물 감염에서 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 10 μg의 / ㎖를 포함하는 신선한 식세포 매체의 1 ml의 각 웰 배를 씻어 방지하기 위해 겐타 마이신남아있는 세포 외 박테리아의 성장. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 세제 및 항체와 신선한 버퍼를 준비. <ol><li> 다만 분석 원하는 시점 전에 1 밀리그램 / KHM 완충액 ㎖ (110 mM의 아세트산 칼륨, 20 mM의 HEPES, 2 mM의의 MgCl 2, 7.3의 pH)에서의 디기 토닌 신선한 스톡 용액을 제조 하였다. 주식 필터 및 50 μg의 / ㎖의 작업 농도 KHM 버퍼에 희석 디기 토닌의. </li><li> 또한, KHM 완충액 0.1 % 사포닌 용액을 준비 살모넬라 항 -FITC (CSA-1는 0.1㎍ / ㎖) KHM 완충액 1/100에서 1/100 또는 항 PDI에서 안티 calnexin이 보충 된 3 % BSA (항체 농도 재료 표 참조). </li></ol></li><li> 세포 투과성으로. <ol><li> 인큐베이터에서 접시를 제거하고 세척 우물은 KHM 버퍼의 0.5 ㎖로 (37 ° C로 미리 예열) 배. KHM 버퍼를 제거하고 0.25 ㎖의 일반 KHM 버퍼를 추가웰스 A1에 디기 토닌과 우물 A4와 B1 / C1, KHM 버퍼 - A3 및 B2 / 사포닌과 C2 또는 KHM 버퍼 웰스 A5과 B3에 / C3 (표 1 항). 모든 우물이 KHM 버퍼의 0.5 ㎖로 3 배 씻어 즉시 실온에서 정확히 1 분 동안 품어 (37 ° C로 미리 예열). </li></ol></li><li> 차 항체 염색. <ol><li> KHM 버퍼를 제거하고 적절한 우물 (그림 2, 표 1)에 차 항체 솔루션 (염소 항 살모넬라 CSA1-FITC, 250 μL / 웰, 0.1 μg의 / ㎖)를 추가합니다. 37 ℃ 배양기에서 15 분 동안 플레이트를 인큐베이션, 5 % CO 2. 1 ml의 PBS로 세척 배. </li></ol></li><li> 고정. <ol><li> PBS를 제거하고 PBS에 PFA 4 %의 250 μl를 추가합니다. 37 ℃에서 10 분 동안 품어. </li><li> 우물은 1 ml의 PBS로 2 배 세척 및 정착을 해소하기 위해 10 분 동안 PBS 0.1 M 글리신의 250 μl를 추가합니다. 워시 웰 PBS 1 ㎖로 2 배. </li></ol></li><li> 합계감염된 샘플의 살모넬라 균 염색. <ol><li> 물로 0.1 % 사포닌 / 3 % BSA와 함께 PBS와 배를 커버 슬립 및 안티 CSA1 항체 샘플 배양을 1 시간 동안 (염소 항 CSA1는 0.1 ㎍ / ml의 마우스 항 - LPS는 0.1 μg의 / ㎖으로 잘 작동) 사포닌 0.1 % / 3 % BSA와 함께 PBS에서 RT에서. </li><li> 0.1 % 사포닌 / 3 % BSA와 PBS에 세척 배. 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 0.1 % 사포닌 / 3 % BSA와 PBS에 선택의 형광에 결합 된 보조 항 염소 항체로 샘플을 품어. </li><li> 워시는 1 ml의 PBS로 3 배를 커버 슬립과 DAPI (1.5 μg의 / ml)로 매체를 장착에서 분석 된 커버를 탑재합니다. </li></ol></li><li> 현미경 분석. <ol><li> 세포질 살모넬라 (양의 항 살모넬라 -FITC) 총 살모넬라 (더블 플러스) (그림 5)를 계산하여 공 초점 현미경으로 데이터를 수집. 투과성으로 컨트롤을 보여해야합니다 비 투과성이 세포 Calnexin들에 대한 염색을디기 토닌 - 투과성이 세포와 사포닌 투과성이 세포 PDI 염색에 대한 이닝 (그림 4). 웰스 A4와 A5는 살모넬라 오염에 대한 내부 통제를 제공합니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Keller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+measurements+of+vacuolar+rupture+caused+by+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens.</a> J Vis Exp. , e50116(2013).</li>
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차동 투과성으로 분석하고 액포 구획과 세포질 사이의 세균성 병원균의 세포 내 분포를 정량화 할 수있는 쉽고 강력한 방법입니다. 같은 분석은 Francisella novicida 2,4와 시겔 flexneri (12) 박테리아에 성공적으로 사용되어왔다. 많은 세포 내 병원체 변경하거나 호스트 endomembrane 구조를 수정하기 때문에, 디기 토닌의 투과성으로의 견고성은 개별적으로 결정되어야 할 것이다. 해야 할 수 있습니다 사용되는 병원체 또는 셀 라인에 측면에서 분석의 미세 조정. 분석은 단지 감염 생물에 한정되지 않고, 또한 세포 사멸이 17,18 시그널링 같은 다른 세포 생물학적 응용에 사용될 수있다. 이 분석의 핵심은 특정 세포 내 세포막 덜 CHO를 포함에서 세포막과 세포 막은, 다른 지질 조성물을 가지고있다lesterol. 디기 토닌 복잡한 콜레스테롤 따라서 리드 투과성으로...

