복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

안구 자극 시험의 전반적인 목적은 물질과 혼합물을 안구 자극 잠재력에 따라 분류하고 표시하는 것입니다. 이 절차는 3차원 재구성 각막 유사 조직 모델을 이용합니다. 테스트 키트가 도착하면 시험 배지에서 하룻밤 동안 사전 배양하며, 다음 날 조직을 수화시킨 후 양성 대조군, 음성 대조군 및 해당 시험 화학 물질을 조직 표면에 두 번씩 국소적으로 도포합니다.

정해진 노출 시간이 지나면 세척을 통해 테스트 화학 물질을 제거합니다. 조직을 새로운 분석 배지에서 후배양한 후, MTT 분석을 통해 화학 물질의 독성을 평가합니다. 최종적으로, 테스트 물질 처리 조직의 상대적 생존율을 음성 대조군 처리 조직과 비교함으로써 테스트 물질의 자극 가능성을 평가할 수 있습니다.

급성 안자극 시험과 같은 기존 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 실험 동물을 사용하지 않는다는 것입니다. 이 방법은 정상 인간 세포로 구성된 인체 각막 유사 조직 모델인 in vitro 재구성 각막 모델을 활용합니다. 이는 모든 종류의 물질과 혼합물에 적용 가능하며, 안자극 또는 심각한 안구 손상을 유발하는 화학 물질을 일반 물질과 구별할 수 있습니다.

분류 및 표시가 필요하지 않은 비자극성 물질입니다. 재구성된 인간 각막 유사 상피 조직 또는 epi. Ocular는 영양분이 세포로 전달될 수 있도록 다공성 막이 있는 인서트 내에서 준비됩니다.

재구성된 조직은 점진적으로 층을 이루지만 각질화되지 않은 세포들로 구성되어 각막 상피를 모델링하는 비각질화 상피를 형성합니다. 인간 각막 유사 상피 키트를 수령하면 24웰 운송 용기에 담긴 조직을 실온에서 평형화하십시오. 15분 후, 멸균 조건에서 24웰 조직 플레이트가 담긴 백을 열고, 아그로스 겔(agros gel)과 인서트 사이에 기포가 있는지 모든 조직을 점검하십시오. 절단하십시오. 테이프를 여십시오.

멸균 거즈로 커버를 제거하고 조직 표면을 검사합니다. 다음으로 37 °C의 키트 분석 배지 1 mL를 미리 라벨링된 6-웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 그 후, 멸균 핀셋을 사용하여 인서트에 포함된 조직을 멸균 거즈로 가볍게 닦아 남아 있는 운송액을 제거하고, 이를 6-웰 플레이트의 개별 웰에 넣습니다.

1시간 후, 배지를 37°C의 신선한 분석용 배지 1mL로 교체하고, 표준 배양 조건에서 조직을 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 각 조직의 정단 표면에 칼슘 및 마그네슘이 없는 DPBS 20µL를 떨어뜨립니다. DPBS가 조직 전체로 퍼지지 않을 경우, 핀셋으로 인서트를 가볍게 잡고 플레이트를 톡톡 쳐서 식염수가 조직 표면 전체를 적시도록 합니다.

플레이트를 30분 동안 배양합니다. 그다음 액상 시험물질로 조직을 처리하기 위해, 일정표에 따라 음성 대조군, 양성 대조군 및 적절한 시험물질을 50 µL씩 2회 반복하여 도포합니다. 처리가 조직 표면 전체를 덮도록 주의하십시오. 고상 시험물질로 조직을 처리하려면 인서트를 30분 동안 배양합니다.

먼저, 인서트를 멸균된 표면으로 옮깁니다. 공기 중의 고체 입자로 인한 오염을 방지하기 위해 플레이트 덮개를 닫아 둡니다. 그런 다음, 수평이 맞춘 스푼을 사용하여 시간표에 따라 중복 조직 위에 시험 물질 50 milligrams를 국소적으로 도포하며, 처리제가 조직 표면 전체를 덮도록 주의합니다.

또는 머리 부분이 절단된 1 mL 사전 충전 주사기를 사용하십시오. 분말을 배양물 위에 직접 배치하려면, 고체 시험 물질을 도포한 직후 플런저를 눌러 분말을 도포하십시오. 그 후 인서트를 6-웰 플레이트에 다시 넣고 조직을 6시간 동안 배양하여 세척하십시오.

처치 후, 노출 배양 단계가 끝나면 시험 물질당 3개의 150 milliliter 비커에 DPBS 100 milliliters를 채웁니다. 곡선 핀셋으로 인서트의 상단 가장자리를 잡아 웰에서 제거합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 동일한 처치를 받은 인서트 두 개를 상단 가장자리로 집어 올려 깨끗한 흡수성 재료 위에 처치액을 따라 버립니다.

