Name: 편광 신경 조직의 엔지니어링 3D 실크 콜라겐 기반 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 배우세요 실크-콜라겐 기반 3D 신경 조직 모델링 기법을 활용한 뇌 유사 구조체 공정법. 소금 침출법으로 다공성 실크 스캐폴드를 제작하고 일차 대뇌피질 신경세포를 배양하여 신경망 형성과 축삭 성장을 연구할 수 있습니다.

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배아 쥐의 뇌 조직을 제공해 주신 스티븐 모스(Stephen Moss) 박사의 실험실에 감사드립니다. M.D.T.가 최초의 프로토콜을 설계했습니다. 이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) P41 조직 공학 자원 센터 보조금 EB002520의 지원을 받았습니다. K.C.는 독일 연구 재단(DFG)의 박사후 연구원(CH 1400/2-1)의 지원을 받았습니다.

뇌 조직 분리 프로토콜은 터프 츠 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인과 관리 및 사용 실험 동물의 (기관 동물 관리 및 사용위원회 B2011-45)에 대한 건강 가이드의 국립 연구소에 부합했다. 1. 실크 비계 준비 <ol><li> 누에 나방의 고치에서 실크 용액의 조제는 이전에 19, 20 설명한대로. <ol><li> 가위를 사용하여 8 개의 동일한 조각으로 각각의 누에 고치를 잘라. 조각난 고치 5 g을 약 11 고치를 사용합니다. (15 분) </li><li> 0.02 M 나 2 CO 3 용액 2 L를 준비하고 핫 플레이트를 사용하여 끓여야 가져. (15 분) </li><li> 조각난 고치의 5g의 무게를 30 분 동안 나 2 CO 3 용액을 끓인다. 주걱으로 끓는 실크에게 분에 한 번씩 저어. 또한 디 씹고라는이 단계는 친수성 ​​단백질 sericins에서 실크 피브로인 정화. (30 분) </li><l난&gt; 손으로 피브로인을 짜서 남아있는 세리신 및 화학 물질을 씻어 증류수에 적어도 세 번을 씻어. (5 분) </li><li> 페트리 접시에 젖은 피브로인을 놓고 흐름 후드 O / N에서 피브로인 추출물을 건조. </li><li> 다음 날은 건조 피브로인 질량의 무게와 유리 비커에 피브로인을 배치합니다. (15 분) </li><li> (4)에 의해 건조 피브로인의 질량을 곱하여의 LiBr 9.3 M의 LiBr 용액 (ML)에 필요한 양을 계산에 피브로인을 용해하기 위해 천천히 실크 피브로인 위에의 LiBr 용액을 붓고 주걱을 사용하여 모든 피브로인 섬유 젖어. 증발을 방지하고, 섬유를 용해 할 수 있도록 4 시간 동안 60 ° C에서 배치하는 비이커 커버. (15 분) </li><li> 주사기를 사용하여, 비커로부터 피브로인 용액을 수집하고 3500 MWCO 투석 카세트에 적재. 48 시간 동안 증류수에 대해 투석을 수행합니다. 물을 시간의 각 한 쌍을 변경합니다. </li><li> 주사기를 사용하여, 발 피브로인 수용액을 수집20 분 동안 4 ℃에서 9,000 RPM (~ 12,700 XG)에서 두 번 50 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 카세트. 각각의 원심 분리 단계 이후에 새로운 튜브에 뜨는을 붓고 펠렛을 폐기합니다. (40 분) </li><li> 건조 중량을 추정하여 피브로인의 농도를 측정한다. 무게 배에 실크 용액 1 ㎖를 붓고. 2 시간 동안 60 ℃의 오븐에서 샘플을 건조. 건조 실크 피브로인을 달아 실크 (100)에 의해 용액의 농도를 예상 얻어진 가중치를 곱하여 실크 피브로인 수용액의 농도를 계산하는 단계 6-9%이다 (W / V). </li><li> 증류수에 희석하여 (V / W)은 6 %로 실크 농도를 조정한다. 정류소 : 액체 실크 피브로인은 밀폐 용기에서 한 달 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 실크 솔루션에서 다공성 지지체의 제조. <ol><li> 과립은 이후 단계에서 사용될 500-600 μm의, 크기가 별도의 NaCl을 과립 체. 과립 폐기S는 500 μm의 아래에 600 μm의 위의 크기. (15 분) </li><li> 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 금형 (도 1)로 6 % 실크 용액 30 ㎖를 붓는다. 부드럽게 실크 통해 체질의 NaCl 60g을 산란. 소금의 균일 한 층을 얻기 위해 용기를 누릅니다. 실크 중합 실온에서 48 시간을 품어. </li><li> 중합을 완료하고 남은 액체를 증발시켜 60 ℃에서 1 시간 동안 오븐에서 골격 함유 PTFE 금형을 배치. </li><li> 염을 걸러 48 시간 동안 증류수 2 L를 넣은 비커에 PTFE 몰드의 콘텐츠를 배치했다. 물을 하루에 2 ~ 3 시간을 변경합니다. . 염이 완전히 정지 시점 침출시 몰드로부터 스폰지 지지체를 제거 스폰지가 탈수 비계 않도록 밀폐 용기 내에서 39 ° C의 물에 침지하여 저장 될 수있다. </li><li> 준비가되면, 5mm 직경 생검 펀치와 비계를 잘라. 높이 약 2mm 도달하는 발판을 중고 컷. 푸2mm 직경 생검 펀치 (그림 2A)와 발판의 중심을 NCH. (1 시간) </li><li> . 정지 점 (습식주기 121 ° C, 20 분)들을 살균 물에 침지하여 지지체를 압력솥 ​​: 스폰지가 탈수 비계 않도록 밀폐 용기 내에서 39 ° C의 물에 침지하여 저장 될 수있다. </li><li> 계획된 세포 파종하기 전에, 멸균 0.1 ㎎ / ㎖ 폴리 -D- 라이신 (PDL) 솔루션의 발판을 담그지. 37 ℃에서 1 시간 동안 품어. </li><li> 비계가 결합되지 않은 PDL을 제거하는 인산염 완충 식염수 (PBS)로 3 배 씻으십시오. (30 분) </li></ol></li></ol> 쥐 두피 뉴런 2. 분리 <ol><li> 승인 동물 프로토콜을 수득 한 후 이전과 Pacifici Peruzzi (27)에 의해 기술 된 바와 같이 태아 일부터 18 (E18) 흰쥐 피질을 해부. (2 시간) </li><li> (3)에서 20 분 동안 (소 췌장)에서 0.3 %의 DNase I 0.25 % 트립신 5 ml의 10 피질을 부화7 ° C. </li><li> 1 ㎎ / ㎖ 대두 단백질의 동일한 양을 첨가함으로써 트립신을 비활성화한다. </li><li> 단일 세포 현탁액이 생성 될 때까지 최대 10 ㎖ 피펫 팅 파스퇴르 피펫을 사용하여 피질 아래로 20 번 씹다. 