세균 세포 내 병원체를 직접 숙주 세포의 세포질 또는 전문 액포 구획 중 하나에 복제. 감염의 초기 단계에서 대부분의 병원균 (예 : 대 식세포) 또는 능동적으로 비 식세포로 자신의 흡수를 촉진하여 전문화 된 세포에 의한 식균 작용에 의해 내재화를 얻는다. 식세포에서 phagosome 정상적으로 포식 입자 소화 degradative 구획을 형성 리소좀과 융합한다. 이러한 Francisella novicida 또는 시겔 flexneri 같은 전문 세포질 박테리아는 phagosome의 파열을 유도하여 phagosomal 저하를 탈출 이후 세포질 2,3로 탈출. 이는 액포 파열 2-4을 촉진 이펙터 단백질을 주입 Francisella 병원성 섬 (FPI) 또는 시겔 flexneri T3SS, 같은 독성 관련 메커니즘을 필요로한다. 숙주 세포의 세포질 기능일반적 병원체의 존재를 인식하고 5 시그널링 선천성 면역을 유도 보존 패턴 인식 수용체의 수. 또한 xenophagy, 자식 작용의 항균 형태 세포질을 입력 세균을 저하 할 수있다. 박테리아 세포질 통상 잘 무딘 또는 다른 전략을 사용하여이 반응을 회피하도록 구성되어있다. 예를 들어, Francisella 호스트 인식을 피하기 위해 LPS를 수정하고 시겔은 분비 이펙터 단백질 6,7를 사용하여 자식 작용 모집을 방지 할 수 있습니다. 리소좀 저하를 탈출하는 또 다른 전략 모델 액포 병원체 살모넬라 엔테 혈청 형 티피 뮤 리움에 의해 고용되어, 그 후 살모넬라 티피 무리 움라고도합니다. 살모넬라 균은 세포 내 틈새 시장에 초기 phagosome 개조 이펙터를 주입하는 T3SS를 사용, 살모넬라 공포 (SCV) 함유 8,9. 호스트 경로의 연속 조작이다필요는 공포에 지질 및 기타 영양소를 보충하여이 공포를 유지합니다. 실제로, 살모넬라 SIFA 돌연변이 액포 안정성을 유지하는 데 실패하고 선천성 면역 경로와 자식 작용 모집 (8)의 활성화를 초래 감염 후 시간 이내에 숙주 세포의 세포질을 입력한다. 살모넬라 공포 성 탈출 연구하다 세포 유형에 따라 다양하고, 여러 가지보고 상피 세포에서도 WT 살모넬라 세포질 10 SCV 및 hyperreplicate 벗어날 수 있다는 것을 보여 주었다. 최근 보고서는 액포 병원균의 선천성 면역 검출도 인식하고 병원체 함유 액포 (PCVs) 11 ~ 14를 불안정하게 할 수있는 호스트의 능력에 달려 있음을 보여준다. 호스트 또는 박테리아 모두 유전자형 액포와 세포질 구획 사이의 세포 내 박테리아의 분포에 영향을 미칠 수 있음을 감안할 때, 그것은 액포 대들의 수를 정량화하는 것이 필요하다세포질 박테리아. , 이후 가장 실험 셋업에서 숙주 세포는 다른 세포 내 구획에서 여러 박테리아를 가질수이어서 하나 이상의 박테리아로 감염되고, 기술은 단일 박테리아의 수준을 정량화 허용하는 필요하다. (또한 phagosomal 보호 분석라고도 함) 차동 투과성으로는이 해상도 2,4,10,12를 제공합니다. 분석은 그대로 액포 막 잎 세제 디기 토닌와 숙주 세포 혈장 막의 선택적 투과성으로 기반으로하며, 따라서 항체의 선택적 박테리아 세포질 염색을 허용한다. 여기에서 우리는 차동 투과성으로를 사용하여 세포질과 액포 살모넬라 균의 정량이 프로토콜을 제공합니다. 이 방법의 원리는 그림 1에 설명되어 있습니다 : 골수 유래 대 식세포 (BMDMs)은 정지상이 살모넬라 균을 mCherry 발현에 감염된다. 고정상 살모넬라 균은 T가 필요그들이 활성 그렇지 NLRC4의 inflammasome을 인식하고 BMDMs 15의 신속한 세포 사멸 (pyroptosis)를 유도 할 것이다 T3SS SPI-1의 발현을 하향 조절하기 때문에 O 사용될. 세포를 세척하고 1 분간의 디기 토닌를 50㎍ / ㎖로 처리하여 감염에 이어. 세포를 다시 세척하고, 즉시 세포질에 접근 박테리아 마크 FITC 결합 항 살모넬라 항체와 함께 배양한다. 단계의 세포가 용해되어 추가 세척 및 mCherry + (액포)과 FITC + / mCherry + (세포질) 박테리아의 비율 후 FACS에 의해 결정된다. 우리는 또한 더 형광 단백질 발현 균주를 사용할 수는 (그림 2)없는 경우에 사용할 수있는이 방법의 적응을보고합니다. 추가 단계는 세포 투과성이 완전히 고정되는 FITC 표지 후에 도입된다. 그 후 모든 박테리아는 항 살모넬라 항체 및 해당 이차 항체로 염색된다. DETection은 다음 대신 FACS 분석의 현미경으로 이루어집니다.

