과도 대뇌 저산소증 - 허혈을 기반으로 혈전 성 뇌졸중 모델

본 실험 절차의 전반적인 목표는 안정적인 뇌경색을 유발하는 간단한 혈전성 뇌졸중 모델을 구축하고, 조직 플라스미노겐 활성제(tissue plasminogen activator) 또는 TPA 치료의 보호 효과를 평가하는 것입니다. 먼저, 우측 총경동맥(right common carotid artery, RCCA)의 이중 결찰과 결찰된 동물을 저산소 조건에 노출시켜 혈전증을 유도함으로써 일시적 대뇌 저산소 허혈(transient cerebral hypoxia ischemia, THI) 유도 과정을 보여줍니다. 30분간의 저산소 조건 유지 후, 경동맥의 두 매듭을 풉니다.

마지막 단계에서는 TPA 치료의 투여 및 효과 평가 과정이 제시됩니다. 대안적으로, 뇌혈류의 실시간 기록, 혈전 형성 및 혈관 폐쇄 정도를 조사할 수 있습니다. 이 프로토콜을 통해 성체 마우스의 자체 응고 시스템을 이용하여 혈전성 뇌졸중을 유도하고 휴지기를 가질 수 있습니다.

우리는 이 모델을 사용하여 허혈성 상태 가설 하에서 뇌가 자체 혈류를 어떻게 조절하는지 연구하고자 합니다. 또한, 이를 통해 혈전 치료법을 어떻게 개선할 수 있을지 연구할 것입니다. 뇌 경색 유도 과정 동안 적절한 체온과 원활한 호흡을 유지하는 것이 어려울 수 있으므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다.

유도 단계. 절차를 시작하기 최소 15분 전에 수행합니다. 수술대를 가온 패드 위에 놓고 37 °C로 설정한 후, 3 mL 주사기 배럴로 만든 넥 롤을 수술대 위에 놓습니다. 저산소증 시스템이 92.5% 질소로 균형을 맞춘 7.5% 산소 내 2% isof fluorine을 공급하도록 설정하고 온도 조절기를 조정합니다.

10~13주령, 22~30g의 C 57 black six 수컷 마우스를 수술대에 놓습니다. 발가락 꼬집기로 마취 상태를 확인한 후, 동물의 눈에 연고를 도포합니다. 네 다리를 목 방향으로 펴고, 말아서 의료용 테이프로 고정합니다.

그 다음 제모 크림을 사용하여 동물의 목 부위 털을 제거하고 수술 부위를 세척합니다. 이제 수술대를 해부 현미경 아래로 옮기고 정중선을 따라 피부의 오른쪽 경부 부위에 0.5 centimeter 절개를 가합니다. 미세 핀셋을 사용하여 기관과 근육을 벌려 우측 총경동맥을 노출시킨 후, 동맥 아래에 미리 잘라둔 5-0 silk 봉합사 두 개를 배치합니다.

경동맥을 미주신경과 주의해서 분리한 후, 우측 총경동맥(RCCA)에 5-0 silk 봉합사 두 개를 미리 절단 가능한 형태로 묶습니다. 그 다음 4-0 nylon 단필라멘트 봉합사를 사용하여 피부를 봉합하고 마우스를 빠르게 저산소증 시스템으로 옮깁니다. 동물의 코와 입에 페이스 마스크를 씌우고 직장 탐침을 삽입하여 저산소증 유도 과정 동안 체온이 37.5 °C로 유지되도록 합니다.

30분 후에 가열 램프를 조절하십시오. 마우스를 다시 수술대로 옮기고 두 개의 봉합사를 푸십시오. 그런 다음 조직 접착제로 상처 부위를 폐쇄하고 마우스를 케이지로 돌려보낸 뒤, 동물이 완전히 회복될 때까지 관찰하십시오.

또는, 저산소 허혈 중 및 후에 뇌혈류를 조사하기 위해 레이저 스펙클 대비 영상법을 사용할 수 있습니다. 동물을 복와위로 배치합니다. 다음으로, 두개골을 노출시키되 개방하지는 않도록 1cm 길이의 정중선 절개를 통해 두피를 엽니다.

그 후 즉시 동물을 혈류 영상 장치로 옮기고 뇌혈류 기록을 시작합니다. 제조사의 지침에 따라 FLPI 소프트웨어를 사용하여 뇌혈류 영상을 확인하고, 선택한 영역을 실시간으로 분석합니다. TPA 치료의 효과를 평가하려면 일시적인 일측성 경동맥 폐쇄 및 저산소증 유도 후 적절한 시점에 동물의 꼬리 정맥에 정맥 주사합니다.

그 후 일시적 뇌 저산소 허혈 발생 24시간 후에 in vivo TTC 염색을 통해 경색 부피를 정량화합니다. 다음 날, 진동 절단기(vibram)를 사용하여 1mm 두께의 절편을 제작합니다. 마지막으로, 디지털 현미경을 통해 4장의 뇌 절편 연속 이미지를 얻고, 적절한 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 손상되지 않은 반대측 뇌반구 면적에 대한 흰색 경색 부위 면적의 비율로 경색 부피를 정량화합니다.

본 절차 외에도, 다른 혈전 용해 방법들을 사용하여 그 효과와 임상적 가능성을 평가할 수 있습니다. 이 기술은 허혈성 뇌졸중 분야의 연구자들이 뇌 내 혈전 용해 치료를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.