부드러운하고 기포 형성을 피할 것. (10 분) </li><li> 5 분 동안 127 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 다시 일시 배지 10ml에 세포 펠렛을 (로 Neurobasal 배지, 1X B27 보충제, 1X 루타, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신). 세포를 계산합니다. 예상 세포 농도는 약 2 × 7 / ㎖이다. (20 분) </li></ol> 3. 조립 및 문화를 구축 <ol><li> 세포와 비계 파종. <ol><li> 세포 배양 후드 내부 살균 비계와 필요한 모든기구를 이동합니다. 사용 멸균 집게는 96 웰 세포 배양 플레이트에 웰 당 골격은 하나의 골격을 할당하는 배치. (10 분) </li><li> 그들 전에 종자를 셀에 평형화 세포 배양 배지에 담가 비계ING. 37 ℃에서 1 시간 동안 품어. (10 분) </li><li> 지지체로부터 매체의 과잉 대기음. </li><li> 세포 현탁액 / 비계의 100 μl를 적용합니다. (10 분) </li><li> 지지체에 세포 부착을 허용하도록 37 ° CO / N에서 세포를 품어. </li><li> 다음 아침에 비 부착 세포를 대기음 200 μL / 웰의 신선한 배양액을 적용합니다. (10 분) </li></ol></li><li> 콜라겐 매트릭스에 포함 비계. (2 시간) <ol><li> 나는 얼음에 콜라겐 10 배 PBS, 물, 1 N NaOH를 쥐 꼬리를 놓습니다. 제조업체의 지침에 따라 콜라겐의 작업 솔루션을 준비합니다. 셀 시드 구조 (1 시간까지) 준비가 될 때까지 얼음에 유지한다. </li><li> 인큐베이터에서 셀 시드 실크 구조를 제거하고 매체의 초과를 대기음. </li><li> 사용 멸균 집게는 잘 판에 빈 우물에 비계를 전송하고 3 ㎎ / ㎖ 콜라겐 용액 100 ㎕를 각 발판을 담그지. 다시 조직 배양 플레이트를 배치인큐베이터에서 30 분 콜라겐의 중합을 허용하는. </li><li> 웰 / 예열 세포 배양 배지 100 μl를 적용한다. 일주일 배양 배지의 절반 체적을 대체하여 매일 배지를 변경하기위한 구조. </li></ol></li></ol> 4. 현미경 분석 <ol><li> 라이브 / 죽은 염색 (1 시간) <ol><li> 요오드화 프로피 듐 (PI) 증류수에 1 ㎎ / ㎖ (1.5 밀리미터)의 주식 솔루션을 준비합니다. </li><li> 아세톤 플루 오레 디 아세테이트 (FDA) 2 ㎎ / ㎖의 주식 솔루션을 준비합니다. </li><li> PBS에 희석하여 10 μm의 파이 0.15 μm의 FDA를 포함하는 작업 솔루션을 준비합니다. 수욕 중에서 37 ℃까지 용액을 미리 가온. </li><li> 혈청 에스 테라 제를 제거하기 위해 미리 예열 PBS로 세포를 씻으십시오. PBS를 대기음. </li><li> 2 분 동안 세포에 미리 예열 작업 솔루션을 적용하고 PBS로 씻어. </li><li> FDA 전 λ = 490 N; 이미지에 epifluorescent 현미경을 사용하여 세포 (PI의 전 λ = 490 nm의은, EM λ는 570 nm의 =m은, EM λ)는 514 nm의 =. 얼룩은 40 분에 걸쳐 안정적으로 유지. 장시간 염색 PI의 세포에 의한 흡수와 세포에서 PI / FDA의 공동 지방화에 따른 불특정 오염의 원인이 될 수 있습니다. </li></ol></li><li> 면역 염색 <ol><li> 배양 중 원하는 시점에서 RT에서 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)으로 세포를 고정한다. 인해 PFA의 독성에 고정하는 단계는 화학 퓸 후드에서 수행되어야 발연. </li><li> . 배 PBS 중지 포인트 발판을 씻으 : PFA 고정 구조는 추가 단계를 진행하기 전에 며칠 동안 4 ° C에서 PBS에 저장 될 수있다. </li><li> 4 ℃에서 일차 항체 O / N을 함유하는 PBS에서 0.2 % 트리톤, 0.25 % 소 혈청 알부민 (BSA)의 골격을 부화. </li><li> 다음 날은 염색 액을 버리고 언 바운드 차 항체를 제거하는 PBS로 골격을 3 × 30 분을 씻는다. </li><li> 2 PBS에 트리톤 0.2 %에 희석 차 항체, 0.25 % BSA로 샘플을 품어실온에서 시간. </li><li> 염색 액을 제거하고 언 바운드 차 항체를 제거하는 PBS로 골격을 3 × 30 분을 씻는다. </li><li> 이미지 1 μm의 단계로 샘플의 100 μm의 Z-부분을 고려하여 20 배 목표와 공 초점 현미경을 사용하여 비계. 이미지 해상도가 최소 1,024 X 1,024 픽셀이어야 얇은 신경 돌기를 시각화합니다. </li></ol></li><li> RNA, DNA와 단백질 분리 주 : RNA, DNA 및 단백질 분리는 제조자의 지시에 따라 상용 AllPrep DNA / RNA / 단백질 미니 키트를 사용하여 수행된다. <ol><li> 사용 멸균 집게는 2 ml의 멸균 튜브에 문화 판에서 발판을 전송합니다. 튜브 당 하나의 발판을 놓습니다. </li><li> 각각의 튜브에 RLT 버퍼의 200 μl를 추가합니다. </li><li> 멸균 microscissors로 세분화하여 구조를 방해. </li><li> 분열 조직을 균일화하려면, 스핀 컬럼 튜브의 콘텐츠를 전송. 마이크로 원심에서 최고 속도로 2 분 동안 스핀.이 스핀 컬럼을 통과 할 해물 균질화된다. </li><li> 을 통해 흐름을 수집하고 RNA, 제조 업체 프로토콜 다음 DNA와 단백질을 분리하는 즉시 사용할 수 있습니다. </li><li> 핵산의 수율 호환되는 다른 방법 (예를 들면, NanoDrop)을 정량화. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 BCA 단백질 분석을 이용하여 단백질을 정량 수율. 파장 562 nm에서 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 분석의 결과를 측정한다. 주 : 핵산 및 세포 밀도와 관련 구조체 당 단백질의 예상 수율은도 4에 도시된다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