<table><tbody><tr><td>디지토닌</td><td>시그마</td><td>D5628</td><td>50 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>PFA</td><td>mpbio</td><td>219998380</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 아세테이트</td><td>시그마</td><td>791733</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>안티 살모넬라 CSA-1-FITC</td><td>KPL</td><td>01-91-99-MG</td><td>1/500</td></tr><tr><td>anti-Salmonella CSA-1</td><td>KPL</td><td>02-91-99-MG</td><td>1/500</td></tr><tr><td>anti-Calnexin</td><td>Enzo Lifesciences</td><td>SPA-860D</td><td>1/100</td></tr><tr><td>anti-PDI</td><td>Enzo Lifesciences</td><td>SPA-890</td><td>1/100</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 마운팅 매체</td><td>Vectorlabs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Anti Rabbit 항체-488</td><td>분자 프로브</td><td>A-11070</td><td>1/500</td></tr><tr><td>글리신</td><td>시그마</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15710-49</td><td>100 &mu; g/ml 및 10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Amimed</td><td>5-13K00-H</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td>이미징 63X</td></tr><tr><td>FACS Fortessa</td><td>BD 기술</td><td></td><td>검출 mCherry 610 nm</td></tr><tr><td>FACS Fortessa</td><td>BD 기술</td><td></td><td>검출 FITC 530 nm</td></tr></tbody></table>

