Name: 희귀 세포 집단에서 TRAP-RC, 번역 리보솜 선호도 정화 초파리 배아 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 학습하세요 TRAP-RC 방법으로 초파리 배아의 희귀 근육 세포에서 번역 중인 mRNA를 분리하는 기술입니다. GFP 표지 리보솜을 이용한 친화성 정화로 세포 유형별 유전자 발현을 연구할 수 있습니다.

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저자는 Nicolas Allegre, Maud Peyny 및 Jean-Philippe Da Ponte의 탁월한 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 Agence Nationale de la Recherche(ANR-JC-CARDIAC-SPE), INSERM 시작 보조금, ANR ID-CELL-SPE 보조금, Equipe FRM 및 AFM 15845 보조금의 지원을 받았습니다.

1. 플라이 라인 세대 <ol><li> 두 개의 서로 다른 구조를 생성합니다. 첫 번째 구조에서, RpL10A의 cDNA (리보솜 단백질 서브 유닛 L10A)는 pUASP-PL-GFP - Nter 플라스미드에 GFP의 다운 스트림 복제됩니다 (32에서 수정 된 버전). 생식선 촉진제의 사용은 형질 전환 라인의 더 다가 사용을 허용한다. 참고 : pPTGAL4 플라스미드를 사용 GAL4 (TF)의 상류 능력있는 유전자의 조직 특이 적 발현을 구동 조절 서열을 복제하여 두 번째 구조를 얻습니다. </li><li> 1118 파리 승에 별도로 플라스미드를 주입하고 33 (표준 절차에 따라) P-요소의 삽입에 의해 파리의 게놈에 구조를 삽입합니다. </li><li> 순서대로 선택 형질 전환은 두 개의 서로 다른 염색체에 구조 플라이 라인을 복구 할 수 있습니다. 마지막 트랩 라인은 한 두 번 형질 전환 안정적인 라인을 얻기 위해이 두 라인 (유전 십자가)를 결합하여 생성됩니다. F0 : W-; CYO, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6BX W-; CYO / SCU; 슬러 GAL4 / TM6B. F1 : W-; CYO, UAS EGFP :: RpL10A; 능력있는 GAL4 / TM6B. 대규모이 줄을 증폭하고 원하는 스테이지 배아를 수집합니다. </li></ol> 2. 배아 컬렉션 <ol><li> 케이지 당 젊은 파리의 약 40 g의 8 큰 원통형 인구 케이지를 준비 (180,000 파리 / 케이지 정도). </li><li> 파리가 난관에서 개발 배아를 취소 할 수 있도록 소위 사전 낳는다 진행합니다. 이를 위해, 응고 한천 포도 주스의 혼합물을 포함하는 두 11cm 직경 페트리 접시에 1 시간 동안 파리를 놓고 갓 만든 효모 페이스트 표면의 ⅓을 커버합니다. 포도의 3 교환 후 주스 판은 유사한 갓 만든 접시에 실제 배아를 수집합니다. 참고 : 배양 시간은 연구 개발 시간 창에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 케이지에서 플레이트를 제거하고 되어온 (예, 알을 낳는 3 시간 + 10 시간 정확한 발달 단계를 얻기 위해 필요한 시간 동안 동일 온도에서이를두고하는 ional 배양은 10 ~ 13 시간 계란 부설 (AEL)) 후 단계에서 배아를 제공합니다. 브러시를 사용하여 물 50 ㎖와 함께 접시 콘텐츠 (배아, 효모 붙여 넣기, 죽은 파리를) 재현 탁. </li><li> 죽은 파리에서 배아와 나머지 신체 부위를 분리하고 작은 직경의 체에 보유 배아를 수집 한 후 탈 이온수에 간단히 씻어 체 (700 μm의, 355 μm의 112 μm의)의 시리즈를 통해 이동합니다. 그것 자체를 방해 할 수있는 컬렉션 당 18 개 이상의 플레이트를 사용하지 마십시오. </li><li> 탈 이온수에서 4.5 % 표백제에 Dechorionate 배아 2 분 동안 30 ~ 60 초 동안 탈 이온수로 철저히 씻어. 교반하면서 실온에서 5 ~ 10 분 동안, PBS 0.01 % 트윈 20, 100 μg의 / ㎖ 사이클로 헥시 미드의 배아를 품어. </li><li> 셀룰로오스 흡수 시트에 건조 배아 및 마이크로 원심 튜브로 전송. 튜브를 달아 액체 질소에 침지하여 배아를 플래시 동결. 이 단계에서 건조 된 배아는 -80 ° C에서 수개월 동안 저장 될 수있다. </li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. GFP 항체에 결합 자석 구슬의 준비 <ol><li> 철저하게 부드러운 교반에 의해 원래의 병에 단백질 G에게 자기 구슬을 재현 탁. </li><li> 전송 (90)의 RNase없는 튜브에 구슬의 μL 및 자석 (30 ~ 60 초)에 그들을 수집합니다. 비드의 90 μL 60-80 ㎎ / ㎖의 단백질을 함유하는 1 ml의 용 해물로 면역 침전 (IP)을 수행 할 필요가있다. 비드 포화를 방지하기 위해 비를 존중한다. 단백질의 양에 따라 여러 개의 튜브를 사용합니다. </li><li> 자석에 씻어 1 × PBS 0.01 % 트윈 20 (500 μL)와 구슬과 수집 비즈 상층 액을 버린다합니다. 