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여기에서 구획화된 3D 뇌 유사 조직 모델을 조립하기 위한 지침을 설명했습니다. 이 모델은 뉴런의 조밀한 분극 배양으로 인해 형태학적으로 다른 두 개의 구획이 발달하는 것이 특징입니다: 하나는 조밀하게 채워진 세포체를 포함하고 다른 하나는 순수한 축삭 네트워크를 포함합니다. 전반적으로, 스캐폴드 구조와 성장 패턴은 6개의 층류층과 백질관을 포함한 뇌 피질 조직을 모방합니다21.
도넛 모양의 실크 단백질 기반 조직 모델은 기계적 특성, 다양한 구조 형태, 하이드로겔 필러 및 세포 구성 요소의 수정 및 조정을 허용합니다. 따라서 이 조직 모델은 광범위한 연구를 위한 기본 플랫폼을 구축합니다. 실크는 생체 적합성, 수성 기반 가공, 강력한 기계적 및 분해 특성으로 인해 생체 재료 플랫폼에 유리한 후보입니다22. 실크 매트릭스는 또한 배양에서 시간이 지남에 따라 콜라겐 겔 수축을 줄이는 안정적인 앵커 역할을 합니다. 이 모델에 사용된 스캐폴드의 실크 농도 및 다공성과 같은 특성은 최적의 세포 성장 및 기계적 특성을 달성하기 위해 이전에 조정되어 뇌와 유사한 조직 탄성을 초래했습니다18,23,24. 실험의 성공적인 결과와 재현성을 보장하기 위해 이러한 매개변수를 일정하게 유지하는 것이 좋습니다.
3D 뉴런 네트워크 형성은 기계적 특성이 다른 두 가지 유형의 생체 재료, 즉 뉴런 고정을 제공하는 뻣뻣한 스캐폴드와 3D에서 축삭 침투 및 연결을 허용하는 더 부드러운 젤 매트릭스를 결합하여 달성되었습니다. 실크 스캐폴드와 연질 하이드로겔의 선택적 재료 선호도는 축삭 연결에서 뉴런을 구획화하는 기본 원리를 제공합니다. 실크 스캐폴드의 불활성 특성으로 인해 신경 부착을 위해서는 폴리-D-라이신을 사용한 기능화가 필요합니다. 그러나RGD25 또는 피브로넥틴26과 같은 다른 세포 접착 촉진 인자를 적용할 수 있다. 3D 네트워크 형성을 달성하려면 뉴런이 스캐폴드에 부착되는 즉시 실크 스캐폴드를 적시에 하이드로겔로 채워야 합니다. 마찬가지로, 콜라겐 매트릭스 필러는 다른 하이드로겔로 대체될 수 있으므로 축삭 네트워크 형성에 대한 3D 세포외 환경의 영향을 연구하여 신경 호환성 측면에서 새로운 하이드로겔을 평가하는 플랫폼 역할을 할 수 있습니다. 또한, 쥐 피질 뉴런 외에도 해마 뉴런 또는 유도만능세포(iPSc) 유래 뉴런과 같은 다른 뉴런 소스를 활용할 수 있습니다. 또한, 조직 모델은 뉴런과 함께 신경교세포를 포함하여 이세포 상호작용을 연구하고 보다 복잡한 뇌와 유사한 조직을 구축하는 데 사용될 수 있습니다.
앞서 살펴본 바와 같이, 우리의 모델은 세포 생존력, 유전자 발현, LC-MS/MS 및 전기생리학과 같은 다양한 분석을 통해 3D 미세 환경에서 신경 기능을 평가하는 데 활용될 수 있으므로 모델의 생리학적 관련성을 입증할 수 있습니다18. 면역염색 및 현미경8,9,11 과 같은 3D 조직 조작 구조물을 평가하기 위해 자주 이용되는 다른 방법도 세포 분포 및 축삭 네트워크 형성 정도를 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 그러나 콜라겐 매트릭스의 밀도가 높기 때문에 항체의 침투와 이미징 깊이가 수백 마이크로미터로 제한된다는 점에 유의해야 합니다. 또한, 신호 대 잡음비는 비특이적 배경 형광의 영향을 받을 수 있습니다. 이것은 면역염색의 필요성을 감소시키는 친유성 세포 추적자와 유전적으로 발현된 형광 단백질을 사용하여 극복할 수 있습니다11. 또는 일반적인 1광자 기술 대신 2광자 현미경으로 이미징을 수행할 수 있으며, 이는 신호 손실, 광표백을 줄일 수 있으며 수백 마이크로미터의 깊이까지 확장할 수 있습니다.
요약하자면, 실크와 콜라겐 기반 뇌 유사 조직은 신경 네트워크를 3D로 연구할 수 있는 강력한 플랫폼을 제공하며 향후 신경 장애의 고급 모델 개발을 위한 출발점이 됩니다. 평가 방식과는 별개로, 이 조직 모델의 상대적 단순성은 그 유용성, 성공 및 재현성을 뒷받침합니다.