공포 성 대 세포질의 정량화<em&gt; 살모넬라</em&gt; 차동 투과성으로하여 기본 대 식세포에서

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

세포 내 세균 병원체는 세포질 또는 전문 병원체 함유 액포 (PCVs)에 복제 할 수 있습니다. 세포질에 도달하기 위해, 시겔 flexneri 및 Francisella novicida 같은 박테리아는 phagosome의 파열을 유도 할 필요가있다. 대조적으로, 살모넬라 티피 무리 움 살모넬라 함유 액포 (SCV)라고도 액포 구획에 복제. 그러나 특정 살모넬라 돌연변이 SCV 무결성을 유지하는 데 실패함으로써 세포질로 방출된다. 세균의 하나의 레벨에 액포 박테리아 대 세포질의 비율은 phagosome 보호 분석법으로 알려진, 미분 투과성으로하여 측정 할 수있다. 접근 방식은 세제 디기 토닌의 재산의 사용이 선택적으로 콜레스테롤을 결합 할 수 있습니다. 세포막 다른 세포막 이상의 콜레스테롤을 포함하고 있으므로, 디기 토닌는 세포 막을 남기고 선택적으로 세포막을 Permeabilize 하시려면하는데 사용될 수있다그대로. 형광 마커 단백질 (예 중에서도 mCherry)를 발현하는 병원체 간략히, 다음의 감염, 숙주 세포의 세포막을 함유 디기 토닌 완충액으로 짧은 인큐베이션으로 투과성이있다. 세포를 세척하고 배양 한 다음 선택의 세균에 대해 유도 (원하는 형광 물질에 결합) 일차 항체 (예, 항 -FITC 살모넬라) 다시 세척한다. 도장이 박테리아가 사용되는 경우, 부가적인 단계가있는 모든 막을 투과 가능하며 모든 박테리아에는 해당 항체로 염색 할 수있다. 염색 후, 액포와 세균의 세포질 비율은 단일 또는 이중 양성 이벤트를 카운트하여 FACS 또는 현미경에 의해 정량화 될 수있다. 여기에서 우리는 박테리아 살모넬라 티피 무리 움이 기술의 사용을위한 실험적인 세부 사항을 제공합니다. 이 분석의 장점은 다른 분석 달리, 그것이 단일 bacte의 수준 정량을 제공한다는 것이다RIA, 현미경으로 분석 한 경우, 소정의 셀에서의 세포질과 액포 박테리아의 정확한 숫자를 제공한다.

도 1 및도 2는도 1 및 프로토콜이 프로토콜은 프로토콜의 중요한 단계 및 수득 한 결과를 나타내는 디기 토닌에 기재된 분석법의 회로도를 도시한다. 3 FACS 전형적인 결과를 나타낸다. 긍정적이고 부정적인 컨트롤은 mCherry + / FITC- 박테리아 (액포 살모넬라) 및 mCherry + / FITC + 박테리아 (세포질 살모넬라 균)의 게이트를 설정하는 데 사용됩니다. 이들 게이트에 근거 세포질과 액포 세균의 비율은 실험 샘플에서 결정될 수있다. 이 예에서 우리는 야생 형 및 ΔsifA 살모넬라 균을 비교했다. 그림 3은 mCherry + 살모넬라 티피 무리 움 야생형 및 골수 유래 쥐의 대 식세포에 ΔsifA 돌연변이로 얻은 대표적인 데이터를 보여줍니다. 그림 4는 일반적인 Calnexin (A)와</str...

우리는 차등 디지토닌 투과화를 사용하여 골수 유래 대식세포에서 세포질 및 액포 Salmonella typhimurium의 정량화를 설명합니다.

