Name: T 세포는 수지상 세포에서 Transinfection에 의해 박테리아를 캡처 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 배우세요 수지상 세포에서 CD4+ T 세포로의 세균 transinfection을 정량화하는 방법을. 마우스 세포 모델을 사용하여 면역 반응 중 T 세포의 세균 포획 및 살균 메커니즘을 탐구합니다.

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이 작업은 스페인 과학혁신부의 보조금 BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC 및 Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas(CSIC)의 PIES201020I046의 지원을 받았습니다.

참고 : 실험 절차는 대학교 Autònoma 마드리드의 연구 윤리위원회의 승인을 스페인과 유럽 지침에 따라 동물 복지 및 보건 대학교 Autònoma 마드리드 헤드의 감독하에 실시 하였다. 마우스는 특정 병원체 무료 (SPF) 하우징에 자란하고 이산화탄소를 사용하여 훈련과 자격을 갖춘 사람 (CO 2) 흡입 방법으로 안락사시켰다. 1. 마우스 뼈 수지상 세포의 분화 및 감염 골수 유래 참고 : 그림 1은 첫 번째 단계를 요약 한 것입니다. 모든 절차 만 멸균 미디어, 악기, 피펫 팁 및 배양 접시를 사용하여,이 시점에서 후드에서 수행되어야한다. <ol><li> 마우스 골수 유래 수지상 차별화 <ol><li> 하나 C57 / BL6 마우스 (22)에서 경골과 대퇴골을 해부하고 RPMI 배지 10 ml의 플라스틱 접시에 전송합니다. </lI&gt; <li> 멸균 가위, 각 골단을 잘라 특성 밝은 붉은 색이 골수를 노출. </li><li> 멸균 페트리에 멸균 주사기를 사용하여 0.5 % 소 혈청 알부민을 함유하는 인산염 완충 식염수 10 ㎖ (PBS) (BSA), 5 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (PBS / BSA / EDTA 완충액)로 뼈의 내부 달이다 요리. </li><li> 냉장 원심 분리기 (4 ° C)에서 600 XG에 튜브에 세포 현탁액을 원심 분리기를 수집합니다. </li><li> 암모늄 염화 칼륨 (ACK) 용균 완충액 (0.15 M NH4Cl 등, 10mM의 KHCO 3, 0.1 mM의 EDTA) 1 ㎖로 세포를 재현 탁하고, 적혈구를 제거하기 위해 RT에서 30 초 동안 배양한다. </li><li> 덩어리는 여과에 의해 제거 되었기 때문에 동일한 속도 (600 XG)에서 원심 분리하기 전에 뼈 조각 세포 덩어리를 제거하기 위해 셀 스트레이너 (70 μm의)을 통하여, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)과 RPMI 1640 배지 10 ㎖를 첨가하고 필터. </li><li> 셀 개수D RPMI, 10 % FBS (함유 50 μM의 B 머 캅토 에탄올, 1 mM 나트륨 피루 베이트)를 5 × 105 세포 / ml로 조정하고 20 NG / ml의 재조합 쥣과 과립구 대 식세포 콜로니 자극 인자 (RM-GM-CSF)를 추가 최종 농도. </li><li> CO 2 배양기에서 멸균, 미생물 학적 품질, 15cm 페트리 접시, 문화에 현탁액을 추가 (37 ℃, 5 % CO 2). </li><li> 3 일마다 20 NG / ㎖ RM-GM-CSF를 함유하는 신선한 배지로 세포 밀도 5 × 105 세포 / ml에서 비 - 부착 세포 및 PBS에 5mM의 EDTA와 분리 된 세포와 재현 탁을 모두 스핀 다운. </li></ol></li><li> DC의 항원로드의 성숙 <ol><li> 9 일에, 20 NG / ㎖ RM-GM-CSF를 함유하는 배지에서의 밀도 5 × 105 세포 / ㎖로 세포를 재현 탁. 그런 다음 세포에 높은 MHC-II의 발현을 허용하고 24 시간 동안이 아닌 조직 배양 처리 된 멸균 15cm 페트리 접시에서 배양 20 NG / 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)의 ㎖에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 한 후LPS 자극의 날, 유동 세포 계측법에 의해 수지상 세포의 분화를 확인하기 위해 마우스의 CD11c, MHCII 및 GR-1에 대한 항체와 일부 DC 세포를 얼룩. 수지상 세포의 유세포 분석의 예는도 3a 및도 3b에 도시된다. <ol><li> 샘플 당 50 μl의 PBS / BSA / EDTA 버퍼에 최종 농도 2.5 ㎍ / ㎖의에서 항 - 마우스-CD16 / CD32 단클론 항체와 DC가 (5 × 10 5 세포 / 샘플)을 품어. 그 후, MHCII (IA / IE)에 대한 항체의 50 μl를 추가하는 CD11c 1에서 서로 다른 형광 색소와 결합 GR-1 : 100, 1 : 200, 1 : 각각 PBS / BSA / EDTA 버퍼 (500). </li><li> 마지막으로, PBS / BSA / EDTA 버퍼와 DC가 씻어 제조 업체의 프로토콜에 따라 유동 세포 계측법에 의해 분석한다. 