구슬에 PBS 0.01 % 트윈 20의 350 μL에 GFP 항체의 30 μg의를 추가하고 실온에서 30 분 동안 혼합 끝 이상 느린 끝으로 품어. </li><li> 자석 (30 ~ 60 초)에 구슬을 수집 상층 액을 버리고 polysome 추출 버퍼 500 μL에 씻어 (헤 페스 10 밀리미터, KCl을 150 밀리미터,의 MgCl 2 5 밀리미터, DTT 0.5 mm의 트리톤 1 %, 사이클로 헥시 미드 100 ㎍ / ㎖의 홍보otease 1 × 억제제의 RNase 억제제 100 U). </li><li> 자석 구슬을 수집하고 버퍼를 차단의 500 μL 추가 (BSA 0.1 μg의 / μL, 효모 tRNA는 0.1 μg의 / μL를 polysom​​e 추출 버퍼에서 0.1 μg의 / μL를 글리코겐). </li><li> 실온에서 30 분 동안 품어 신선한 차단 버퍼에 한 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 다음 구슬을 회상하고 immunopurification 단계 (제 6 조)에 즉시 진행, 자석 구슬을 수집하고 polysom​​e 추출 버퍼 500 μL에 헹군다. </li></ol> 4. 해​​물 준비 <ol><li> 시작하기 전에, 다 방향 빠른 속도 비즈 분쇄기에 프로그램을 설정 : 2 × 10 초 RPM 5000에서, 15 초 일시 정지를. 15 ㎖의 튜브에 전사 건조 배아 (1.5 g)을 polysom​​e 추출 완충액을 함유하는 얼음에 예냉, 즉시 균질화. polysom​​e 추출 완충액 4 mL에 1.5 g의 배아 균질화. </li><li> 이 확산 균질화 배아는 2 mL의 튜브를 미리 냉각 및 엠브리 갈기균질 프로그램을 실행하여 OS. 얼음에 신선한 미리 냉각의 microcentrifuge 튜브에 해물을 전송하고 2,000g에서 10 분 동안 4 ℃에서 원심 분리하여 postnuclear 상층 액을 준비합니다. </li><li> 얼음에 신선한 미리 냉각 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송 상층 액 (최종 농도 = 0.1 %)로 10 % Nonidet P-40의 1/100 샘플 볼륨을 추가하고 튜브를 반전 가볍게 섞는다. </li><li> 펄스 원심 minifuge의 샘플은 튜브의 바닥에서 액체를 수집하는 300 mM의 1,2- Diheptanoyl-SN 글리세로 -3- 포스 포 콜린 (DHPC) (최종 농도의 1/9 샘플 량 = 30 mm로 추가 )), 튜브를 반전시켜 부드럽게 혼합, 배양하는 동안 여러 번 반전 (5 분 동안 혼합 얼음 혼합물을 품어. </li><li> 20,000g에서 10 분 동안 4 ℃에서 원심 분리 후 미토콘드리아 상층 액을 준비합니다. 브래드 포드 (Bradford) 방법에 의해 단백질 농도를 측정한다 : 파쇄물의 농도가 60 ~ 80 ㎎ / ㎖ 사이 여야한다. 티신선한 새로운 미리 냉각 microcentrifuge 관에 뜨는을 AKE 및 예비 흡수 단계 (5 장)에 바로 진행합니다. </li></ol> 5. 사전 흡수 <ol><li> 철저하게 부드러운 교반 자석 구슬을 재현 탁하고 실온에서 microcentrifuge 관에 (비즈 / 1 ml의 배아 해물 30 μl를) 구슬의 30 μl를 전송합니다. </li><li> 뜨는 오프, 자석에 피펫을 구슬을 수집하고 polysom​​e 추출 버퍼 (500 μL)에 구슬을 재현 탁. 자석에 구슬을 수집 배아 해물을 추가하고, 회 전자에 4 ° C에서 1 시간 동안 배양한다. <ol><li> 구슬을 제거하고 immunopurification 단계 얼음에 뜨는을 유지. immunopurification 전에, 예를 들어 RT-qPCR에 의해 수집 된 후 immunopurification RNA 샘플과 글로벌 RNA 샘플을 비교하는 상등액 100 ㎕ (입력)을 유지한다. </li></ol></li></ol> 6. Immunopurification <ol><li> 의 (60 ~ 80 ㎎ / ㎖ 단백질에 해당) 1 ML을 추가GFP 항체에 결합 차단 된 비드의 90 μl를 함유 된 RNase가없는 튜브로 파쇄물을 미리 흡수. 튜브 회전에서 부드러운 말을 통해 엔드 혼합 2 시간 동안 4 ° C에서 샘플을 품어. 또한, 4 ° C에서 배양 O / N을 수행합니다. </li><li> 배양 후, 자석 구슬을 수집합니다. 0.5 mm의 사이클로 헥시 미드 100 μg의 / ㎖,의 RNase 억제제 (100) U 세척 버퍼 500 μL (헤 페스 10 mM이, KCl을 350 ㎜,의 MgCl 2 5mM의, Nonidet P-40 1 %, DTT에서 그들을 재현 탁, 구슬을 스핀 다운 minifuge를 사용하여 ) 및 자석에 그들을 수집합니다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다. </li><li> 새로운 미리 냉각 된 RNase없는 관에 구슬을 변경하고 두 번 씻는다. 자석 구슬을 수집하고 구슬 트리 졸 직접 1 ml에 첨가하여 RNA 추출을 진행하고 제조업체의 지침을 따릅니다. </li></ol> 7. RNA 정리 및 품질 평가 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라하고, RNeasy 마이크로 키트를 사용합니다. 완료시, 엘 루트(X) μL의 RNase없는 물과 전자 RNA. 2 60 ° C에서 분 및 저장을위한 따뜻한 스냅 냉동 샘플을 -80 ° C에서. bioanalyzer를 사용하여 RNA의 품질을 확인 (제조업체의 지침에 따라). </li><li> TRAPed RNA의 특이성을 테스트하려면, 제조업체의 지침 (첨자 III)에 따라 정제 RNA (입력 및 IP)의 3 NG에 역전사를 수행합니다. 유전자 특이 프라이머 세트를 사용하여 qPCR에 얻은 cDNA를 사용합니다. </li></ol>