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

다음 실험의 전반적인 목표는 감염된 골수 유래 대식세포 내에서 세포질과 액포에 존재하는 Salmonella Typhi의 비율을 결정하는 것입니다. 이는 M-cherry를 발현하는 Salmonella Typhi aerium으로 대식세포를 감염시켜 달성됩니다. 두 번째 단계로, 세포에 세제인 Triton X-100을 처리하여 액포 막은 투과시키지 않고 세포질 막만을 투과성으로 만듭니다.다음으로 세포를 Fluorofor Zi가 결합된 항살모넬라 항체로 염색합니다. 세포질 내의 Salmonella Typhimurium을 표지하기 위해, 형광 활성 세포 분류법(FACS)을 기반으로 전체 박테리아 중 세포질 내 박테리아의 백분율을 측정합니다. 이러한 방법은 세포 내 병원균이 액포(vacuole) 내에서 증식하는지 또는 세포질에서 증식하는지와 같이 병원균 상호작용 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 개별 조건에 맞추기 위해 감염 하루 전날, 스트렙토마이신과 암피실린이 첨가된 3 mL의 Luria-Bertani 배지에서 37 °C 쉐이커를 이용해 박테리아 균주를 하룻밤 동안 배양합니다. 감염을 위해 세포를 플레이팅할 24웰 플레이트의 웰에 컨트롤로 사용할 커버슬립을 추가합니다. 야생형 골수 유래 대식세포(BMDMs)를 1 mL의 일차 대식세포 배지에서 웰당 0.125 x 10⁶ cells의 밀도로 분주한 후, 37 °C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 인산 완충 식염수로 희석한 배양액의 600nm에서의 광학 밀도 또는 OD 600을 측정하여 하룻밤 동안 배양한 salmonella의 농도를 결정합니다. 이는 OD 600이 분광광도계의 선형 범위 내에서 측정되도록 하기 위함입니다.밀리리터당 살모넬라(salmonella) 농도를 계산하며, OD 600 수치 1은 10억 개에 해당합니다. 세포에 살모넬라를 감염시키기 위해, 대식세포 배지에서 박테리아를 희석하여 살모넬라 농도를 밀리리터당 125만 개로 맞춥니다. B MDM에서 배지를 제거합니다.감염되지 않은 대조군 웰인 B1~B3 및 C1~C3에 대식세포 배지 1 mL를 추가합니다. 그다음, 세포당 박테리아 감염 다중도(MOI)가 10이 되도록 A1~A5 웰에 살모넬라 현탁액 1 mL를 추가합니다. 감염을 동기화하기 위해 플레이트를 37°C에서 300 ×g로 15분 동안 원심분리한 후, 플레이트를 37°C, 5% CO2 조건의 인큐베이터로 옮겨 감염 후 1시간 동안 배양합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내 세포 외 박테리아를 제거하기 위해 Gentamycin이 포함된 대식세포 배지 0.1 mL를 추가합니다.모든 세포가 동일하게 처리되도록 감염되지 않은 대조군을 포함한 모든 웰에 gentamycin을 첨가합니다. 그 후, 감염 2시간 후에 플레이트를 37 °C, 5% CO2 인큐베이터로 옮깁니다. 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내고, 모든 웰을 예열된 docos, modified eagles medium 또는 DMEM 1 mL로 2회 세척합니다.분석 예정 시간 직전에 플레이트를 인큐베이터로 다시 옮기기 전, 남아있는 세포 외 박테리아의 성장을 방지하기 위해 DMEM을 gentamicin이 포함된 예열된 대식세포 배지로 교체하십시오. digitonin이 포함된 KHM 완충액과 saponin이 포함된 KHM 완충액 및 신선한 KHM 완충액 용액을 준비하십시오. 세포 투과화를 수행하기 위해 텍스트 프로토콜에 기술된 항체 용액 외에, 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내고 0.5 mL의 예열된 KHM 완충액으로 웰을 3회 세척하십시오.그 다음 KHM 버퍼를 제거하고, 웰 A4, B1 및 C1에 일반 KHM 버퍼 0.25 milliliters를 첨가합니다. 웰 A1~A3, B2 및 C2에는 digitonin이 포함된 KHM 버퍼를, 웰 A5, B3 및 C3에는 saponin이 포함된 KHM 버퍼를 첨가합니다. 