마우스 차 간세포에서 지방산 산화 및 지방 생성의 결정

본 절차의 전반적인 목적은 일차 배양 마우스 간세포에서 지방산 대사를 평가하는 것입니다. 이는 먼저 소화 배지를 사용하여 마우스 간을 관류하고, 간을 적출한 후 간세포를 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 콜라겐이 코팅된 플레이트에서 간세포를 배양하는 것입니다.

다음으로, 간세포에 테스트하려는 실험적 처리를 수행합니다. 마지막 단계는 방사성 표지 기질이 있는 상태에서 세포를 배양하는 것입니다. 최종적으로, 액체 신틸레이션 분석을 통해 다양한 약리학적 또는 유전적 처리가 일차 간세포의 지방산 산화 또는 지방 생성에 미치는 영향을 확인합니다.

이 방법은 특정 약리학적 및 유전적 개입이 간세포 생물학에 어떻게 영향을 미치는지 등 대사 및 당뇨병 분야의 여러 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 두 가지 이유로 매우 중요합니다. 첫째, 간세포의 건강에 영향을 미치는 특정 관류 조건을 확보하는 것이 어렵기 때문이며, 둘째, 방출되는 이산화탄소의 정량화 때문입니다.

가스는 직관적으로 이해하기 어렵습니다. 이 절차를 시연할 사람은 제 실험실의 대학원생인 Tom Akey입니다. 멸균 튜빙의 한쪽 끝을 미리 데워둔 간 관류 배지에 넣고, 다른 쪽 끝을 폐기물 용기에 넣어 연동 펌프를 설정하십시오.

튜브 전체에 배지가 채워질 때까지 펌프를 작동시킵니다. 대상 마우스를 희생시킨 후, 마우스의 복부를 70% 에탄올로 충분히 분무합니다. 그런 다음 뭉툭한 가위를 사용하여 진피를 따라 복부 길이만큼 정중선 절개를 하고 측면으로 젖힙니다.

내장을 노출시키기 위해 복막에 유사한 절개를 가합니다. 뭉툭한 기구를 사용하여 장을 조심스럽게 밀어냅니다. 복부 혈관계를 노출시키려면 복부 하대정맥의 위치를 찾고, 신정맥의 원위부 혈관 아래에 봉합사를 배치합니다.

하대정맥에 바늘과 카테터를 삽입하고 봉합사 너머로 전진시킵니다. 바늘이 삽입된 상태에서 봉합사를 카테터 주위로 묶어 고정시킨 후 바늘을 조심스럽게 제거합니다. 올바르게 수행되었다면, 피펫을 사용하여 카테터를 통해 혈액이 흐르게 됩니다.

카테터의 나머지 영역을 관류 배지로 채우고 공기가 유입되지 않았는지 확인합니다. 그다음 매우 주의하여 튜브를 카테터에 연결합니다. 이어서, 끝이 날카로운 가위로 횡격막을 조심스럽게 천자하고 측면 절개를 통해 흉강을 노출시킵니다.

담낭과 흉막 혈관이 손상되지 않도록 주의하면서, 간정맥 바로 근위측의 흉부 하대정맥에 불독 클램프를 설치합니다. 그 다음 문맥을 절단하고 펌프를 분당 3~4mL 속도로 작동시킵니다. 약 20mL의 간 관류액을 사용하여 5분 동안 간을 관류합니다.

이 시간 동안 간의 색깔이 빨간색에서 회갈색으로 즉시 변하는지 관찰하십시오. 간의 일부가 여전히 빨간색으로 남아 있다면, 이는 관류가 제대로 이루어지지 않았음을 나타내며 성공적인 분리 가능성이 크게 낮아집니다. 5분간의 관류 후, 펌프를 멈추고 튜브를 간 소화 배지로 옮기십시오.

펌프를 다시 가동하고 간을 10분에서 15분 동안 추가로 관류합니다. 배지가 모두 소진될 때까지 분당 3~4mL의 속도로 수행합니다. 관류가 끝나면 펌프를 정지합니다.