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<li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).</li>
</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

이 논문은 초파리 배아에서 희귀 세포 집단의 연구에 전념 수정 번역 리보솜 선호도 정화 프로토콜 (별명 &#39;TRAP-RC&#39;)를 설명합니다. 정보는 마이크로 어레이 또는 RNA-서열 분석, 배아 용해 및 polysome 추출을위한 즉, 1) 필요한 생물학적 물질의 수량 및 최적화 과정에 적합한 수율 특정 RNA의 성공적인 분리를위한 주요 단계에 제공된다; 2) 비즈 / 항체 - 투 - 해물 최적의 면역에 대한 비율; 높은 특이성과 민감도와 TRAP-RC 실험을 실행하기 위해 3) 세척 버퍼 조성물을 포함하는 배경의 감소를 허용하는 단계를 반복합니다. 이 프로토콜은 쉽게 임의의 다른 세포 유형에 적용하게 재현 데이터를 산출한다. 이 기술은 활발-mRNA의 번역 수준에서 차등 유전자 발현을 분석하고, 따라서 사양의 단백질 발현을 이해하는 방법을 포장하는 것을 가능하게<html> 특정 시간 윈도우에서 IFIC 셀형. 단백질 풍부 번역 및 분해 과정의 속도에 따라 달라집니다하지만 있습니다. TRAP 방법의 중요한 한계는 정확한 정량적 인 방법으로 단백질 함량을 측정 또는 번역 후 변형을 감지하는 없다는 것이다. 세포 - 유형 특이 적 방식으로, 그렇게함으로써, mRNA의 리보솜 본체 따라 밀도를 측정하여 정량을 개선하여 리보솜이 매우 강력한 도구 TRAP footprinting에 결합을 할 수있다. 최근의 논문 (34)에,이 조합은 인간 배아 신장 293 세포에서 수행 하였다. 저자는 스트렙 타비 딘 비즈를 사용하여 RpL10A의 유도 비오틴 형태의 친 화성 정제 다음에 뉴 클레아 배출량 측정을 달렸다. 이는 제한이 목적에 필요한 생체 물질의 양이 되, 특정 세포 유형에 타겟팅하는 동안 전체 유기체 리보솜 배출량 측정을 수행 할 수 있다는 원칙의 증명이다. &quot;&gt; 글로벌 transcriptomic 분석과 병행하여 트랩 실험을 수행하는 것은 가능 새로 전사와 RNA를 번역 actively-.이 특정 발달 상황 또는 특정 세포 집단에서 발생하는 잠재적 인 전사 후 메커니즘의 깊이 정보가 될 것입니다 사이의 비율을 추적 할 것 예를 들어 의하여 - 마이크로 RNA. 결론적으로, 트랩은 셀 특정 방식으로 적극적으로-번역 리보솜에 바인딩의 RNA를 식별하기위한 매우 효율적인 특정 민감한 방법이다. 이 방법은 미생물 및 조직 유형의 광범위하게 사용될 수있다. 여기에 설명 된 새로운 TRAP-RC 프로토콜은 희귀 세포 집단 (총 세포 수의 1 % 미만)과 전체 게놈 수준에서의 후속 분석을위한 충분한 최종 재료의 양에 대해 최적화되었다. 이러한 방법의 한계는 COMP 가능하기에 충분한 양으로 리보솜 태그를 생성하는 강한 운전자의 요구 인대상 세포 유형에 내생 태그가없는 사람과 죽어 야지. 최근의 연구 (25)에서, 저자 10-30 %로 태그가 지정되지 않은 리보솜 대 태그의 비율을 추정했다. 상당히이 균형을 개선해야 UAS-RpL10A-EGFP 복사 수를 늘려이 문제를 해결하려면. 대안 적으로, 설명 된 유전 배경 UAS-GAL4 트랜스 추가 GAL4 단백질의 생산을 증폭하며 간접적 RpL10A-EGFP의 발현을 증가시킨다. 이 mRNA의에 태그 리보솜의 더 나은 점유를 선호한다. 이 이미 효율적인 접근법은 훨씬 더 강력한 양적 측면을 가지고 또는 발견 및 유전자 발현 조절에 필수적인 분자 메커니즘을 해명하기 위해 보완적인 방법을 채택하여 제조 될 수 있습니다.