실온에서 정확히 1분 동안 배양한 후, 즉시 모든 웰을 예열된 PREWARM KHM 버퍼 0.5 milliliters로 3회 세척합니다. 마지막으로, KHM 버퍼를 제거하고 해당 웰에 1차 항체 솔루션을 첨가한 후, 37 °C 및 5% CO2 조건에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후, 웰 A1~A5의 감염된 세포를 1 milliliters의 PBS로 1회 세척합니다.PBS로 세포를 세 번 세척하여 FACS 분석을 준비합니다. 그런 다음 0.1% Triton이 포함된 얼음처럼 차가운 PBS 0.5 milliliters를 첨가합니다. 다음으로, 샘플을 얼음 위에 유지하면서 세포 응집체를 제거하기 위해 세포 스트레이너 캡이 달린 5 milliliters FACS 튜브로 세포 현탁액을 옮깁니다.완전 투과 대조군을 사용하여 유세포 분석기로 샘플을 분석합니다. 전방 산란광(forward scatter), 측방 산란광(side scatter) 및 mCherry 신호를 기반으로 총 박테리아에 대한 게이트를 설정합니다. 다음으로, 완전 투과 및 비투과 대조군을 사용하여 총 박테리아 집단 내의 fitz 신호를 분석하고, 설정된 게이트를 통해 세포질 박테리아와 액포 박테리아에 대한 게이트를 설정합니다.FlowJo 소프트웨어를 사용하여 샘플을 분석하고 세포질 내 박테리아와 액포 내 박테리아의 백분율을 결정합니다. B1~B3 및 C1~C3 웰의 비감염 투과성 대조군에 대한 제조사 프로토콜에 따라, PBS를 제거하고 4% Paraform aldehyde in PBS 250 µL를 첨가한 후 37 °C에서 10분 동안 배양하여 현미경 관찰을 준비합니다. 웰을 1 mL의 PBS로 2회 세척하고, 고정액을 중화시키기 위해 0.1 M glycine in PBS 250 µL를 첨가하여 10분 동안 처리한 다음, 웰을 1 mL의 PBS로 2회 세척하여 2차 항체 염색을 수행합니다.0.1% saponin과 3% BSA가 첨가된 PBS 내에서 적절한 형광 표지 2차 항체를 사용하여 투과성 대조군을 실온에서 1시간 동안 염색합니다. 세포를 완전히 투과시키기 위해 커버슬립을 1 mL의 PBS로 3회 세척하고, DAPI가 포함된 마운팅 용액을 사용하여 분석을 위해 커버슬립을 마운팅합니다.공초점 형광 현미경을 사용하여 40x 또는 63x 배율로 대조군이 포함된 커버슬립을 분석합니다. 여기에 전형적인 결과가 제시되어 있습니다. 양성 및 음성 대조군 결과는 세포질에 존재하는 m cherry 양성, FITC 양성 박테리아(살모넬라)와 액포 내에 존재하는 m cherry 양성, FITC 음성 살모넬라를 구분하기 위한 게이트를 설정하는 데 사용됩니다.이러한 게이트를 기반으로 실험 샘플 내 세포질 및 액포 내 박테리아의 비율을 결정합니다. 본 예시에서는 mCherry 양성인 Salmonella typhimurium 야생형과 CA 결손 돌연변이형을 비교하였습니다. 여기에 표시된 것은 digitonin 또는 saponin으로 처리한 투과성 대조군에서 얻은 calnexin 및 PD-1 염색 결과입니다. calnexin은 ER 막 단백질이므로, digitonin 및 saponin 투과 세포 모두에서 세포질 전반과 핵 주변으로 calnexin 염색이 관찰됩니다. digitonin 투과 대조군에서는 PD-1 염색이 관찰되지 않습니다.Sasin 및 perme 세포에서 염색을 관찰할 수 있습니다. 여기서는 tonin으로 투과화된 세포의 salmonella 항체 염색 결과가 나타나 있습니다. 전체 박테리아는 빨간색으로, 세포질 내 박테리아는 초록색으로 표시됩니다.E 양성 군집은 세포질에 접근 가능한 살모넬라입니다. 반면, fite 음성 군집은 온전한 살모넬라 함유 액포(SCV) 내에 상주하는 박테리아이며, 따라서 여기서는 살모넬라 FSE 라벨링으로부터 보호됩니다. 여기서는 야생형 살모넬라를 CFE 결손 돌연변이 균주와 비교합니다. CA는 살모넬라가 SCV의 무결성을 유지하는 데 필수적이므로, 더 높은 비율의 살모넬라가 관찰됩니다. 이 영상을 시청하고 나면 액포 및 세포질 내 박테리아의 비율을 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