참고 : 세포가 잘 분화 된 경우, 세포는 항원 로딩을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> 워시 RPMI와 DC가 10 % (항생제없이) FBS, 10 μg의 / ㎖ OTII OVAp (OVA 323-339으로 그들을 품어; ISQA37 ºC에서 최소 1 시간 동안 5 × 106 수지상 RMPI 당 10 % FBS 배지 1 ㎖에 플라스틱 튜브 VHAAHAEINEAGR). 음성 대조군으로, OVAp으로 배양하지 않고 DC가 둡니다. </li></ol></li><li> 수지상 세포의 감염 <ol><li> CO 2 인큐베이터에서 1 시간 동안 10 세균 (박테리아 DC 당 10)의 감염 다중도 (MOI)에서 DC의 감염 (37 ° C, 5 % CO 2). </li><li> 워시 DC 세포는 세포 외 박테리아의 대부분을 세척하기 위해 RMPI 10 % FBS 450 XG에 원심 분리기에 PBS와 1 배에서 3 배. 마지막으로, 20 × 106 세포 / ml에서 (항생 물질없이) RMPI 10 % FBS 배지에서 세포를 재현 탁. </li></ol></li></ol> OTII 형질 전환 마우스에서 CD4 + T 림프구의 2. 분리 참고 : 그림 1은이 두 번째 단계를 요약 한 것입니다. 림프절은 대신 CD4 + T 세포를 분리하는 비장의 표기 림프절에서의 CD4 + 림프구 비율 때문에S (~ 50 %), 비장 (~ 25 %) 때문에, 정제가 더 효과적 일 것보다 크다. <ol><li> 림프절의 단일 세포 현탁액을 확인 <ol><li> OTII 형질 전환 마우스에서 23 노드 사타구니, 겨드랑이, 상완, 자궁 경부 및 장간막 림프절을 제거하고 RPMI 10 % FBS 배지 10 ml의 플라스틱 접시에 전송합니다. </li><li> 두 프로스트 현미경 슬라이드를 사용하여 멸균 후드 아래 갈기 림프절. 한 현미경 슬라이드의 프로스트 측에 림프절을 배치하고 장기 지상 될 때까지 두 번째 슬라이드의 프로스트면 문질러. </li><li> PBS / BSA / EDTA 버퍼에 단일 세포 현탁액을 씻으십시오. </li><li> 셀 스트레이너 (70 μm의)가 결합 조직을 제거하고 PBS / BSA / EDTA 버퍼로 씻어 불구하고 세포를 필터링합니다. </li><li> ACK 용해 완충액 1 ml의 세포를 재현 탁하고, 적혈구를 제거하기 위해 RT에서 1 분 동안 배양한다. </li></ol></li><li> CD4 + T 세포의 분리 <ol><li> 단계 2.1.3 카운트로 다시 세척세포를 PBS / BSA / EDTA 완충액에서 100 × 106 세포 / ml로 재현 탁 그들을한다. 1 CD8, IgM의, B220, CD19, MHC 클래스 II (I-AB), CD11b를, 중 CD11c 및 DX5에 비오틴 항체를 추가 : (250)을 30 분 동안 얼음에 CD4 + T 세포의 이상 음의 선택에. </li><li> PBS / BSA / EDTA 버퍼에 세포를 씻고 얼음에 15 분 동안 제조 업체의 프로토콜에서 권장하는 농도에서 스트렙 타비 딘 마이크로 비드와 세포 (100 × 10 6 세포 / ml)을 품어. </li><li> PBS / BSA / EDTA 버퍼에 세포를 씻으와 CD4 + T 세포 분리하기 전에 셀 스트레이너 (30 μm의) 비록을 필터링 할 수 있습니다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라, 자기 세포 분리 장치를 사용하여 음성 선별하여 CD4 + T 세포를 분리. </li><li> 세포를 세어 (항생 물질없이), 10 % FBS RPMI 배지 4 × 106 세포 / ml로 조정한다. </li><li> 수정 및 유동에 의해 순도를 확인하는 얼음 절연 CD4 + T 세포 (3 × 105 세포)에 유지같은 사이토 (24)을 설명했다. CD4 + T 세포를 정제의 예는도 3C에 도시되어있다. </li></ol></li></ol> 3. T 세포 Transinfection 측정 겐타 마이신 보호 분석에 의한 참고 : 그림 2는 프로토콜의 세 번째 단계를 요약 한 것입니다. <ol><li> T 세포 Transinfection <ol><li> 감염된 DC 세포 (1 : 1)과 함께 격리 CD4 + T 세포를 부화 CO2 인큐베이터 (37 ° C에서 면역 시냅스 형성을 허용하도록 30 분 동안 (DC에서 1 시간 동안 감염 제거하기 위해 세척 한 후 무료 박테리아), 5 % CO 2). </li><li> 추가 절연 CD4 + T 세포 (2 × 106 세포) 및 24 웰 배양 접시에 감염된 수지상 세포 (2 × 106 세포)를 0.1 mL의 0.5 mL의. 음성 대조군으로서, 30 분 동안 10 박테리아의 MOI에서 직접 0.5ml를 CD4 + T 세포를 감염. </li><li> 사용하여 T 세포에서 감염 DC가 분리 추가 컨트롤을 포함DC-T 물리적 접촉을 방해 (공경이 3 μm)와 폴리 카보네이트 트랜스 웰 배리어. 