중추 신경계 (CNS)의 구조적 기능적, 감염성 또는 퇴행성 혈관을 포함하는 다양한 질환에 의해 영향을받을 수있다. 추정 6백80만명 1은 전 세계적으로 성장하고 사회 경제적 부담을 나타내는 신경 질환의 결과로 매년 죽는다. 그러나, 장애의 몇 가지 가능한 치료를해야합니다. 따라서, 신경계 질환을 앓고있는 환자를위한 치료 전략의 혁신적인 중요한 필요성이있다. 불행히도, 많은 CNS 타겟 치료제 인해 생리 학적으로 관련 기능 판독과 급성 및 만성 영향 평가를 허용하지 않는 부적절한 전임상 연구 모델의 활용에 부분적으로 임상 시험 중에 실패합니다. 지난 수십 년간 상당한 연구 노력에도 불구하고, CNS의 구조와 기능에 대해 알 수없는 방대한있다. 더 많은 지식을 습득하기 위하여, 동물 모델은 종종 우리 아르ED 특히 전임상 연구에서, 이러한 외상성 뇌 손상 (TBI), 또는 치매 병리 상태를 모델링한다. 그러나 동물은 인간에서 모두 중추 신경계의 해부학에서뿐만 아니라, 기능, 유전자 발현 및 대사 2-4에 유의 한 차이. 한편, 2D 체외 배양 세포 생물학을 연구하는 일반적인 방법이고 정기적 약물 발견에 사용된다. 그러나, 2 차원 세포 배양은 복잡하고 인간의 두뇌 5-7에 비해 생체 적합성이 부족하다. 저가 및 단순성 2D 세포 배양 연구 또는 동물 모델에 의해 제공되는 복잡성을 대신 없지만, 3 차원의 조직 공학은 시험 관내 및 생체 내 접근법에서 2D 사이에 존재하는 간극을 폐쇄 개선 연구 모델을 생성 할 수있다. 3 차원의 조직 공학은 3D 세포 - 세포 상호 작용에 의해 제공되는 지지체 생체 외 단서에 의해 달성 이상의 생리 학적으로 관련 실험 조건을 제공한다. Desp3D 배양 값 뒤에 상당한 증거 ITE, 거기 이러한 줄기 세포 유래 organoid 배양 8-10 같은 몇 3D CNS 조직 모델 11 neurospheroids는 현재 및 하이드로 겔 배양 12,13 분산. 다층 리소그래피 (14), 및 3D 인쇄 (15) 등의 고급 기술 방법은 폐, 간 및 신장 조직을 연구에 이용되어왔다. 그러나, 대뇌 피질의 구조 생물학을 흉내 낸으로 구획 된 신경 세포의 성장을 허용 3D CNS 모델의 부족이있다. 신경 세포 기관에서 신경 돌기의 분리 된 성장은 이전 축삭 기관의 추적, 칼슘 유입, 네트워크 아키텍처 및 활동의 연구를 허용 미세 (16, 17)를 사용하여 2D 문화에서 증명되었다. 이 아이디어는 세포체와 축삭 책자는 뇌 (18)의 계층 구조를 흉내 낸 다른 구획에있는 3D 편광 신경 조직을 개발하기 위해 우리에게 영감을 </sup&gt;. 우리의 접근은 제한된 용적의 셀을 고밀도로 수용하고 콜라겐 겔에 치밀한 축삭 네트워크의 생장을 허용 고유 실크 골격 설계의 사용에 기초한다. 여기에서 우리는 인공 지지체 제조 및 신경 세포 배양을 포함한 뇌와 같은 조직의 전체 조립 과정을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Na2CO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223530</td><td></td></tr><tr><td>LiBr</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213225</td><td></td></tr><tr><td>MWCO 3500 투석 카세트&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>66110</td><td></td></tr><tr><td>가열판</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sieve</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>No. 270, No. 35, No. 30</td></tr><tr><td>집에서 만든 PTFE 금형</td><td></td><td></td><td>(<강>그림 1</강>) 직경 10cm, 높이 2cm</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>생검 펀치 5&#160; mm</td><td>세계 정밀 기기</td><td>501909</td><td></td></tr><tr><td>생검 펀치 2&#160; mm</td><td>World Precision Instrument</td><td>501908</td><td></td></tr><tr><td>poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>최종 농도 10&#160; &#956; g/ml, 물에 용해</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1283-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td></td><td>10104159001 최종 농도 0.3%</td></tr><tr><td>대두 단백질</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6522-100MG</td><td>최종 농도 1&#160; mg/ml</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>37&#160까지 예열; &데그; C 사용 전</td></tr><tr><td>B27 보충제 50x</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin Streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 I, 쥐 꼬리, 100&#160; mg</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>최종 농도 3&#160; mg/ml</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>시그마-알드리치</td><td>S2770</td><td>부식성</td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4170-10MG</td><td>독성</td></tr><tr><td>플루오레세인 디아세테이</td><td>트 시그마-알드리치</td><td>F7378-5G</td><td></td></tr><tr><td>올림푸스 MVX10</td><td>올림푸스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6148</td><td>독성, 최종 농도 4%</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A7906-10G</td><td></td></tr><tr><td>항-&베타; IIITubulin 항체&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2200</td><td>토끼 1:500</td></tr><tr><td>안티 토끼 Alexa-546</td><td>분자 프로브</td><td>A11010</td><td>염소 1:250</td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP2 컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td></td><td>대물렌즈 20X</td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA/단백질 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>80004</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올, 순수</td><td>시그마-알드리치</td><td>E7023&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더 Spectramax M2</td><td>분자 소자</td><td></td><td>흡광도 562 nm</td></tr><tr><td>마이크로 가위, 경제성, Vannas-type</td><td>TedPella</td><td>1346</td><td></td></tr></tbody></table>

