편광 신경 조직의 엔지니어링 3D 실크 콜라겐 기반 모델

이 절차의 전반적인 목표는 3D 뇌와 유사한 조직의 엔지니어링 프로세스를 시연하는 것입니다. 이것은 먼저 소금 침출 기술을 사용하여 실크 용액에서 다공성 골격을 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 골격을 도넛 모양으로 미리 절단하고 폴리 드 리신 또는 PDL로 살균 및 코팅하여 세포 배양을 준비하는 것입니다.

다음으로, 준비된 골격에는 갓 분리된 1차 쥐 피질 뉴런이 파종됩니다. 마지막 단계는 골격의 콜라겐 포매와 배양 플레이트로의 전달입니다. 궁극적으로 면역형광 현미경은 신경망의 신경 성장과 발달을 보여주는 데 사용됩니다.

이 기술의 의미는 파킨슨병 또는 알츠하이머의 새로운 연구 모델을 개발하기 위한 기초로 사용될 수 있기 때문에 뇌에 영향을 미치는 질병의 치료 또는 진단으로 확장됩니다. 시작하기 전에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 6% 실크 용액을 준비하고 섭씨 4도에서 보관하십시오. 다공성 골격을 준비하려면 먼저 과립 식 염화나트륨을 체로 치고 직경 500-600 마이크로 미터 사이의 과립을 수집합니다.

실크 용액 30ml를 폴리테트라플루오로에틸렌 또는 PTFE 몰드에 붓고 60g의 염화나트륨을 골고루 뿌립니다. 해결책. 실크를 중합시키기 위해 실온에서 48시간 동안 배양합니다.

곰팡이가 들어있는 골격을 섭씨 60도로 설정된 오븐에 1시간 동안 넣어 실크의 가교를 마무리하고 남아 있는 액체를 증발시킵니다. 다음으로, 금형과 스캐폴드 조합을 증류수가 담긴 2리터 비커에 48시간 동안 담그십시오. 소금을 빼내려면 하루에 2-3번 물을 갈아주세요.

틀에서 비계를 제거하고 작은 조각으로 자릅니다. 먼저 5mm 직경의 생검 펀치를 사용합니다. 그런 다음 골격을 2mm 높이로 자르고 2mm 생검 펀치로 각 조각의 중심을 제거합니다.

20분 동안 젖은 주기로 비계를 고압증기멸균합니다. 세포 배양 후드 내부에 한 쌍의 멸균된 집게, 세포 배양 배지 및 오토클레이브 골격을 놓습니다. 포장에서 96웰 플레이트를 제거하고 내부에 넣어 골격에 씨를 뿌립니다.

첫 번째 장소: 우물당 하나의 멸균 비계. 96웰 플레이트에 세포 배양 배지를 첨가하여 골격을 담그고 조직 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양하여 최소 30분 동안 평형을 이룹니다. 배양 후 골격에서 여분의 배지를 흡인합니다.

그런 다음 골격당 100마이크로리터의 신경 기저 배지에 있는 6개의 쥐 피질 신경 세포에 10의 두 배를 추가합니다. 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣고 세포가 골격에 부착될 수 있도록 밤새 그대로 둡니다. 다음 날 아침에.

부착되지 않은 세포를 조심스럽게 흡인하고 200마이크로리터의 신선한 세포 배양으로 교체합니다. 보통. 짧은 기간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 다음으로, 멸균 겸자를 사용하여 웰에서 배지를 흡입합니다.

세포를 포함하는 골격을 96개의 빈 우물로 옮깁니다. 그런 다음 갓 희석된 얼음 차갑게 100마이크로리터에서 각 골격에 잘 플레이트하고 밀리리터 쥐 꼬리 콜라겐 용액당 3밀리그램을 넣습니다. 세포를 섭씨 37도의 인큐베이터로 되돌려 30분 동안 콜라겐이 중합될 수 있도록 합니다.

인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 100마이크로리터의 예열 세포 배양을 추가합니다. 유정 회수당 중간. 원하는 세포 성장 기간 동안 플레이트를 인큐베이터로 돌리고 최대 1주일 동안 매일 각 웰에서 배지의 절반을 새로운 배지로 교체합니다.

이러한 다공성 골격에서 신경 세포는 표시된 고밀도로 배양될 수 있습니다. 다음은 세포 생존율 결과입니다. 파종한 지 하루 후, 형광 디 아세테이트로 표지된 살아있는 세포가 녹색과 프로피듐 요오드화물 및 실크 골격에 나타납니다.

빨간색은 낮은 배율에서 보이는 살아있는 세포의 높은 비율을 나타냅니다. 이 그림은 도넛 모양의 골격 내에서 신경 세포체와 축삭 돌기의 com compartmentalization을 보여줍니다. 신경 세포체는 실크 골격에 부착된 상태로 유지되며, 여기에서 볼 수 있듯이 파종 세포가 베타 3 튜불린에 대해 면역 염색되어 녹색으로 보이는

예상대로, 세포는 배양 7일차까지 골격을 조밀하게 채웠습니다. 대조적으로, 골격의 중앙 중공에 있는 콜라겐 매트릭스는 광범위한 축삭 성장을 지원합니다. 여기에 표시된 것은 축삭 그물망입니다.

파종 후 7일. 이 동영상은 베타 3 튜불린에 대한 염색으로 표지된 신경망 세포를 포함하는 골격의 중앙 콜라겐 창에 대한 컨포칼 Z 스캔을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 3D 뇌와 유사한 조직 구조를 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.