잘 (24 웰 플레이트)의 하부 구획으로 0.1 트랜스 웰 내부의 DC ㎖의 CD4 + T 세포의 0.5 ML을 추가합니다. </li><li> 마지막으로, RMPI 매체를 갖춘 모든 샘플에서 동일한 볼륨을 만들기 위해 각 웰에 0.6 ml의가있을 때까지. </li><li> 면역 시냅스 형성의 30 분 후, 겐타 마이신 100 ㎍ / ㎖의 추가 및 CO 2 인큐베이터에서 세포를 수집하기 전에 1 시간 동안 배양 (37 ℃, 5 % CO 2). </li></ol></li><li> 다시 격리 CD4 + T 세포의 <ol><li> 비 부착 세포를 수집하고 PBS / BSA / EDTA 버퍼를 재현 탁. DC가 대부분의 플라스틱 배양 접시에 부착 된 상태로 유지. 소용돌이 튜브는 부드럽게 세포 세분화을 보장합니다. 겐타 마이신이 잘 작동 것을 보여 제어와 같은 세포 상층 액 500 μl를 유지합니다. </li><li> 단계 2.2에서와 같이 수지상 세포 및 T 세포를 포함하는 샘플로부터 CD4 + T 세포를 다시 분리, DC가 있지만 대부분은 접시에 부착해야합니다. 얼음에 제어 샘플을 보관하십시오. 계정에 2 % 미만 오염 만 실험을 가져 가라. transinfection 후 CD4 + T 세포를 정제의 예는도 3D에 도시된다. </li></ol></li><li> 를 Lyse T 세포와 박테리아 중간 한천 플레이트에 그들을 씨앗. <ol><li> PBS로 두 번 CD4 + T 세포를 씻으십시오. </li><li> 세포를 세어 PBS에서 2 × 106 세포 / ml로 재현 탁 그들을. </li><li> T 세포의 세포 밖으로 방출 박테리아, 1 × 106 세포 / ml에서 그들을 용해시키기 위해 T 세포를 500 ㎕의 0.1 % 트리톤 X-100 500 ㎕를 추가하기. </li><li> 용해 세포의 3 연속 진수 희석을 확인하고 박테리아 매체 한천 플레이트에 각 희석의 50 μl를 시드. 4 부분으로 판을 나누고 각 부분에 용해 세포의 다른 희석 씨앗. 대표적인 결과를도 4에 나타낸다. <ol><li> 대조군으로서, 또한 판형그 겐타 마이신을 보장하기 위해 한천의 접합체의 저장 세포 상층 액을 잘 근무하고있다. 또한 추가 제어로 감염된 DC의 플레이트. 경우 낮은 DC가 오염 (&lt;2 %), 낮은 DC 오염에 대응하는 콜로니 형성 단위 (CFUs)를 빼기 발생합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. 정량 유동 세포 계측법에 의한 T 세포 Transinfection의 참고 : 그림 2는이 단계를 요약 한 것입니다. <ol><li> T 세포 Transinfection <ol><li> 단계 1.3에서와 같이 BMDCs 감염,하지만이 경우 GFP 표현 박테리아를 사용합니다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 37에서 30 분 동안 세포 추적기 클로로 aminocoumarin (CMAC)와 (단계 2.2에서 림프절에서 격리) 얼룩 CD4 + T 세포 ºC. </li><li> 두 번 (항생제없이) RMPI 10 % FBS으로 표시 CD4 + T 세포를 씻으십시오. </li><li> 감염된 수지상 세포를 품어 표시 CD4 +와 (박테리아와 1 시간 배양 후)30 분 동안 T 세포 단계 3.1.1에서 설명하는 모든 컨트롤을 포함하여 37 ºC에서 면역 시냅스 형성을 허용합니다. </li></ol></li><li> 감염된 CD4 + T 세포의 염색 <ol><li> DC-T 면역 시냅스 형성의 30 분 후, 세포를 수집하고 PBS / BSA / EDTA에 씻어. </li><li> PBS / BSA / EDTA 버퍼, 부드럽게 튜브를 텍싱하여 별도의 집계 세포와 두 세척 후. </li><li> 0.2 ㎖ / PBS 실온에서 15 분 동안 3 % 함유의 PFA 튜브에 샘플을 고정한다. 그런 다음 PBS로 씻어. </li><li> 수지상 세포 된 Fc 수용체를 차단하는 얼음에 15 분 동안 PBS / BSA / EDTA 50 μL / 샘플에서 항 - 마우스 CD16 / CD32 모노클로 날 항체 (2.5 μg의 / ml)로 배양한다. </li><li> 세포 외 박테리아를 얼룩 얼음에 30 분 동안 50 μL / PBS / BSA / EDTA의 샘플에서 항균 항체 (최종 농도 10 μg의 / ㎖) 토끼를 추가합니다. </li><li> PBS / BSA는 / EDTA로 세포를 씻으 및 피코 에리 트린 (PE)가 결합 마우스의 CD11c에 대한 항체 및 그 자체로 품어토끼에 대한 condary 항체는 1 알렉사 - 형석 647과 같은 다른 형광 색소가 결합 : 얼음에 30 분 동안 PBS / BSA / EDTA의 200 μL 100 / 샘플. </li><li> 세포를 세척하고 유동 세포 계측법에 의해 샘플을 분석 할 수 있습니다. 비 - 형광성 박테리아에게 샘플들을 보상 및 설정 (25) 유동 세포 계측법을 조정 실험에 사용 된 각각의 형광 색소로 표지 한 음성 대조군 샘플을 사용 transinfected T 세포의 시료를 포함하는 것을 잊지 마십시오. 대표 분석은 그림 5에 표시됩니다. 참고 : 박테리아가 GFP를 표현하지 않는 경우, 5 분 동안 PBS에 0.​​5 %에서 트리톤 X-100 샘플을, 세포 내와 세포 외 박테리아, 라벨 외 박테리아를 구별 수정 및 Permeabilize 하시려면 할 수 있습니다. 그 후 다른 형광 색소와 총 박테리아 (세포 + 세포)를 얼룩. </li></ol></li></ol>