편광 신경 조직의 엔지니어링 3d 실크 콜라겐 기반 모델

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

뇌의 해부학, 구성 및 기능을 해독하기 위한 엄청난 노력에도 불구하고 뇌는 인체에서 가장 이해가 덜 된 기관으로 남아 있습니다. 신경계에 대한 더 깊은 이해를 얻기 위해 과학자들은 조직 공학 접근 방식을 사용하여 기본 구성 요소에서 체외로 조직을 조립하여 조직을 단순하게 재구성하는 것을 목표로 합니다. 우리 그룹은 피질의 백질과 회백질을 닮은 조직 공학적 실크와 콜라겐 기반 3D 뇌와 유사한 모델을 개발했습니다. 이 모델은 실크 다공성 스폰지로 구성되어 있으며, 쥐의 뇌에서 유래한 뉴런이 미리 파종되어 부드러운 콜라겐 매트릭스에 잠겨 있습니다. 편광된 신경 세포의 성장과 네트워크 형성은 별도의 축삭 및 세포체 국소화와 함께 관찰됩니다. 이 구획 구조는 천연 신경 조직을 모방한 틈새의 고유한 개발을 가능하게 하여 신경 네트워크 조립, 축삭 유도, 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호 작용 및 전기적 기능에 대한 연구를 가능하게 합니다.

