복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

눈 자극 테스트의 전반적인 목표는 눈 자극 가능성에 따라 물질과 혼합물을 분류하고 라벨을 붙이는 것입니다. 이 절차는 조직 모델과 같은 3차원 재건된 각막을 사용합니다. 도착 시, 테스트 키트는 다음 날 분석 배지에서 하룻밤 동안 사전 배양되고, 조직은 수화되고, 이어서 양성 및 음성 대조군과 관심 테스트 화학 물질을 조직 표면에 복제하여 국소적으로 도포합니다.

일정 기간의 노출 테스트 후 화학 물질은 세척으로 제거됩니다. 조직은 신선한 분석 배지에서 사후 배양되고 화학 물질의 독성은 MTT 분석으로 평가됩니다. 궁극적으로, 실험 물품의 자극 가능성은 실험 물품 처리된 조직과 음성 대조군 처리된 조직의 상대적 생존력을 비교함으로써 평가할 수 있습니다.

신속한 미량 자극 테스트와 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 실험실 동물을 포함하지 않는다는 것입니다. 그것은 정상적인 인간 세포로 구성된 조직 모델 안구와 같은 체외 분해 된 각막을 사용합니다. 모든 유형의 물질 및 혼합물에 적용할 수 있으며 물질로 인해 안구 자극이나 심각한 눈 손상을 유발하는 화학 물질을 구별할 수 있습니다.

분류 및 라벨링이 필요하지 않은 무자극제. 상피 조직 또는 epi와 같은 재건된 인간 각막. 안구는 영양분이 세포로 전달되는 다공성 막이있는 삽입물로 준비됩니다.

재건된 조직은 각질화되지 않은 상피를 형성하여 각막화되지 않은 세포로 각막 상피를 모델링합니다. 상피 키트와 같은 인간 각막을 받으면 24웰 선적 컨테이너의 조직을 실온으로 평형을 이루고 15분 후 멸균 상태에서 24웰 조직 플레이트가 들어 있는 백을 열고 아그로스 젤과 인서트 사이에 기포가 있는지 모든 조직을 검사합니다. 삭감. 테이프를 엽니다.

멸균 거즈로 덮개를 제거하고 조직 표면을 검사합니다. 다음으로, 섭씨 37도 키트 분석 배지 1밀리리터를 사전 라벨링된 6개의 웰 플레이트의 웰로 분취합니다. 그런 다음 멸균 집게를 사용하여 멸균 거즈에 삽입물이 포함된 조직을 부드럽게 닦아내어 남아 있는 배송 문제를 제거하고 6개의 웰 플레이트의 개별 웰에 넣습니다.

1시간 후, 배지를 1ml의 신선한 섭씨 37도 분석 배지로 교체하고 표준 배양 조건에서 밤새 조직을 배양합니다. 다음 날, 저는 20마이크로리터의 칼슘과 마그네슘이 없는 DPBS를 각 조직의 정점 표면에 쓰다듬었습니다. DPBS가 조직 전체에 퍼지지 않으면 집게로 인서트를 부드럽게 잡고 플레이트를 두드려 식염수가 전체 조직 표면을 적시도록 합니다.

플레이트를 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 액체 테스트 물품으로 조직을 치료하려면 시간표에 따라 50 마이크로 리터의 음성 대조군, 양성 대조군 및 적절한 테스트 물품을 복제하여 적용하십시오. 트리트먼트가 전체 조직 표면을 덮도록 주의한 다음 삽입물을 30분 동안 배양하여 단단한 테스트 제품으로 조직을 처리합니다.

먼저 인서트를 멸균 표면으로 옮깁니다. 공기 중 고체 입자로 오염되지 않도록 플레이트를 덮은 상태로 유지하십시오. 그런 다음 수평을 맞춘 숟가락을 사용하여 시간표에 따라 50mg의 테스트 제품을 중복 조직에 국소적으로 바르고 치료가 전체 조직 표면을 덮도록 주의합니다.

또는 머리가 잘린 상태로 미리 채워진 1ml 주사기를 사용하십시오. 분말을 배양액에 직접 놓습니다. 단단한 시험 기사를 적용한 직후에 분말을 적용하기 위하여 플런저를 누르고, 그들의 6개의 우물 판에 삽입물을 돌려보내고 조직을 헹구기 위하여 6 시간 동안 조직을 배양하십시오.

처리 후, 노출 배양 종료 시 테스트 항목당 3,150mL 비커에 100ml의 DPBS를 채웁니다. 구부러진 집게로 인서트의 위쪽 가장자리를 잡고 우물에서 제거합니다. 그런 다음 겸자를 사용하여 동일한 처리에서 위쪽 가장자리로 두 개의 삽입물을 집어 올리고 깨끗한 흡수성 재료에 처리를 기울입니다.