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T 세포 또는 T 림프구는 적응성 면역 반응 (26)에 세포 성 면역에 중요한 역할을 담당하고 속하는 백혈구 유형이다. T 세포는 시험 관내에서 감염에 반응하지만 일부 리포트들은 생체 14,15에 감염 될 수 있다는 것을 나타낸다. 면역 시냅스 동안 APC와 T 세포의 친밀한 접촉은 HIV (11)와 같은 일부 바이러스를 포함하는 생체 재료 (13)를 교환하기위한 플랫폼 역할을합니다. 그것은 최근에 교리, T 세포에 그 반대를 줬습니다 적응 면역 세포의 패러다임은, 또한 효율적으로 감염된 수지상 11,16에서 transinfection에 의해 박테리아를 캡처 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 그가 감염 BMDCs에서 체외에서 T 세포 박테리아 transinfection을 정량화하는 프로토콜을 자세히 보여줍니다. T 세포는 박테리아 ...

병원균은 숙주를 감염 할 때, 일반적으로 세균 통관에 필요한 타고난 및 적응 면역 반응의 활성화가있다. 선천성 면역은 대부분의 감염을 방지 방어의 첫 번째 줄입니다. 선천성 면역은 미생물의 다양한 그룹들 사이에서 보존되는 정확한 방법 요소 (병원체 관련 분자 패턴, PAMPS) 1 구분합니다. 선천성 면역 메카니즘 식세포 (대 식세포, 호중구 및 수지상 세포), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 및 천연 킬러 세포를 포함 실제 피부와 같은 장벽 화학 장벽 (항균 펩티드 리소자임) 및 선천적 백혈구를 포함 2. 이 세포는 접촉을 통해 또는 병원체 덮어 및 살해를 포함 식균 작용을 통해 그들을 공격하여 하나 확인하고 병원균을 제거한다. 이 시스템은 P에 대한 면역 학적 기억을 부여 적응 면역, 대조적으로, 평생 방어를 허용하지 않습니다athogens. 적응 면역 시스템은 방어의 두 번째 라인 및 인식하고 여러 미생물 및 비 미생물 물질 3의 특정 항원에 반응 할 수있다. 적응 면역 시스템의 주요 구성 요소는 B 및 T 세포 림프구를 포함이다. B 세포는 병원체 또는 외래 단백질에 대한 항체를 분비, 체액 성 반응에 관여한다. 그러나, T 세포의 사이토 카인 분비 또는 죽이는 병원체에 감염된 세포를 4 면역 반응을 조절, 세포 성 면역을 나타낸다. 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 5-7에 의해 세포 표면에 제시되는 항원에 탐식 병원균 세균성 및 공정 요소를 인식 할 수있는 수상 세포 또는 대 식세포, 선천 면역의 성분을 포함하여 항원 제시 세포 (APC를). 장갑차가 병원균을 phagocytized 한 후, 그들은 일반적으로 그들이 T와 상호 작용 배수 림프절로 이동세포. T 림프구는 T 세포 수용체에 의해 특정 MHC 펩티드 복합체를 인식 할 수있다. 면역 시냅스 (IS) 항원 제시 8,9 동안 항원 - 로딩 APC 및 림프구 사이의 인터페이스에서 발생한다. 일부 박테리아는 식균 작용을 생존과 장갑차 내에서 체계적으로 보급 할 수 있습니다. 이보기에서 감염된 장갑차는 세균 저수지 또는 세균 확산 (10)를 용이하게 &quot;트로이 목마&quot;의 역할을한다. 장갑차 및 IS 형성 도중에 일어난다 림프구 사이의 긴밀한 접촉은 또한 막, 유전 물질 및 엑소 좀의 일부의 교환을위한 플랫폼으로 기능과 T 세포를 감염시킬 수있는 어떤 바이러스 탈취 할 수있다; 이 과정은 transinfection 11 ~ 13이라고합니다. 일부 병원성 세균 (리스테리아, 살모넬라 엔테과 시겔의 flexneri)은 생체 내에서 T 림프구를 침공과 행동 14-16을 수정할 수 있습니다. 우리는 가지고있다최근 T 림프구는 항원 제시 16의 과정 이전에 감염된 수지상 세포로부터 transinfection 의해 박테리아를 캡처 할 수있는 것을 설명했다. T 세포의 직접 감염보다 (1,000-4,000x) 대단히 더 효과적 transinfection에 의해 세균 캡처. 보다 transinfection 나타내는 T 세포 캡처 병원체 및 비 병원균 박테리아는 T 세포에 의해 구동되는 프로세스이다. 놀랍게도, 세포는 빠르게 캡처 박테리아를 죽이고 전문 식세포 (16)보다 그렇게 더 효율적으로 한 T (가슴) transinfected. 면역학 도그마 휴식이 결과, 적응 면역 세포는 선천성 면역의 가정 배타적이었다 기능을 수행 할 수 있음을 보여준다. 또, 유방 세포 염증성 사이토 카인의 다량 분비 및 생체 내에서 세균 감염으로부터 보호하는 것으로 나타났다. 여기에서 우리는에 세균 transinfection 과정을 연구하는 데 사용되는 다른 프로토콜을 제시마우스 모델. 이 모델은 박테리아에 감염된 뼈 구체적 I-Ab의 상호 작용 (17)의 맥락에서 OVA (OVAp)의 펩티드 3백23부터 3백39까지 대한 TCR의 특정 베어 OTII 트랜스 제닉 마우스에서 CD4 + T 세포의 사용에 기초한다 marrow- 안정적인 면역 시냅스를 형성 OVAp로드 유래 수지상 세포 (BMDCs) 18, 19,. T 세포 transinfection 시각화 및 형광 현미경을 사용하여 추적 될 수있다. 또한, 유동 세포 계측법, 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 박테리아 16, 20에 의해 방출 된 형광을 이용하여 감염된 세포를 검출하기 위해 사용될 수있다. 또한, T 세포는 transinfection 더 민감한 방법, 이벤트의 다수의 측정이 가능 젠타 생존 분석으로 정량 할 수있다. 