간은 분홍빛을 띠며 어느 정도 비대해진 상태여야 합니다. 이때 세밀한 박리를 통해 간을 적출하십시오. 10 centimeter 조직 배양 접시로 옮긴 후 담낭을 제거하십시오.

다음으로, 간에 10 milliliters의 도말 배지를 추가하고, 메스로 간을 부드럽게 긁어내기 시작합니다. 간세포를 분리하기 위해, 현탁액을 100 micron 세포 여과기로 여과하여 50 milliliter 원심 튜브로 옮깁니다. 10 milliliters의 도말 배지를 추가하여 플레이트를 세척하고, 50 milliliter 원심 튜브에 있는 액체를 회수합니다.

그런 다음 4°C에서 350 Gs로 5분간 원심분리하여 세포를 펠릿화하고, 배지를 흡입하여 제거한 후 세포 펠릿을 10 mL의 도말 배지에 다시 현탁합니다. 다음으로, polyvinyl perone이 코팅된 90% colloidal silica 10 mL를 첨가하여 부드럽게 혼합한 후, 이전과 동일하게 세포를 펠릿화합니다. 원심분리 후, 혼합물 상단에 떠 있는 죽은 세포 층을 흡입하여 제거합니다.

그 후 펠렛 형태의 생존 세포를 20 mL의 도말 배지로 두 번 세척합니다. 최종 세포 펠렛을 10 mL의 도말 배지에 현탁하고 혈구계(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 콜라겐이 코팅된 24-well 배양 접시의 웰당 90,000개의 세포를 분주합니다. 분석 시작 16~20시간 전, 플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 2시간 동안 배양합니다.

세포를 따뜻한 PBS로 2회 세척하고, 20 nanomoles의 glucagon이 포함된 무혈청 기아 배지로 교체합니다. 분석 당일 아침까지 37°C, 5% CO₂ 조건에서 세포를 하룻밤 동안 배양합니다.

사전 배양 배지를 준비한 다음 혈청 기아 상태로 교체하십시오. 사전 배양용 배지를 사용합니다. 배양하는 동안 세포를 이 혼합액에 넣고 37°C, 5% CO2 조건에서 2시간 동안 배양하십시오.

질소 기류 하에서 에탄올 용매를 증발시켜 웰당 0.5 $\mu$Ci의 $^{14}\text{C}$ palmitate를 건조합니다. 배양 종료 약 15분 전에 $^{14}\text{C}$ palmitate를 0.1 N sodium hydroxide에서 $\mu\text{Ci}$당 12.5 $\mu\text{L}$의 비율로 재현탁합니다. 혼합물을 70 ${}^\circ\text{C}$에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 따뜻한 사전 배양 배지를 3배 부피로 첨가하고 피펫팅하여 섞습니다.

플레이트를 가볍게 흔들어 각 웰에 희석된 C 14 palmitate 혼합물 25 µL를 첨가하고 37 °C에서 90분 동안 배양합니다. 이것이 분석 플레이트입니다. 배양하는 동안, 멸균된 24-웰 플레이트의 덮개를 제거하고 각 웰 바닥에 2 cm x 2 cm 크기의 여과지 조각을 하나씩 넣습니다. 그런 다음 마이크로 피펫 팁 박스와 같은 크고 직사각형인 물체를 사용하여 4인치 x 7인치 크기의 파라필름 조각으로 플레이트를 덮습니다.

웰 입구 부분의 파라폼을 문질러 구멍을 내어 웰을 개방하고, 플레이트의 나머지 부분은 밀봉 상태를 유지합니다. 그 후 구멍이 뚫린 파라폼 원형 조각들을 제거합니다. 배양 종료 10분 전에 웰을 덮고, 필터 페이퍼 플레이트의 각 웰에 3N 수산화나트륨 200 µL를 첨가하며, 이때 필터 페이퍼가 액체를 모두 흡수하도록 합니다.

