마우스 차 간세포에서 지방산 산화 및 지방 생성의 결정

이 절차의 전반적인 목표는 1차 마우스 간세포에서 지방산 대사를 평가하는 것입니다. 이것은 먼저 소화 기능이 있는 쥐의 간을 매질하여 제거한 다음 간세포를 분리함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 콜라겐 코팅 플레이트에서 간세포를 배양하는 것입니다.

다음으로, 간세포는 테스트할 실험적 개입으로 치료됩니다. 마지막 단계는 무선 표지된 기질이 있는 곳에서 세포를 배양하는 것입니다. 궁극적으로, 액체 섬광 분석은 일차 간세포의 지방산 산화 또는 지방 형성에 대한 다양한 약리학적 또는 유전적 개입의 효과를 보여주는 데 사용됩니다.

이 방법은 특정 약리학 및 유전 적 개입이 간세포 생물학에 미치는 영향을 포함하여 신진 대사 및 당뇨병 분야의 몇 가지 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 두 가지 이유로 중요합니다. 첫째, 간세포 건강에 영향을 미치는 특정 관류 상태를 얻기가 어렵고, 둘째, 방출 이산화탄소의 정량화입니다.

가스는 직관적이지 않습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Tom Akey입니다. 멸균 튜브의 한쪽 끝을 예열 간 관류, 매체에 넣고 다른 쪽 끝을 폐기물 용기에 넣어 연동 펌프를 설정합니다.

튜브의 전체 길이가 매체로 채워질 때까지 펌프를 작동하십시오. 관심있는 마우스를 희생 한 후 마우스 복부에 70 % 에탄올을 자유롭게 뿌립니다. 그런 다음 뭉툭한 끝 가위를 사용하여 복부 길이인 진피를 통해 정중선을 절개하고 측면으로 반사합니다.

내장을 노출시키기 위해 복막을 유사하게 절개합니다. 뭉툭한 도구를 사용하여 장을 부드럽게 옮깁니다. 복부 혈관 구조를 노출시키려면 복부 하대정맥을 찾아 신장 정맥 원위, 봉합사 원위부의 혈관 아래에 봉합사를 놓습니다.

바늘과 카테터를 하대정맥에 삽입하고 봉합사 너머로 전진시킵니다. 바늘이 제자리에 있는 상태에서 카테터 주위에 봉합사를 묶어 제자리에 고정한 다음 조심스럽게 바늘을 제거합니다. 올바르게 수행하면 피펫을 사용하여 카테터를 통해 혈액이 흐릅니다.

카테터의 나머지 부분을 관류 매체로 채우고 공기가 없는지 확인합니다. 그런 다음 세심한 주의를 기울여 튜브를 카테터에 부착합니다. 그런 다음 날카로운 팁 가위로 횡격막을 조심스럽게 구멍을 뚫고 측면 절개를 하여 흉강을 노출시킵니다.

담낭과 흉막 혈관 구조를 피하도록 주의하면서 간 정맥 바로 근위부에 있는 흉부 하대정맥 주위에 불독 클램프를 놓습니다. 그런 다음 문맥을 자르고 분당 3-4밀리리터로 펌프를 켭니다. 약 20ml의 관류 배지를 사용하여 간 관류 배지로 간을 5분 동안 관류합니다.

이 기간 동안 간의 색이 빨간색에서 회색 황갈색으로 즉각적으로 변하는 것을 관찰하십시오. 간의 일부가 빨간색으로 유지되면 관류가 불량하고 성공적인 분리 가능성이 크게 감소함을 나타냅니다. 5분간 관류한 후 펌프를 멈추고 튜브를 간 소화 매체로 옮깁니다.

펌프를 다시 시작하고 10-15분 동안 간을 관류합니다. 매체가 소진 될 때까지 분당 3-4 밀리리터. 관류가 끝나면 펌프를 멈춥니다.