겐타 마이신은 진핵 세포에 침투 할 수 없습니다 항생제이다. 따라서,이 항생제를 사용하는 것은 항생제 첨가 FR 살아남은 세포 내 박테리아의 분화를 허용(21) 사망했다 톰 외 것.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>r-GMCSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>SIGMA</td><td>L2630-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Na Pyruvate</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3023901</td><td></td></tr><tr><td>2-ME</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>OVAp OTII (323&ndash; 339)</td><td>GenScript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기 70uM</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 30 uM 주사기 Filcons 멸균</td><td>BD</td><td>340598</td><td></td></tr><tr><td>AutoMacs Classic</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-088-887</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Normon</td><td>624601.6</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Costar</td><td>3415</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Pronadisa</td><td>1231</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Pronadisa</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16%</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD8 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553029</td><td></td></tr><tr><td>IgM Biot</td><td>ImmunoStep</td><td>Clone RMM-1</td><td></td></tr><tr><td>B220 Biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553086</td><td></td></tr><tr><td>CD19 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553784</td><td></td></tr><tr><td>MHC-II Biot (I-A/I-E)</td><td>BD Biosciences</td><td>553622</td><td></td></tr><tr><td>CD11b biot</td><td>Immunostep</td><td>11BB-01mg</td><td></td></tr><tr><td>CD11c biot</td><td>Immunostep</td><td>11CB3-01mg</td><td></td></tr><tr><td>DX5 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553856</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553125</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32</td><td>ImmunoStep</td><td>M16PU-05MG</td><td></td></tr><tr><td>anti Salmonella</td><td>ABD Serotec</td><td>8209-4006</td><td></td></tr><tr><td>CD11cPE</td><td>BD Biosciences</td><td>553802</td><td></td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-0041-U100</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>553129</td><td></td></tr><tr><td>MHC-II (IA/I-E) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553623</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 항체, 고도의 교차 흡착</td><td>Invitrogen</td><td>A-21245</td><td></td></tr><tr><td>CMAC (7-아미노-4-클로로메틸쿠마린)</td><td>생명 기술</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td> 시<td>그마</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>스트렙타비딘 마이크로비즈</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