도넛 모양 솔리드 실크 스폰지 미리 절단은 신경 조직 (그림 2A)를 닮은 구획 구조를 달성하기 위해 독특하고 간단한 아이디어를 나타냅니다. 작은 부피 내에 시드 및 높은 세포 밀도의 증가를 허용하는 매우 높은 표면적이 약 500 μm의 결과 공경 지지체의 다공성 구조 (2 × 7 / ㎖) (도 2B). 또한, 발판의 높은 다공성 연장 시간 프레임을 통해 고밀도 세포 배양의 뛰어난 생존 능력의 결과로 영양분과 폐기물의 무제한 확산 수 있습니다. 신경 세포를 파종시 신속하고 균일하게 발판 기공의 표면에 부착합니다. 세포 부착이 완료되고 세포 실크 기판 상에 평형화 된 후, 스폰지 지지체가 축삭 네트워크 형성 (도 3 차원 환경을 제공하기 위해 부드러운 콜라겐 매트릭스로 채워진다 </strong&gt;). 뉴런은 단지 2 차원 표면 (도 3b)와 혼합 발견 네트워크 결과 기공의 표면에 확장을 성장 콜라겐 매트릭스의 부재 축삭과 세포체의 구획화는 불가능하다. 반면에, 콜라겐 젤은 신경 세포 기관이 실크 발판 (그림 3C)에 부착 된 상태로 유지하면서, 3D 광범위한 축삭 가지를 지원하는 메쉬 작업을 제공합니다. 이러한 성장 패턴은 세포 기관과 순수 축삭 네트워크 뇌의 피질의 회색과 흰색 물질과 유사합니다 (그림 3D)의 구획화에 연결됩니다. 그렇다 현미경에서, 구조물은 실험 뒤에 질문에 따라, 다른 방법 (18)의 다양한 평가 될 수있다. 예를 들어, 구조물에서 DNA, RNA 및 단백질의 분리가 용이하게 상업적 키트를 (도 4)을 사용하여 수행 할 수있다. 핵산 및 단백질 PE의 수율R 구조체는 초기에 실크 비계에 시드 셀의 개수에 의존한다. 이상의 셀 시드 DNA, RNA 및 단백질의 높은 수율. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig1.jpg" /> 실크 스폰지 지지체의 제조에 사용 그림 1. PTFE 금형 크기 :.. 10cm 직경 2cm 높이 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig2.jpg" /> 그림 2. 3D 뇌와 같은 조직 모델입니다. (A) 다공성 실크 스폰지 발판. 전에 콜라겐 (녹색 살아있는 세포, 붉은 죽은 세포)를 포함 실크 인공 지지체에 파종에 따라 1 일에서 신경 세포의 (B) 라이브 / 죽은 얼룩. 오른쪽 패널은 엄마를 표시빨간색 프레임에서 캡처 영역의 gnification. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig3.jpg" /> 그림 3. 신경 세포의 3 차원 뇌와 같은 조직 모델에서 구획 가지 (A) 비계 구획 :. 레드 셀 바디 컴, 블루 축삭 함. (B) 콜라겐 삽입 전에 파종에 따라 1 일에서 신경 세포의 성장 패턴. (C). 세포체 구획 씨딩 7 일에 신경 생장. (D) 축삭 구획에 파종시 7 일에 신경 가지. 녹색 -. βIIITubulin <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig3large.jpg" target="_blank">이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>그림. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig4.jpg" /> (A) RNA와 DNA, 그리고 발판 당 시드 세포의 양에 관련 구조 당 (B) 단백질의 그림 4. 예상 수율 (± 표준 편차, N = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .</a>

뇌의 복잡한 행동에 대한 통찰력을 얻으려면 고급 연구 도구가 필요합니다. 여기에서 우리는 뇌와 유사한 구조를 닮은 신경 조직의 새로운 실크-콜라겐 기반 3D 엔지니어링 모델을 보여줍니다. 이 모델은 뉴런 네트워크 조립, 축삭 유도, 세포-세포 상호 작용 및 전기 활동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