세포가 개발 과정에서 특정 속성을 취득하는 방법을 이해하는 것은 기관의 복잡성과 병리학 적 조건에 대한 그들의 잠재적 인 진화를 감사하기 위해 매우 중요하다. unrevealing 글로벌 유전자 발현 프로파일에 의해 세포 사양과 차별화를 underly 유전자 조절 네트워크를 해독 할 수있는 큰 연구 푸시가있다, 폴 II 결합 상태, 조절 서열 또는 히스톤의 번역 후 변형에 전사 인자의 점유. 글로벌 수준의 마이크로 어레이에서 유전자 발현을 평가하고 RNA-서열 방식이 사용된다. 마이크로 어레이는 RNA-서열이 코딩을 포함하고 마이크로 RNA, lncRNAs 또는 snRNAs 등의 RNA를 비 암호화 RNA를 다른 유형에 알리는에 더 기어드 반면, mRNA의 풍요 로움을 감지 할 수 있습니다. 그러나, 이들 기술이 활발히-전사 구별 할 수, 정상 상태의 mRNA는 mRNA의 번역을 적극적-하고는 mRNA를 분해 공정에 진입. 정상 성을 측정mRNA 수준을 먹은 것은 프로테옴 구성 1-3의 가난한 추정 것으로 알려져있다. 반대로에서의 mRNA를 적극적으로-번역 식별하는 단백질 생산의보다 정확한 사진을 제공합니다. 그러나, 연구는 주로 transcriptomic 야생형 조건 4-7 또는 해부 조직에 이득 또는 특정 인자의 기능의 상실을 비교 해석 유전자 발현 프로파일을 어렵게하여 전체 유기체 레벨 주도되어왔다. 세포 표적 도구, 친화력 정화 및 감도 향상의 최근 발전은 이제 게놈 전체의 살아있는 유기체의 작은 세포 집단 또는 단일 세포 분석을 수행 할 수 있습니다. 초파리에서 유전자 변형 라인의 큰 컬렉션은 세포의 기능에 필요한 분자 메커니즘의보다 정확한 정량을 산출 GAL4 / UAS 시스템 8-10를 통해 다른 조직과 세포 개체군의 특정 시간과 공간 타겟팅을 할 수 있습니다. (11) 적극적으로-번역 캡처하는 방법으로 기술되었다 polysome. 자당 기울기 원심 분리에 따라이 방법은 마이크로 어레이 또는 깊은 시퀀싱 분석 할 때 polysom​​e 분율의 mRNA의 결정의 선택이 게놈 전체의 번역 할 수 있습니다. Polysome 격리 번역 프로세스 (12) 동안 보호 리보솜 RNA 단편에 대응 리보솜 발자국을 식별하는 뉴 클레아 제 소화에 결합 될 수있다. 배출량 측정은 리보솜 RNA의 번역 및 RNA 서열 수준의 해상도와 정량화의 리보솜 위치의 정밀도가, 번역 속도를 측정하는 것을 가능하게 증가한다. 그러나, 주로 리보솜 배출량 측정 프로세스의 끝에서 얻은 RNA 수율 강한 감소로, translatomes 셀 고유의 분리에 적용되지 않은 날짜. RNA의 크기 선택은 잠재적 인 거짓 페이지를 생성 할 수 있음을 감안할 때또한 유사한 방식으로 RNA를 보호 할 수있는 다른 RNP들로부터 ositives는, 상기 발전은 리보좀 배출량 측정을 개선하고 셀 특정 접근법에 적응하기 위해 필요하다. 이러한 방법 중 하나는 번역 리보솜 선호도 그래피 (TRAP)이 Heiman 등에 의해 2008 년에 설명 된 호출. 및 마우스에서 뉴런의 서브셋으로부터 translatome을 분리하기 위해 적용. 으로 세포 유형 특정 방식으로 리보솜 단백질을 항원 - 태그, polysom​​es 선택적으로 세포 분리 및 분류의 힘든 단계없이 정제 할 수있다. 이 경우, 리보솜의 표면에서의 60S 리보솜 단백질 L10A은 eGFP는 13로 태그되었습니다. 2008 년부터 여러 연구는 X와 14-19 쥐에서, 다른 종에이 방법을 사용했다 24 장대 20, 21, 22, 23 제브라 피쉬와 애기 장대를 laevis의. TRAP 방법은 또한 초파리 모델 적응 및 푸리에 사용되고회계 연도 세포 유형 특정 신경 세포 (25)와 성상 세포 (26)에서의 mRNA. 다목적 진 GAL4 / UAS 시스템은 조직 - 특이 적 방식으로 태그 된 RpL10A GFP를 발현하기 위해 사용되었다. 성인 파리의 머리는 서열되었다 (팬 신경 Elav-GAL4 드라이버 대상) 신경 세포 고립의 RNA에서 polysom​​e 선택을 수행하기 위해 해부했다. 상향 조절 된 유전자의 상당수 초파리 배아 개발 (이하 1 세포의 %) 본를 접근 좋은 특이성을 갖는 것을 나타내는 희귀 세포 집단에 적응하도록 우리를 자극하는 신경 조직에서 발현되는 것으로 알려진 것에 대응 . 분자 배우와 형태 형성 운동이 진화 적으로 보존되는 것과 초파리 모델 내에서 배아 단계는 발달 과정의 연구를위한 선택의 모델입니다. 이 모델에서 지금까지 수행 만 조직 - 특이 적 접근법 transcriptomic 정도로 세포 핵을 사용하여 수행되어왔다rting 만 플라이 배아에서 조직 / 세포 특이 translatome 프로파일에 전념 방법에 대한 필요성을 생성, 정상 상태의 사체 27-31을 연구 할 수 있었다. 여기에서 우리는 초파리 배아에 전념 최초의 트랩 프로토콜을보고합니다. 이 방법으로, 결합-mRNA의 번역에 배아 당 약 100 근육 세포의 매우 한정된 세포 집단에서 성공적 고품질와 특이 단리 하였다. 이진 GAL4 / UAS 시스템은 어떤 독성없이 근육의 모집단에서 GFP - 태그 RpL10A의 발현을 구동하는 데 사용됩니다, 명백한 표현형 또는 발달 지연은 이전에 보여주지로 (25). 초파리 배아 근육을 야기 할 것이다 hemisegment 30 근육을 가지고 유충의. 아이디로 처지 유전자의 주변에서 발견 조절 영역을 이용하여, 30 멀티 유핵 근육 중 6 타겟팅. 이 분석에서, 리보솜들은 번역을 사용하여 신장에서 mRNA를 고정화사이클로 헥시 미드를 억제제. 세포질 추출물을 GFP 항체 - 코팅 된 자성 비드와의 친 화성 정제를 위해 사용된다. 정제 RNA의 품질 bioanalyzer를 사용하여 검증 하였다. 정량 역전사 PCR (RT-qPCR에)는 특이 mRNA의 분리의 감도를 결정하는 데 사용하고 최적화 된 프로토콜은 매우 효율적인 것으로 입증되었다.