t 세포는 수지상 세포에서 transinfection에 의해 박테리아를 캡처

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

최근에는 앞서 설명한 것과는 반대로 적응면역세포의 패러다임인 CD4+ T세포가 감염된 수지상 세포(DC)에서 이식이라는 과정을 통해 박테리아를 포획한다는 것을 보여주었습니다. 여기에서는 항원 제시 과정에서 발생하는 감염 과정에 대한 분석을 설명합니다. 이 과정은 형질전환 OTII 마우스의 CD4+ T 세포를 사용하여 공개되었으며, 이 세포는 오보알부민(OVAp)의 펩타이드에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 가지고 있으므로 이 특정 OVAp가 로드된 감염된 수지상 세포와 안정적인 면역 복합체를 형성할 수 있습니다. DC-T 세포 전달 중 녹색 형광 단백질(GFP) 발현 박테리아의 역학은 라이브 셀 이미징으로 모니터링할 수 있으며 박테리아 감염의 정량화는 유세포 분석으로 수행할 수 있습니다. 또한, 이식은 세포 외 박테리아를 죽이지만 세포 내 박테리아는 죽이지 않는 비투과성 아미노글리코시드 항생제인 겐타마이신(gentamicin)을 사용하는 보다 민감한 방법으로 정량화할 수 있습니다. 이 고전적인 방법은 이전에 미생물학에서 박테리아 감염의 효율성을 연구하는 데 사용되었습니다. 이로써 우리는 일차 세포의 분리에서 transinfection의 정량화에 이르기까지 전체 프로세스의 프로토콜을 설명합니다.