간은 분홍빛이 도는 색조를 띠고 다소 확대된 것처럼 보여야 합니다. 이 시점에서 조심스럽게 절제하여 간을 절제하십시오. 10cm 조직 배양 접시에 옮겨 담낭을 제거합니다.

다음으로 10ml의 도금 배지를 간에 넣고 메스를 사용하여 간을 부드럽게 긁기 시작합니다. 간세포를 제거하려면 100미크론 세포 여과기로 현탁액을 여과하고 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 추가로 10ml의 도금 매체로 플레이트를 세척하고 50ml 원추형 튜브에서 액체를 당깁니다.

그런 다음 세포를 섭씨 4도에서 펠릿화하고 350G에서 5분 동안 원심주입하고 배지를 흡인하고 세포 펠릿을 10밀리리터의 도금 배지에 재현탁시킵니다. 다음으로, 폴리비닐페론으로 코팅된 90% 콜로이드 실리카 10ml를 부드럽게 혼합한 후 이전과 같이 세포를 펠릿화합니다. 원심분리 후, 혼합물 위에 떠 있는 죽은 세포층을 흡인합니다.

그런 다음 살아있는 펠릿 세포를 20ml의 도금으로 두 번 세척합니다. 중간 소생술. 도금 매체의 10 밀리리터에 있는 마지막 세포 펠릿을 중단하고 hemo cytometer 장소 90, 교원질에 의하여 입힌 24 좋은 배양 접시로 우물 당 000의 세포를 사용하여 세포를 세십시오 37 섭씨 온도 그리고 5%carbon 2 시간, 분석실험 시작하기 전에 16 20 시간 동안 판을 잠복하십시오.

따뜻한 PBS로 세포를 두 번 씻고 세포를 혈청이 없는 혈청 결핍으로 변경합니다. 20 나노몰의 글루카곤이 함유된 매체. 분석 당일 아침에 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 세포를 배양하고 이산화탄소를 5%

사전 배양 배지를 준비한 다음 혈청 고갈을 교체합니다. 배양 전 배지의 경우 배지. 이 혼합물의 세포를 섭씨 37도에서 배양 중 2 시간 동안 5 % 이산화탄소로 배양합니다.

배양이 끝나기 약 15분 전에 질소 하에서 에탄올 용매를 증발시켜 C 14 팔미테이트의 웰당 0.5 마이크로 큐리를 건조하고, 0.1에서 마이크로 퀴리당 12.5 마이크로리터로 C 14 팔미테이트를 재현탁시킨다. 일반 수산화나트륨은 혼합물을 섭씨 70도에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 3 부피의 따뜻한 사전 배양 (중간)을 추가하고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.

플레이트를 부드럽게 흔들어 25마이크로리터의 희석된 C 14 팔미테이트 혼합물을 각 웰에 스파이크하고 섭씨 37도에서 90분 동안 배양합니다. 이것은 분석 플레이트입니다 배양 중에 멸균 24 웰 플레이트에서 덮개를 제거하고 각 웰의 바닥에 2cm x 2cm 크기의 여과지 조각을 놓습니다. 그런 다음 마이크로 피펫 팁 상자와 같은 큰 직사각형 물체를 사용하여 4인치 x 7인치 크기의 매개변수 조각으로 플레이트를 오버레이합니다.

우물에 파라폼을 문질러 우물 개구부에서 파라폼을 천공하고 플레이트의 나머지 부분에 밀봉을 만듭니다. 그런 다음 퍼퓸의 천공 된 원을 제거하십시오. 지금 외피의 끝 10 분 전에 우물을 덮고, 여과지가 액체의 전부를 흡수한다는 것을 확인하는 여과지 판의 각 우물에 3개의 정상적인 수산화나트륨의 200 마이크로리터를 추가하십시오.

배양이 끝나면 분석 플레이트를 액체 질소로 동결합니다. 다음으로, 분석 플레이트의 각 웰에 70%당 열산 100마이크로리터를 추가합니다. 즉시 여과지 플레이트로 덮고 플레이트를 궤도 셰이커에 놓습니다.