<table><tbody><tr><td>헤페스</td><td>시그마&nbsp;</td><td>H4034-1006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-디헵타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850306P</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐</td><td>열과학적&nbsp;</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>정제 BSA 100X&nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>효모 tRNA&nbsp;</td><td>시그마</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>슈퍼 RNase in&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>항체 GFP 클론 N86/38</td><td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty 항체 Incorporated</td><td>75-132&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>노니뎃 P40&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11754595001</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 용해 균질화&nbsp;</td><td>Bertin Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제 무함유 물&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads ProteinG</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl)</td><td>Applied Biosystem&nbsp;</td><td></td><td></td>AM96406</tr><tr><td>염화마그네슘(MgCl2)&nbsp;</td><td>어플라이드 바이오시스템&nbsp;</td><td></td><td></td>AM95306</tr><tr><td>셀룰로오스 와딘 표백되지 않음&nbsp;</td><td>폭스바운드</td><td>115-2597&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>체 112, 355, 710 um&nbsp;</td><td>레치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트리졸&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>MagRack 6</td><td>GE 헬스케어&nbsp;</td><td></td><td></td>28948964</tr><tr><td>낮은 바인딩 필터 팁&nbsp;</td><td>ClearLine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rnase 프리 튜브 1.5 ml&nbsp;</td><td>ClearLine</td><td>390689DD</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20&nbsp;</td><td>Fischer 생물 시약&nbsp;</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>시클로헥시미드&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>C1985</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 정제, 미니 완전, EDTA-free&nbsp;</td><td>로슈</td><td>11836170001</td><td></td></tr></tbody></table>

희귀 세포 집단에서 trap-rc, 번역 리보솜 선호도 정화<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