quantification-cytosolic-vs-vacuolar-salmonella-primary-macrophages

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 문서에서는 RAW 264.7 세포에 의한 polyanhydride의 nanoparticles이나 박테리아의 내면화를 수치 멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법을 활용한 방법을 설명합니다.

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

이 동영상은 골수 유래 대식세포(BMM)에서 기생충의 세포 내 성장을 정량화하는 분석을 보여줍니다. 대식세포 세포는 각각 리슈마니아(Leishmania)의 운동성 및 비운동성 침습 단계(motile and non-motile invasive stages), 메타고리 전구세포(metacyclic promastigotes) 및 무산소세포(amastigotes)에 감염되어 있습니다. 기생충은 대식세포에 침입하여 기생 액포(parasitophorous vacuole)로 내면화되어 내부에서 증식합니다. 세포 내 기생충 성장은 대식세포와 기생충 핵을 형광 염색할 때 현미경을 사용하여 정량화합니다.

대식세포에서 기생충의 세포 내 성장을 정량화하기 위한 In vitro 분석

이 비디오는 차등 투과화를 사용하여 골수 유래 대식세포 내부의 세포질 및 액포 Salmonella typhimurium을 정량화하는 분석을 보여줍니다. 대식세포는 형광 단백질을 발현하는 살모넬라균(Salmonella)에 감염되어 있으며, 이 물질은 살모넬라균 함유 액포 또는 SCV라고 하는 특수 액포 구조 내부에 내재되어 있습니다. 박테리아의 하위 집합은 SCV를 탈출하여 세포질로 들어갑니다. 콜레스테롤이 풍부한 대식세포의 원형질막은 디지토닌(digitonin)을 사용하여 투과화되어 SCV는 손상되지 않습니다. 세포질 박테리아를 형광 표지 항체로 라벨링하면 액포 및 세포질 박테리아의 비율이 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 정량화됩니다.

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우리는 endomembrane 파열을 추적하는 방법을 설명하면 세포 내 박테리아에 의해...

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

체외 표현형 살모넬라 또는 다른 세균성 협회, 침윤 및 높은 처리량과 식세포에서 복제에 높은 처리량 분석이 개발되었다. 방법은 호스트 병원체 상호 작용에서의 침범 위해 살모넬라 유전자 녹아웃 돌연변이 균주를 평가하기 위해 사용 하였다.

표현형 높은 처리량 분석 살모넬라 엔테 티피 뮤 리움 협회, 침략, 그리고 대 식세포에서의 복제

이 문서에서는 합성 및 나노 입자의 형광 라벨 NPS ()하는 방법을 설명합니다. NPS는 진핵 세포의 엔도 - 리소좀 시스템에 레이블을 펄스 - 체이스 실험에 적용되었다. 세포 내 병원균 살모넬라 엔테의 활동에 의한 엔도 - 리소좀 시스템의 조작은 라이브 세포 이미징 및 정량화 따랐다.

형광 나노 입자의 응용 프로그램은 세포 내 세균에 의해 엔도 - 리소좀 시스템의 리모델링을 연구하기 위해

여기 살 모 넬 라 typhimurium의 격리에 대 한 간단 하 고 빠른 방법 설명-비타민 b 복합체와 streptavidin 박테리아를 코팅 하 여 세포에서 phagosomes를 포함 하.

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모든 병원 성 Leishmania 종 있으며 그들의 척추 호스트의 세포 내부 복제. 여기, 선물이 Leishmania, 세포내 성장 속도의 정확한 정량화 다음으로 문화 murine 골 수 유래 세포를 감염 하는 프로토콜. 이 메서드는 호스트 병원 체 상호 작용 및 Leishmania 독성에 영향을 미치는 개별 요소를 공부 하는 데 유용.

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여기, 우리 향상 된 녹색 형광 단백질 표현 대장균을 사용 하 여 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해 프로토콜을 제시.

녹색 형광 단백질 표현 하는 향상 된 사용 하 여 대장균 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해

살모넬라 균 은 살모넬라 특이 적 액포와 세포질에서 자유 (과다 복제) 모두에서 장 상피 세포 내부를 침범하고 복제합니다. 고처리량 형광 현미경 기반 프로토콜은 ImageJ를 통한 두 가지 보완 이미지 분석을 통해 살모넬라균 의 세포 내 표현형을 정량화하여 단일 세포 분해능 및 스코어링에 도달하기 위해 여기에 설명되어 있습니다.

ImageJ를 이용한 살모넬라균 의 세포내 표현형 자동 분석

배우세요 뼈수파유래대식세포에서 디지토닌 차투과성을 이용한 세포질 및 소포체 내 살모넬라 정량화 방법입니다. FACS 분석으로 병원체 위치를 정확히 판별하여 숙주-병원체 상호작용 연구에 활용할 수 있습니다.

공포 성 대 세포질의 정량화

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