실온에서 80RPM의 궤도 속도로 플레이트를 2시간 동안 흔듭니다. 그런 다음 여과지 사각형을 섬광 바이알에 있는 4ml의 액체 섬광 유체로 옮겨 이산화탄소 분율을 측정하고 섬광 계수기에서 C 14 신호를 측정하여 산 용해성 물질을 측정합니다. 400마이크로리터의 중액을 1.5밀리리터 마이크로 퍼지 튜브 원심분리기로 최대 속도로 10분 동안 이동한 다음 생성된 상등액 100마이크로리터를 클로로포름과 메탄올의 2:1 혼합물 500마이크로리터에 첨가합니다.

혼합물을 잠시 소용돌이친 다음 혼합물과 소용돌이에 250마이크로리터의 물을 첨가합니다. 다시, 천 Gs.Then 이동 상부 단계의 10 분 동안 원심분리기 표본은 섬광 작은 유리병에 있는 액체 섬광 액체의 4 밀리리터에 위 단계의 200 마이크로리터를 이동하고, 세포의 혈청 굶주리기 뒤에 C 14 신호를 측정합니다. 세포를 지방 형성 배지로 변경합니다.

테스트할 관심 화합물을 추가한 다음 배양 기간 후 2시간 동안 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 세포를 배양합니다. 120 마이크로 리터의 0.1 일반 염산을 첨가하여 세포를 용해하기 전에 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 각각에 웰을 잘 긁어 용해물을 방출한 다음 용해물 100마이크로리터를 1.5밀리리터 마이크로 퍼지 튜브에 피펫팅합니다.

다음으로, 클로로포름과 메탄올의 2:1 혼합물 500마이크로리터를 각 튜브에 추가합니다. 잠시 소용돌이친 다음 실온에서 5분 동안 배양합니다. 250 마이크로 리터의 물 소용돌이에서 배양 한 후 실온에서 추가로 5 분 동안 샘플을 배양합니다.

다음 3000 Gs.Carefully에 10 분 동안 표본을 분리기를 하십시오 분리한 액체의 저상을 섬광 작은 유리병에 있는 액체 섬광 액체의 4 밀리리터로 옮기고, 섬광 카운터를 사용하여 트리티움 활동을 측정하십시오. 이 절차는 일반적으로 마우스당 1,000만에서 3,000만 개의 간세포를 분리하는 결과를 낳습니다. 하룻밤 배양 후 건강한 세포가 육각형으로 나타나며 그 중 많은 세포가 핵이 형성됩니다.

건강하지 않은 배양에는 종종 세포 사멸을 나타내는 과립 또는 기포가 포함되어 있습니다. 지방산 산화 분석의 결과는 F-C-C-P-A 세포 호흡 촉진제와 호흡 억제제인 올리고 마이신의 첨가를 완전한 산화를 측정하기 위해 차량 대조군과 비교한 것입니다. 산성 용해성 물질에 대한 이산화탄소의 비율이 계산됩니다.

FCCP와 같이 세포 호흡을 촉진하는 물질은 이 비율을 이산화탄소로 이동하여 TC를 통해 더 많은 산화를 나타냅니다. 호흡 사슬의 순환 억제제는 측정될 때 전체의 산화를 감소시킬 것입니다. FCCP와 같은 지방산 산화를 향상시키거나 올리고 마이신과 같은 TP 합성을 감소시키는 리포 활성 화합물의 경우, 비히클 대조군과 비교할 때 배양된 간세포에서 리포 활성을 감소시킵니다. 이 절차를 시도하는 동안, 동물을 희생시킨 후 완전하고 시기적절한 방식으로 풍성함이 일어나도록 하는 것이 중요하다.

또한 지방산 산화 분석 중에 매체의 완전한 동결은 이산화탄소 가스의 재현 가능한 측정을 위해 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 원발성 간세포를 분리하는 방법과 이러한 세포를 사용하여 체외에서 지방산 산화 및 지방 형성을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.