개별 세포에서 번역 과정에서 mRNA의 수준을 측정하면 주어진 시점에서 세포 기능에 관여하는 단백질에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. TRAP(Translating Ribosome Affinity Purification)이라고 하는 프로토콜은 세포 유형별 방식으로 이러한 mRNA 번역 과정을 포착할 수 있습니다. 태그가 지정된 리보솜 소단위체를 운반하는 폴리솜의 친화성 정제를 기반으로 TRAP은 개별 세포의 translatome 분석에 적용할 수 있으며, 이를 통해 발달 과정 중에 세포 유형을 비교하거나 질병 진행 상황 및 분자 수준에서 잠재적 치료법의 영향을 추적할 수 있습니다. 여기에서는 희귀 세포 집단에서 참여 RNA를 식별하는 데 전념하는 TRAP-rc(희귀 세포)라고 하는 TRAP 프로토콜의 최적화된 버전을 보고합니다. TRAP-rc는 초파리 배아의 제한된 근육 세포 집단에서 Gal4/UAS 표적 시스템을 사용하여 검증되었습니다. 이 새로운 프로토콜은 마이크로어레이 또는 RNA-seq와 같은 글로벌 유전자 발현 분석을 위해 충분한 양의 세포 유형 특이적 RNA를 회수할 수 있도록 합니다. 프로토콜의 견고성과 대규모 Gal4 드라이버 컬렉션으로 인해 TRAP-rc는 세포 특이적 게놈 전체 연구에서 잠재적인 응용 프로그램을 갖춘 매우 다재다능한 접근 방식입니다.

초파리 배아 체세포 근육 시스템은 hemisegment 30 근육으로 구성되어, 각각의 근육은 속성의 특정 세트가 있습니다 : 신원 유전자, 위치, 융합 이벤트, 부착 사이트와 신경 분포의 수의 코드입니다. 특정 근육 mRNA의 서브 세트의 번역을 식별하는 것은 이들 특정 근육의 특징을 형성하기 위해 필요한 단백질에 대한 정보를 제공 할 것이다. 아이디로 처지 유전자를 발현하는 근육의 모집단에서 TRAP 기반 방법을 이용하여 RNA는 (도 1A-B)로 정제 하였다. 이 접근법의 주요 관심사는 절연 RNA의 품질 및 특이성이다. 여기에보고 최적화 프로토콜은 bioanalyzer 분석으로 평가 고품질 RNA의 체계적인 복구 할 수 있었다. 프로필을 얻을 쇼 RNA의 저하없이 (그림 1C). 트랩 방법 주위에 개발 된 다른 연구에서, 질문은 데이터의 특이성을 통해 제기되었다. 여기에 우리 전비드 또는 튜브 RNA의 비특이적 결합 및 세척 완충액의 최적화에 의해 연결된 배경을 억제하는 방법을 mProve는. 배경 수준과 처지 발현 세포를 분리의 효율을 평가하기 위해, 우리는 같은 배아 단계의 3 복제에 RT-qPCR에 시험을했다. 4 가지 유전자의-부화를 접어 (mef2, 능력있는, 프로스페로, soxNeuro)가 RpL32 유전자 (그림 1D)에 대한 입력 및 표준화에 비해 계산 하였다. 이러한 결과는 범 근육 유전자 mef2하고 능력있는 유전자의 5.6 배 농축의 2.3 배 농축을 보였다. 대조적으로, 신경계에서 발현 유전자는 두 입력 고갈 비교 하​​였다. 매우 유사한 배 변화 값은 프로토콜이 강력임을 보여주는 3 생물학적 복제에 관찰되었다. 150 × 10 ^ 6 개의 긍정적 인의 (총 100 GFP 세포 / 배아를 포함 얻었다 1.5 × ^ 6 배아 주위에, 1.5 g을 시작 슬러-GAL4 드라이버와세포). 트랩 실험을 실행 한 후, 수율은 무대의 이익에 따라 특정 RNA의 약 25 ~ 45 NG입니다. 이 물질을 마이크로 어레이 분석 또는 RNA-SEQ 라이브러리를 구축하는 증폭 프로토콜을 이용하여 RNA-SEQ을 실행하기에 충분하다. 효율 RpL10A-EGFP를 표현하기 위해 사용 드라이버의 강도에 크게 의존 할 것이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> 그림 1. 품질과 슬러-GAL4&gt; UASRpL10A-EGFP 배아에서 트랩 절연 RNA의 특이성 평가. (AB) hemisegment (A) 당 여섯 슬러 근육 세포에 특이 RpL10A-EGFP 발현을 나타내는 단계 16 배아 공 촛점 이미지. 일반적으로 근육 마커 Beta3tubulin와 RpL10A-EGFP의 공동 현지화 병합 사진 (B)에서 관찰된다. (C) TRAPed RNA 라의 품질 관리N bioanalyzer에 rRNA의 18S와 28S의 완벽한 무결성을 표시합니다. (D) RT-qPCR에 분석 단계-16 배아의 3 생물 복제 함정 절연 mRNA의 실험의 높은 특이성을 보여주는. 접어 변화는 입력과 RpL32 유전자에 대한 표준화에 비해 계산됩니다. 모든 근육 계통에 존재하는 Mef2 성적은 더 제한된 능력있는 성적이 5.6 배 풍부한 반면 입력에 비해 2.3 배 강화된다. 신경 프로스페로를 발현하는 세포와 soxN 유전자는 2.2 배 각각 5.5 배 고갈된다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다 (N = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Translating Ribosome Affinity Purification(TRAP)은 mRNA의 세포 유형별 번역을 캡처할 수 있습니다. 여기에서 우리는 초파리 배아의 희귀 세포 집단에서 mRNA를 분리하는 데 전념하는 최초의 TRAP 프로토콜을 보고합니다.