다음으로, DPBS의 첫 번째 비커에 인서트를 담그고 2초 동안 원을 그리며 소용돌이치며 조직을 세척합니다. 그런 다음 인서트를 들어 올려 대부분 DPBS로 채우고 액체를 비커로 다시 디캔팅합니다. 첫 번째 비커에서 세척을 두 번 반복합니다.

그런 다음 마지막 세척 후 같은 방법으로 DPB S3의 두 번째 및 세 번째 비커에 있는 인서트를 각각 같은 방법으로 헹굽니다. 열린 끝이 아래를 향하도록 각 인서트를 약 45도 각도로 회전하고 윗입술을 흡수성 재료에 닿혀 남아 있는 DPBS를 디캔팅합니다. 그런 다음 즉시 조직을 5ml의 실온 분석 매체에 담그십시오.

담금 후 침지 기간이 끝날 때 사전 라벨링된 12웰 플레이트에서 분석 매체를 디캔팅하고 삽입물을 흡수성 물질에 블롯아웃합니다. 그런 다음 웰당 1밀리리터의 따뜻한 분석 배지가 들어 있는 새로운 6웰 플레이트로 삽입물을 옮기고 플레이트를 인큐베이터에 넣어 MTT 생존도 분석을 시작합니다. 인서트를 0.3ml의 갓 준비된 MTT 용액이 들어 있는 24웰 플레이트로 옮깁니다.

옮기기 전에 흡수성 재료에 삽입물을 두드리십시오. 인서트 아래에 갇힌 기포를 제거하고 3시간 후에 조직을 인큐베이터로 되돌리고 인서트 바닥을 흡수성 재료에 많이 놓습니다. 그런 다음 무착색제 액체 테스트 품목의 침수 추출을 위해 고체 또는 액체 착색제의 비 침수 추출을 위해 웰당 2밀리리터의 적절한 추출 용액을 포함하는 사전 라벨링된 24웰 플레이트에 삽입물을 담그십시오.

웰당 1ml의 추출 용액이 들어 있는 사전 라벨링된 6웰 플레이트로 인서트를 옮깁니다. 그런 다음 열 밀봉기 또는 파라폼으로 플레이트를 밀봉하여 증발을 억제하고 수중 추출이 끝날 때 부드럽게 흔들면서 실온에서 2-3시간 동안 오비탈 셰이커에서 추출합니다. 조직을 관통하고 그 후에 각 삽입 내의 액체를 다시 안으로 기울어지게 하고, 그 후에 조직을 가진 삽입물을 버리십시오.

각 웰에 추출물 용액을 혼합하고 각 샘플의 200마이크로리터 분취량 2개를 nons 침수 추출의 끝에 있는 회로도에 설명된 대로 사전 라벨링된 96 Well 플레이트의 적절한 well로 옮깁니다. 피어싱하지 않고 삽입물과 조직을 버리고 각각에 1ml의 추출 용액을 첨가합니다. 웰에서 추출 용액을 잘 혼합하고 방금 설명한 대로 각 샘플에서 2개의 200마이크로리터 분취액을 사전 라벨링된 96 웰 플레이트의 적절한 웰로 옮깁니다.

마지막으로, 기준 필터를 사용하지 않고 570나노미터 파장에서 96웰 분광 광도계에서 샘플의 광학 밀도를 읽고 결과를 스프레드시트에 입력하여 각 조직 부유도를 계산합니다. 여기 텍스트 프로토콜에 표시된 테스트 화학적 간섭으로 인한 보정을 고려하여 10개의 테스트 항목과 음성 및 양성 대조군으로 수행된 대표적인 눈 자극 테스트 결과가 이 실험에서 표시됩니다. 100% 조직 생존율에 해당하는 음성 대조군에 대한 평균 광학 밀도 1.31이 관찰되었으며, 상대 조직 생존율은 31.2%였으며, 양성 대조군 검사 1, 2, 4, 7 및 8은 60% 이상의 조직 변동성을 보였으며, 이러한 물품은 비자극성 검사 논문 3, 5, 6, 9 및 10으로 분류되었습니다.

반면에, 60% 이하의 조직 변동성을 보임으로써 자극성으로 분류되었습니다. 이 실험에서 중복 조직 간의 조직 생존율 차이는 테스트 기사 2를 제외한 모든 논문에서 20% 미만이었습니다. 따라서 테스트 항목 2를 제외한 모든 테스트 항목에 대한 결과는 모든 눈 자극 테스트 허용 기준을 충족하므로 자격이 있는 것으로 간주되었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 조직 모델 4와 같은 체외 재건 인간 각막, 화학 물질의 위험 식별 라벨링을 활용하여 DICATION 테스트를 수행하는 방법을 잘 이해해야 합니다. 이 절차는 계층 테스트 전략의 일부로 EOC D 테스트 지침에서 구현되었습니다.