다음으로, 인서트를 첫 번째 DPBS 비커에 담그고 원을 그리며 흔드는 동작으로 2초 동안 조직을 세척합니다. 그다음 인서트를 들어 올려 DPBS가 대부분 채워지게 한 후, 액체를 다시 비커에 따라냅니다. 첫 번째 비커에서 이 세척 과정을 2회 반복합니다.

그런 다음 마지막 세척 후와 동일한 방식으로 DPBS가 담긴 두 번째와 세 번째 비커에서 인서트를 각각 3회씩 헹굽니다. 각 인서트를 개구부가 아래를 향하도록 약 45도 각도로 기울이고, 윗부분의 가장자리를 흡수성 재질에 접촉시켜 남아 있는 DPBS를 제거합니다. 그 후 즉시 조직을 상온의 분석 배지 5 mL에 담급니다.

침지 기간이 종료되면, 미리 라벨을 붙인 12웰 플레이트에서 분석 배지를 따라내고 흡수성 물질로 인서트의 물기를 제거합니다. 그 다음, 웰당 1 mL의 따뜻한 분석 배지가 들어 있는 새로운 6웰 플레이트로 인서트를 옮기고, 플레이트를 인큐베이터에 넣어 MTT 생존능 분석을 시작합니다. 이후 인서트를 새로 제조한 MTT 용액 0.3 mL가 들어 있는 24웰 플레이트로 옮깁니다.

이식물을 옮기기 전에 흡수성 재료 위에서 가볍게 두드려 닦아냅니다. 이식물 아래에 갇힌 공기 방울을 제거하고 3시간 후에 조직을 인큐베이터로 되돌리며, 이때 이식물 바닥을 흡수성 재료 위에 놓습니다. 그다음 비색성 액체 시험물질의 침지 추출을 위해서는, 웰당 2mL의 적절한 추출 용액이 담겨 있고 미리 라벨을 붙인 24웰 플레이트에 이식물을 침지시킵니다. 고체 또는 액체 색소의 비침지 추출 시에도 동일하게 수행합니다.

미리 라벨을 붙인 6웰 플레이트의 각 웰에 추출 용액 1 mL씩을 넣고 인서트를 옮깁니다. 그 다음 증발을 막기 위해 열 밀봉기나 파라필름으로 플레이트를 밀봉하고, 상온의 오비탈 셰이커에서 2~3시간 동안 추출하며, 침지 추출 마지막 단계에서는 완만하게 흔들어 줍니다. 조직을 뚫어준 후 각 인서트 내의 액체를 웰로 다시 따라내고, 조직이 포함된 인서트는 폐기합니다.

각 웰의 추출액을 섞고, 비침지 추출 단계 끝의 도식에 표시된 대로 각 샘플의 200 µL 분주액 두 개를 미리 라벨링된 96웰 플레이트의 적절한 웰로 옮깁니다. 인서트와 조직을 뚫지 않은 상태로 폐기하고, 각 웰에 추출액 1 mL를 추가합니다. 웰 내의 추출액을 잘 섞은 후, 방금 시연한 것과 동일하게 각 샘플에서 200 µL 분주액 두 개를 미리 라벨링된 96웰 플레이트의 적절한 웰로 옮깁니다.

마지막으로, 레퍼런스 필터를 사용하지 않고 96-well 분광광도계를 사용하여 570 nanometer 파장에서 시료의 흡광도를 측정하고, 그 결과를 스프레드시트에 입력하여 각각의 조직 생존율을 계산합니다. 여기의 텍스트 프로토콜에 명시된 대로 시험 물질의 간섭으로 인한 보정 사항을 반영하십시오. 본 실험에서는 10가지 시험 물질과 음성 및 양성 대조군을 사용하여 수행한 대표적인 안구 자극 시험 결과가 제시되어 있습니다. 100% 조직 생존율에 해당하는 음성 대조군의 평균 흡광도는 1.31로 관찰되었습니다. 양성 대조군의 경우 상대적 조직 생존율이 31.2%였으며, 시험 물질 1, 2, 4, 7, 8은 60% 이상의 조직 생존율을 보여 비자극성 물질로 분류되었습니다. 시험 물질 3, 5, 6, 9, 10 또한 마찬가지입니다.

반면에, 조직 생존율이 60% 이하로 나타나 자극제로 분류되었습니다. 본 실험에서 중복 조직 간의 조직 생존율 차이는 시험 물질 2를 제외한 모든 테스트 대상 물질에서 20% 미만이었습니다. 따라서 시험 물질 2를 제외한 모든 시험 물질의 결과는 안구 자극 시험 수락 기준을 모두 충족하였으므로 적격한 것으로 간주되었습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 화학 물질의 유해성 확인 표지를 위해 in vitro 재구성 인간 각막 유사 조직 모델 4를 이용한 DICATION 시험을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차는 단계별 시험 전략의 일부로 OECD 시험 지침에 구현되었습니다.