희귀 세포 집단에서 TRAP-RC, 번역 리보솜 선호도 정화<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

본 절차의 전반적인 목표는 초파리 배아의 특정 세포 유형에서 번역에 참여하고 있는 RNA를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 형질전환 초파리 라인에서 배아를 수집하여, 대상 세포 유형(본 사례에서는 slouch 근육 세포)에서 GFP 태그가 붙은 리보솜 소단위체의 특이적 발현을 유도함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 태그가 붙은 리보솜과 붙지 않은 리보솜이 혼합된 폴리솜 제제(polysome preparation)를 얻기 위해 용해물을 생성하는 것입니다.다음으로, 용해물 내의 단백질 농도를 추정하고, 관심 세포 유형으로부터 리보솜 RNA 복합체를 캡처하기 위해 GFP 항체가 결합된 비드를 사용하여 친화성 정제를 수행합니다. 마지막 단계에서는 총 RNA 추출 및 정제를 진행합니다. 최종적으로, 바이오분석기와 RT-qPCR을 사용하여 각각 품질 및 특이성 평가를 수행합니다.이후 RNA를 사용하여 RNA 시퀀싱 또는 마이크로어레이를 통한 전역적 정량 분석을 수행할 수 있습니다. VX 소팅과 같이 기존 방식과 비교했을 때 이 기술의 주된 장점은 세포 해리라는 번거로운 단계가 필요하지 않다는 점입니다. 이 과정은 실험대 위에서 바로 수행 가능합니다.이 방법은 속도가 빠르며 매우 적은 세포 집단에서도 번역된 RNA를 직접 식별할 수 있게 해주는데, 이는 세포 특성의 획득 과정을 이해하는 데 큰 장점이 됩니다. 이 방법은 초파리 배아의 근육 형성 과정에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라 식물, 제브라피시, 생쥐와 같은 다른 조직이나 모델 생물에도 적용할 수 있으며, 병리 상태에서 단백질 합성에 미치는 치료 영향을 추적하는 데에도 도움이 될 수 있습니다. 실험 과정의 시연은 본 연구실의 박사 과정 학생인 Benjamin Berta가 진행하겠습니다. 프로토콜의 서술 부분에 기재된 지침에 따라 두 가지 형질전환 라인을 구축하고, 이를 교배하여 트랩 이중 교배 형질전환 라인을 생성한 후, 먼저 케이지당 약 40g(케이지당 약 180,000마리에 해당)의 어린 파리를 포함하는 8개의 대형 원통형 집단 케이지를 준비하여 해당 라인을 증식시킵니다.응고된 한천과 포도즙 혼합물이 담긴 11 cm 직경의 페트리 접시를 준비하고, 표면의 3분의 1을 갓 만든 효모 페이스트로 덮은 후, 파리가 이 플레이트에 한 시간 동안 알을 낳도록 합니다. 파리가 생식관을 완전히 비울 수 있도록 신선한 포도즙 플레이트 두 세트에서 이 과정을 반복합니다. 교배를 통해 얻고자 하는 이중 형질전환 배아는 네 번째 플레이트에 놓이게 됩니다.원하는 배아가 담긴 플레이트를 케이지에서 꺼내 실온에서 원하는 발달 단계까지 배양합니다. 여기서는 13시간 동안 배양합니다. 그 다음, 브러시를 사용하여 플레이트의 내용물을 약 50 milliliters의 물에 다시 현탁합니다.액체를 700, 355, 112 µm 직경의 세 개의 체에 통과시켜 죽은 파리로부터 배아를 분리합니다. 가장 작은 직경의 체에 수집된 배아를 이온수로 헹굽니다. 배아를 이온수에 희석된 4.5% 표백제로 2분 동안 코팅한 후, 이온수로 30초에서 60초 동안 철저히 헹굽니다.배아를 20에서 100 µg/mL 농도의 0.01% T PBS 내의 cycloheximide에 넣고 실온에서 5~10분 동안 교반하며 배양합니다. 셀룰로오스 흡수 시트에서 배아의 물기를 제거한 후, 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 튜브의 무게를 측정하고 액체 질소에 침지하여 배아를 급속 냉동합니다.이 단계에서 건조된 배아는 영하 80°C에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다. 건조된 배아 1.5g을 4mL의 폴리솜 추출 완충액이 들어있는 미리 냉각된 15mL 튜브로 옮기고, 멸균된 10mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 균질화합니다.그 다음 균질화된 배아를 미리 냉각시킨 2mL 튜브 두 개에 나누어 담고, 다방향 고속 비드 그라인더로 배아를 분쇄합니다. 5,000 RPM에서 10초씩 2회 작동하도록 설정하며, 각 사이클 사이에 15초의 휴지 시간을 둡니다. 2000 G에서 10분간 원심분리한 후, 용해물을 얼음 위에 놓인 미리 냉각된 새 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.S 상층액에 10% Non P 40을 최종 농도 0.1%가 되도록 첨가하고 튜브를 반전시켜 부드럽게 섞습니다. 300 micromolar의 DHPC를 최종 농도 30 millimolar가 되도록 첨가하고 튜브를 반전시켜 부드럽게 섞습니다. 