배양 종료 후, 액체 질소에 분석 플레이트를 급속 냉동합니다. 그 다음, 분석 플레이트의 각 웰에 70% perchloric acid 100 µL를 첨가합니다. 즉시 거름종이 플레이트로 덮고 플레이트를 궤도 쉐이커(orbital shaker) 위에 놓습니다.

상온에서 80 RPM의 궤도 속도로 플레이트를 2시간 동안 흔들어 줍니다. 그 다음, 필터 페이퍼 사각형을 신틸레이션 바이알에 담긴 4 mL의 액체 신틸레이션 용액으로 옮겨 이산화탄소 분율을 측정하고, 신틸레이션 카운터로 C 14 신호를 측정하여 산 가용성 물질을 측정합니다. 배지 400 µL를 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 옮겨 최대 속도로 10분 동안 원심분리한 후, 생성된 상층액 100 µL를 클로로포름과 메탄올의 2:1 혼합물 500 µL에 추가합니다.

혼합물을 짧게 볼텍싱한 후, 혼합물에 250 µL의 물을 추가하고 볼텍싱합니다. 다시 샘플을 1,000 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액 200 µL를 신틸레이션 바이알에 든 4 mL의 액체 신틸레이션 용액으로 옮기고, 세포를 혈청 굶김 처리한 후 C 14 신호를 측정합니다. 세포를 지방 생성 배지로 교체합니다.

테스트할 관심 화합물을 첨가한 후, 37°C, 5% CO₂ 조건에서 2시간 동안 세포를 배양합니다. 0.1 N 염산을 120 µL 첨가하여 세포를 용해시키기 전, PBS로 세포를 2회 세척합니다. 각 웰의 바닥을 긁어 용해물을 회수한 다음, 용해물 100 µL를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다.

다음으로, 클로로포름과 메탄올을 2:1 비율로 혼합한 용액 500 µL를 각 튜브에 첨가합니다. 짧게 볼텍싱한 후, 실온에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후 250 µL의 물을 넣고 볼텍싱한 다음, 시료를 실온에서 5분 더 배양합니다.

그다음 샘플을 3000 Gs에서 10분 동안 원심분리합니다. 분리된 액체의 하층을 신중하게 신틸레이션 바이알에 담긴 4 mL의 액체 신틸레이션 용액으로 옮기고, 신틸레이션 카운터를 사용하여 트리튬 활성도를 측정합니다. 이 절차를 통해 일반적으로 마우스당 1,000만에서 3,000만 개의 간세포를 분리할 수 있습니다. 하룻밤 동안 배양 후, 건강한 세포는 육각형 모양으로 나타나며 그중 많은 세포에 핵이 존재합니다.

건강하지 않은 배양물에는 종종 세포 사멸을 나타내는 과립이나 수포(blebs)가 포함되어 있습니다. 여기서는 완전 산화를 측정하기 위해 세포 호흡 촉진제인 F-C-C-P와 호흡 억제제인 oligomycin을 첨가했을 때의 결과와 대조군(vehicle control)을 비교한 지방산 산화 분석 결과가 나타나 있습니다. 이산화탄소와 산 가용성 물질의 비율이 계산됩니다.

FCCP와 같이 세포 호흡을 촉진하는 물질은 이 비율을 이산화탄소 쪽으로 이동시켜 TCA 회로를 통한 산화가 더 많이 일어남을 나타냅니다. 호흡 연쇄 억제제는 측정 시 전반적인 산화를 감소시킵니다. 리포 활성 화합물의 경우, FCCP와 같이 지방산 산화를 촉진하거나 올리고마이신과 같이 TP 합성을 감소시키는 물질은 대조군과 비교했을 때 배양된 간세포의 리포 활성을 감소시킵니다. 이 절차를 수행할 때는 동물 희생 후 관류가 완전하고 신속하게 이루어지도록 하는 것이 중요합니다.

또한, 지방산 산화 분석 시 배지를 완전히 동결시키는 것은 이산화탄소 가스의 재현성 있는 측정을 위해 매우 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 일차 간세포를 분리하는 방법과 이 세포들을 이용하여 인비트로(in vitro)에서 지방산 산화 및 지방 생성능을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.