유동 세포 계측법 및 겐타 마이신 생존 분석 그림 1은 세포를 획득하는 절차를 요약 한 것입니다. 여기에서 우리는 감염된 골수 유래-DC가 어떻게 두 개의 서로 다른 접근 방식을 통해 박테리아 transinfection을 측정하는 방법에서 쥐의 T 세포 박테리아 transinfection을 수행하는 방법을 설명했다. 수지상 9 일간 GM-CSF와 골수 세포를 배양하여 생성된다. 그리고 DCS는 OVA (OVAp)의 특정 펩타이드 나중에 그들을로드의 막에 MHCII을 증가 LPS와 숙성된다. 대조군으로, 어떤 DC가이 OVAp으로로드되지 않습니다. (OVAp -로드 및 비 로딩)는 모두 DC의 감염 다중도 (10)의 박테리아 (MOI)로 감염된다. 한편, CD4 + T 세포는 특정 OVAp 인식 OTII 트랜스 제닉 마우스의 림프절로부터 분리된다. (2)가 수행하고 적절한 음성 대조군을 포함...

여기 프로토콜은 사전에 감염된 수지상 세포 (DC)에서 transinfection 통해 항원 제시 동안 발생하는 CD4 + T 세포에 의해 세균 캡처를 측정하기 위해 제공됩니다. 일차 전지, DC, DC / T 세포 복합체 형성의 감염, 박테리아 T 세포 형질의 측정의 분리 : 우리는 필요한 단계를 수행하는 방법을 보여줍니다.

T 세포는 수지상 세포에서 Transinfection에 의해 박테리아를 캡처

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 마우스 세포 모델을 사용하여 박테리아의 CD4+T 세포 교차 감염을 정량화하는 것입니다. 생체 내(In vivo)에서 Listeria monocytogenes 및 Salmonella enteritidis와 같은 일부 병원성 박테리아는 T 림프구를 감염시키고 그 행동을 변화시킬 수 있습니다. 하지만 체외(in vitro)에서 T 세포는 감염시키기가 쉽지 않습니다.이러한 관찰을 바탕으로, 우리는 바이러스 감염 시 발생하는 것처럼 T 세포가 항원 제시 과정 중에 감염된 수지상 세포로부터 박테리아를 포착할 수 있는지 조사했습니다. 그 결과, T 세포가 박테리아를 포착한 후 이를 사멸시킨다는 것을 발견했습니다. 실제로, T 세포가 전문 포식세포보다 더 효율적으로 이 과정을 수행한다는 사실을 확인했습니다.이러한 결과는 적응 면역 세포가 선천 면역의 전유물로 여겨졌던 기능을 수행할 수 있음을 보여주며, 이는 면역학의 핵심 원칙과 상충됩니다. 오늘 우리는 마우스 모델에서 박테리아 교차 감염 과정을 연구하는 데 사용된 프로토콜을 제시하고자 합니다. 저와 Esteban Veiga가 두 명의 대학원생인 Guillermo Ramirez-Santiago, Raquelle Garcia-Ferreras, 그리고 테크니션인 Monica Torres-Torresano와 함께 이 절차를 시연하겠습니다.이 비디오에 설명된 모든 절차는 멸균된 배지, 기구, 피펫 팁 및 배양 접시만을 사용하여 후드 내에서 수행되어야 함에 유의하십시오. 조직 배양 처리가 되지 않은 멸균 15 centimeter 페트리 접시에 담긴 단일 마우스 유래 골수 유래 수지상 세포에 1 mg/mL 농도의 lipopolysaccharide 1 µL를 첨가합니다. 주요 조직 적합성 복합체 II(major histocompatibility complex II, MHC II) 발현을 증가시키기 위해 세포를 24시간 동안 배양합니다.배양 후, 유세포 분석을 수행하여 MHC II 발현과 분화를 확인합니다. 여기에서 보여주는 바와 같이 MHC II 발현이 확인되면, 세포를 멸균된 50 milliliter 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 5 millimolar EDTA가 포함된 PBS 10 milliliters를 첨가한 다음, 세포를 600 x g에서 원심분리합니다.원심분리가 완료되면, 세포를 10% FBS가 포함된 RPMI에 다시 부유시켜 세척한 후 다시 원

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 retroviral 전달을 사용하여 항원 - 특정 마우스 T - 세포를 생산하는 프로토콜을...

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

우리는 세포 성숙을 유발하지 않고 플라스미드 DNA 나 siRNA 중과 기본 인간 단핵구 파생 돌기 세포를 transfecting의 효율적인 방법으로서 최적화된 높은 처리량 nucleofection 프로토콜을 제시한다. 우리는 더 타겟 유전자 mRNA와 단백질 수준 모두에서 릭 - 전의 성공적인 siRNA의 입을 대한 증거를 제공합니다.