편광 신경 조직의 엔지니어링 3D 실크 콜라겐 기반 모델

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

이 절차의 전반적인 목표는 3D 뇌 유사 조직의 공학적 공정을 시연하는 것입니다. 이는 먼저 염 leaching 기술을 사용하여 실크 용액으로부터 다공성 스캐폴드를 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 스캐폴드를 도넛 모양으로 미리 절단하고, 멸균 및 poly-D-lysine(PDL) 코팅을 통해 세포 배양을 위한 준비를 하는 것입니다.다음으로, 준비된 스캐폴드에 갓 분리한 쥐의 일차 피질 뉴런을 파종합니다. 마지막 단계는 스캐폴드를 콜라겐으로 임베딩하여 배양 플레이트로 옮기는 것입니다. 최종적으로, 면역형광 현미경을 사용하여 신경 성장과 신경망의 발달을 확인합니다.이 기술은 파킨슨병이나 알츠하이머병의 새로운 연구 모델 개발을 위한 기초로 활용될 수 있으므로, 뇌 질환의 치료 또는 진단으로 그 응용 범위가 확장될 수 있습니다. 시작하기 전, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 6% silk 용액을 준비하여 4°C에서 보관하십시오. 다공성 스캐폴드를 준비하려면, 먼저 과립형 sodium chloride를 체로 걸러 직경 500에서 600 µm 사이의 과립을 수집하십시오.30 milliliters의 실크 용액을 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 몰드에 붓고, 그 위에 60 grams의 체 친 염화나트륨을 고르게 뿌립니다. 실크를 중합시키기 위해 실온에서 48시간 동안 배양합니다.실크의 가교 결합을 마무리하고 남은 액체를 증발시키기 위해, 몰드가 포함된 스캐폴드를 60 °C로 설정된 오븐에 1시간 동안 둡니다. 그다음, 몰드와 스캐폴드 결합체를 2 L 비커의 증류수에 48시간 동안 담가 둡니다. 염분을 용출시키기 위해 하루에 2~3회 물을 교체합니다.몰드에서 스캐폴드를 제거하고 작은 조각으로 자릅니다. 먼저 직경 5 mm의 생검 펀치(biopsy punch)를 사용하여 자릅니다. 그다지 스캐폴드의 높이가 2 mm가 되도록 자른 후, 각 조각의 중심부를 2 mm 생검 펀치로 제거합니다.습식 사이클로 20분 동안 스캐폴드를 오토클레이브하십시오. 세포 배양 후드 내에 멸균된 핀셋 한 쌍, 세포 배양 배지 및 오토클레이브 처리된 스캐폴드를 배치합니다. 포장을 제거한 96웰 플레이트를 내부에 배치하여 스캐폴드를 시딩합니다.먼저 웰당 하나의 멸균된 스캐폴드를 배치합니다. 96-웰 플레이트에 세포 배양액을 추가하여 스캐폴드를 잠기게 하고, 조직 배양 인큐베이터에서 37 °C로 최소 30분 동안 배양하여 평형 상태로 만듭니다. 배양이 끝나면 스캐폴드에서 과잉 배양액을 흡입하여 제거합니다.그 다음, 스캐폴드당 100 µL의 neuro basal medium에 들어있는 2 × 10⁶개의 쥐 피질 신경세포를 첨가합니다. 플레이트를 배양기로 다시 옮기고 하룻밤 동안 두어 세포가 스캐폴드에 부착되도록 합니다. 다음 날 아침에.부착되지 않은 세포를 조심스럽게 흡입하여 제거하고 200 µL의 신선한 세포 배양 배지로 교체합니다. 37 °C에서 짧은 시간 동안 배양합니다. 다음으로, 멸균 핀셋을 사용하여 웰에서 배지를 흡입하여 제거합니다.세포가 포함된 스캐폴드를 96-well 플레이트의 빈 웰로 옮긴 다음, 각 스캐폴드에 갓 희석하여 얼음처럼 차갑게 유지한 3 mg/mL 쥐 꼬리 콜라겐 용액 100 µL를 가합니다. 세포를 37 °C 인큐베이터로 다시 옮겨 30분 동안 콜라겐이 중합되도록 합니다.플레이트를 인큐베이터에서 꺼내고 각 웰에 미리 데워둔 세포 배양액 100 µL를 첨가합니다. 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣고 원하는 기간 동안 세포를 배양하며, 최대 일주일 동안 매일 각 웰의 배지 절반을 신선한 배지로 교체합니다.이러한 고다공성 스캐폴드 내에서 신경 세포를 표시된 것처럼 고밀도로 배양할 수 있습니다. 여기 세포 생존율 결과가 있습니다. 파종 하루 후, 형광 디아세테이트(fluorescent di acetate)로 라벨링된 살아있는 세포는 녹색으로 나타나며, 프로피듐 아이오다이드(propidium iodide)와 실크 스캐폴드가 관찰됩니다.빨간색으로 표시된 부분에서 저배율로 관찰되는 높은 생존 세포 비율을 확인하십시오. 이 그림은 도넛 모양의 스캐폴드 내에서 신경세포체와 축삭 돌기의 구획화를 보여줍니다. 세포 파종 하루 후, 여기에서 보는 바와 같이 신경세포체는 실크 스캐폴드에 부착된 상태로 유지되며, beta three tubulin 면역 염색을 통해 녹색으로 나타납니다.예상한 바와 같이, 배양 7일 차에 세포들이 스캐폴드 내에 조밀하게 분포되어 있습니다. 이와 대조적으로 스캐폴드 중앙 중공의 콜라겐 매트릭스는 광범위한 축삭 성장을 위한 지지체 역할을 합니다. 여기에 축삭 망상 구조가 나타나 있습니다.파종 7일 후. 이 영상은 beta three tubulin 염색으로 표지된 신경망 세포를 포함하는 스캐폴드의 중앙 콜라겐 창을 공초점 Z-스캔한 모습입니다. 이 영상을 시청한 후에는 3D 뇌 유사 조직 구조물을 설정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

engineered-3d-silk-collagen-based-model-of-polarized-neural-tissue

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 실크 콜라겐 골격을 사용하여 3D 편광 신경 조직 모델을 만드는 방법을 보여줍니다. 다공성 실크 골격에 신경 세포를 파종하고, 세포 부착을 위해 배양하고, 골격에 콜라겐을 삽입하는 과정을 자세히 설명하고, 3D 편광 신경 조직 모델을 형성하는 데 있어 지지 콜라겐 매트릭스의 중요성을 강조합니다.