세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 Transfection을 위해 최적화된 프로토콜

따라서, 그것이 관여 단백질의 공간적 및 시간적 행위를 파악하는 것이 중요 신호 전달 이해하기 위해, 플라즈마 막 내에서 또는 세포 내 위치에 두 단백질의 compartmentalization 크게 신호 결과에 영향을 미칠 수있는 규제 메커니즘입니다. 우리는 여기서 T 세포의 신호 전달을 연구하는 TIRF 현미경 기반 시스템을 설명하지만, 광범위하게 적용됩니다.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

출처: Cruz-Adalia, A., et al. T 세포는 수지상 세포에서 이식을 통해 박테리아를 포획합니다. J. Vis. 경험. (2016).이 비디오는 항원 특이적 T 세포-수지상 세포 상호작용을 통한 박테리아 형질감염을 보여줍니다. 난아알부민 펩타이드를 나타내는 박테리아에 감염된 수지상 세포는 직접 또는 막으로 분리된 T 세포와 함께 배양됩니다. 직접 접촉은 면역학적 시냅스 형성을 가능하게 하여 박테리아 전달을 가능하게 하는 반면 막은 상호 작용을 방지합니다. 그런 다음 세포외 박테리아를 제거하기 위해 겐타마이신 처리가 수행됩니다.

면역학적 시냅스 형성을 통한 T 세포의 시험관 내 세균 이식

이 비디오는 유형이 불가능한 헤모필루스 인플루엔자(NTHi)를 통해 림프구를 자극하고 면역 반응을 평가하는 체외 기술을 보여줍니다. NTHi와 함께 분리된 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 배양하면 박테리아 세포가 T 림프구를 자극하여 사이토카인 생성을 유도합니다. 사이토카인의 분비를 억제하면 면역형광 염색을 수행하여 자극된 T 림프구에 축적된 세포 내 사이토카인을 검출합니다.

병원성 박테리아를 통해 림프구를 자극하는 체외 기술

여기, 우리는 레트로 바이러스 전달 및 테트라 사이클린의 부재 렌티 바이러스 벡터 (LV)의 구성 요소를 표현할 수있는 세포 라인을 만들 수 concatemeric 형질을 사용합니다. 이 LV는 GFP를 인코딩 및 수지상 세포 수용체 특정 당 단백질, SVGmu로 pseudotyped 있습니다.

항생 물질 규제 세포주 특히 수지상 세포를 대상으로 높은 titer의 렌티 바이러스 벡터를 생성

무 세포 HIV-1 입자와는 달리, 감염된 CD4 + T 세포를 형질 효과적으로 수지상 세포 (PDCS)에 의해 감지된다. 이 원고는 타입 I IFN의 방출에 의해 평가로서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 격리 PDCS는 PDCS 의해 선천성 센싱을 평가하는 HIV-1 감염 T 세포와 공동 배양 방법을 설명한다.

HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

여기에서는 인간 항응고 혈액의 밀도 구배 원심분리 후 말초 혈액 단핵 세포에서 자기 비드 분리에 의해 단핵구를 분리하는 방법을 보여줍니다. 5일 동안 배양한 후 인간 단핵구는 미성숙 수지상 세포로 분화되고 비임상 환경에서 실험 절차를 수행할 준비가 됩니다.

전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성

본 프로토콜에서, 장내 미생물-항원 특이적 T 세포 입양 상반염 모델이 기재된다. CD4+ T 세포는 CBir1 TCR 형질전환 마우스로부터 분리된다. 이들은 면역 지배적인 창자 microbiota 항원 CBir1 flagellin를 위해 특정합니다, 수신자 Rag1/-- 마우스로 전송되는, 장 염증으로 이끌어 내는.

CBir1 TCR 형질 전환 CD4+ T 세포의 입양 전달에 의한 장 염증유도

이 문서는 박테리오파지 람다의 감염의 휘황 라벨이 지정된 버전을 준비하기위한 절차를...

에 셀 운명을 따라<em&gt; E. 대장균</em&gt; 파지 람다에 의해 감염 후

배우세요 수지상 세포에서 CD4+ T 세포로의 세균 transinfection을 정량화하는 방법을. 마우스 세포 모델을 사용하여 면역 반응 중 T 세포의 세균 포획 및 살균 메커니즘을 탐구합니다.

T 세포는 수지상 세포에서 Transinfection에 의해 박테리아를 캡처

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