편광 신경 조직의 엔지니어링된 실크-콜라겐 기반 3D 모델 개발

출처: Struzyna, LA 외, 신경계 재건, 변조 및 모델링을 위한 해부학적으로 영감을 받은 3차원 미세 조직 공학 신경망. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 세포외 기질 코어가 있는 하이드로겔 마이크로 컬럼을 사용하여 미세 조직 공학 신경망의 개발을 보여줍니다. 시드된 신경 응집체는 부착하고, 투영을 확장하며, 구조화된 신경망을 형성하여 신경 발달 및 신경치료 연구의 발전에 기여합니다.

하이드로겔 기반 마이크로컬럼을 이용한 미세조직 공학 신경망 개발

이 연구에서는 3D 뉴런 배양이 평면 MEA(Micro-Electrode Arrays)에 결합되는 새로운 실험 모델을 presented. 3D 뉴런이 유리 마이크로비즈로 구성된 골격에 뉴런을 파종하여 네트워크를 구축하고, 그 위에서 뉴런이 자라나 상호 연결된 3D 구조를 형성합니다.

마이크로 전극 배열에 3D 엔지니어링의 연결을 문화의 인터페이스 : 혁신을<em&gt; 체외</em&gt; 실험 모델

이 원고는 마이크로 조직 공학 신경 네트워크의 제작에 대해 자세히 설명합니다. 3 차원 크기의 마이크론 크기의 구조물은 관 모양의 하이드로 겔에 둘러싸인 집적 된 신경 세포군에 걸친 길쭉한 정렬 축색관으로 구성됩니다. 이러한 살아있는 비계는 신경 회로를 재구성하거나 조절하기위한 기능적 중계 역할을하거나 회색 - 흰색 물질 신경 조직학을 모방 한 생물 여과 테스트 베드 (bifidelic test-bed) 역할을 할 수 있습니다.

신경 시스템 재구성, 변조 및 모델링을 위해 해부학 적으로 영감을받은 3 차원 미세 조직 공학 신경 회로망

우리 쇼케이스 경도 정렬된 astrocytic somata 소설 소재 넣음 내 프로세스의 자기 조립, 3 차원 번들의 개발. 이러한 "생활 건설 기계", 아직 테스트-베드 neurodevelopmental 메커니즘을 공부 하거나 감독 신경 마이그레이션 및 axonal neuroregeneration를 용이 하 게 하 역할 수 센티미터 길이, 확장 미크론 단위 직경을 전시 설계 길입니다.

3 차원 조직 설계 정렬 사이토 네트워크 발달 메커니즘을 정리 하 고 신경 재생을 촉진 하

여기서는 3D 매트릭스에서 축산이 자라는 동작을 분석하여 자연 발달을 모방하는 방법을 제공합니다.

신경계 발달 중 축산 성장과 행동을 분석하는 3-D 콜라겐 기반 하이드로겔 생성

이 백서는 전기장(EF)에 노출된 섬유성 전도성 물질의 유한 원소 모델을 구축하기 위한 전략을 제시한다. 모델은 이러한 재료에서 시드된 세포가 스캐폴드의 구성 재료 특성, 구조 또는 방향을 변경하는 영향을 수신하고 평가하는 전기 입력을 추정하는 데 사용할 수 있습니다.

셀룰러 전기 미세 환경의 유한 요소 모델링

이 논문은 이전에 설명한 3차원 콜라겐 기반 스캐폴드에 신경모세포종 세포주를 파종하고, 미리 결정된 기간 동안 세포 성장을 유지하고, 다양한 실험 목표를 충족하도록 적응할 수 있는 여러 세포 성장 및 세포 행동 분석 및 다운스트림 애플리케이션을 위한 스캐폴드를 검색하는 데 필요한 단계를 나열합니다.

콜라겐 기반 스캐폴드를 사용한 신경모세포종의 3차원 체외 생체모방 모델

이 연구는 자가 치유 어닐링 가능한 입자-세포외 기질 복합체 내부의 신경 줄기 세포의 자유형 임베디드 3D 프린팅을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 높은 충실도로 상호 연결된 인간 신경 조직 구조의 프로그래밍 가능한 패터닝을 가능하게 합니다.

인간 신경 구조물의 임베디드 3D 프린팅을 위한 마이크로겔-세포외 기질 복합체 지원

여기서는 iPSC 유래 뉴런 및 성상세포의 3D 바이오프린팅 공동 배양을 생산하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 하이드로겔 스캐폴드 내에서 96웰 또는 384웰 형식으로 생성된 이 공동 배양 모델은 7일 이내에 높은 인쇄 후 생존율과 신경돌기 성장을 입증하고 두 세포 유형 모두에 대한 성숙 마커의 발현을 보여줍니다.

스크리닝 응용 분야를 위한 인간 iPSC 유래 뉴런-성상세포 공동 배양의 3차원 바이오프린팅

배우세요 실크-콜라겐 기반 3D 신경 조직 모델링 기법을 활용한 뇌 유사 구조체 공정법. 소금 침출법으로 다공성 실크 스캐폴드를 제작하고 일차 대뇌피질 신경세포를 배양하여 신경망 형성과 축삭 성장을 연구할 수 있습니다.

편광 신경 조직의 엔지니어링 3D 실크 콜라겐 기반 모델

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