이 혼합물을 얼음 위에서 5분 동안 배양하며, 배양 중 몇 차례 튜브를 반전시켜 섞어줍니다.얼음에서 배양한 후, 4°C에서 10분 동안 20,000 G로 원심분리하여 미토콘드리아 상층액을 준비합니다. Bradford법으로 단백질 농도를 측정하여 60~80 mg/mL 사이의 단백질 농도를 얻은 후, SNAT를 미리 냉각시킨 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 즉시 사전 흡착 단계로 진행합니다. 마그네틱 비즈를 부드럽게 흔들어 재현탁한 후, 용해물 1 mL당 30 µL의 비즈를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.자석을 이용해 비드를 수집하고, 상층액을 피펫으로 제거한 후 500 µL의 폴리솜 추출 버퍼로 비드를 재현탁합니다. 다음으로, 자석을 이용하여 비드를 다시 수집합니다. 여기에 배아 용해물을 첨가하고 로테이터에서 4 °C로 1시간 동안 배양합니다.비즈를 제거하고 면역 정제 단계 전까지 상층액을 얼음에 보관하십시오. 면역 정제 후 수집된 샘플과 비교하기 위한 전체 RNA 샘플로 상층액 100 µL를 따로 보관합니다. 샘플을 면역 정제하려면 GFP 항체가 결합된 블로킹 비즈 90 µL가 들어 있는 RNA-free 튜브에 사전 흡착된 용해물 1 mL를 추가하십시오. 튜브 회전기(tube rotator)를 사용하여 완만하게 전도 혼합하며 4 °C에서 2시간 또는 밤새 샘플을 배양하십시오.먼저 미니 원심분리기로 남은 비드들을 가라앉혀 비드를 세척합니다. 그런 다음 자석을 이용해 비드를 수집하고 500 µL의 세척 완충액에 재현탁하여 교반하며 배양합니다. 냉장실에서 10분 동안 혼합한 후, 다시 자석으로 비드를 수집합니다.비즈를 새로운 RNase-free 튜브로 옮기고 두 번 더 세척합니다. 마지막으로, 자석을 이용해 비즈를 수집한 후, 비즈에 1 mL의 TRIzol을 첨가하고 제조사의 지침에 따라 추출을 수행하여 RNA 추출 단계로 진행합니다. 이어서 제조사의 지침에 따라 RNEasy micro kit를 사용하여 RNA 정제를 수행합니다.포획된 RNA의 특이성을 테스트하려면 표준 절차에 따라 면역 정제된 RNA와 input RNA 3 ng에 대해 역전사를 수행합니다. 그런 다음 얻어진 cDNA를 유전자 특이적 프라이머 세트와 함께 qPCR에 사용합니다. 단계 16 배아의 이 공초점 영상은 RPL 10 A-E-G-F-P 발현을 보여주며, 특히 각 HEMI 세그먼트의 6개 slouch 근육 세포에서 RPL 10 A-E-G-F-P와 일반 근육 마커인 beta three tubulin의 공국소화가 관찰됩니다.품질 관리를 위해 포획된 RNA를 바이오분석기(bioanalyzer)로 분석하였습니다. 18S 및 28S 리보솜 RNA의 완전성이 완벽함을 확인하십시오. 이 그림은 16단계 배아의 세 가지 생물학적 반복구에 대해 실시한 RT-qPCR 분석 결과를 보여주며, trap으로 분리된 mRNA의 높은 특이성을 입증합니다.FO 변화는 입력값과 비교하여 계산되었으며, RPL 32 유전자 메틸화에 대해 정규화되었습니다. 모든 근육 계통에 존재하는 두 개의 전사체는 입력값 대비 2.3배 농축된 반면, 보다 제한적인 slouch 전사체는 5.6배 농축되었습니다. prospero와 socks를 발현하는 신경 세포와 유전자는 발달 후 각각 2.2배 및 5.5배 감소하였습니다. 이 기술은 특히 발생 생물학 분야의 연구자들이 초파리 배아의 분화 과정 동안 세포 운명 결정 및 세포 특성의 획득을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

연구

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Biology

생물학

어렸을때 peptidyl - tRNAs를 포함하는 리보솜의 생화 학적 분석에 대한 주요 장애가 동일한 샘플의 다른 변이의 존재를했습니다, 분석되는 특정 mRNA 순서의 번역에 참여하지 리보솜. 우리는, 독점적으로, 관심의 초기 peptidyl - tRNA를 포함하는 변이를 정화하는 간단한 방법을 개발했습니다.

기능 및 구조 분석을위한 Peptidyl - tRNAs를 포함 번역 리보솜의 분리

이 프로토콜의 목표는 중형 규모 (0.5-1g)에서 초파리 ( Drosophila) 배아를 수집하고 친화도 정화 - 질량 분광 분석 (AP-MS)과 같은 하류의 단백질 응용 분야에서 사용할 수있는 단백질 추출물을 제조하는 간단하고 저렴한 접근법을 제공하는 것입니다 ).

중간 규모의<em&gt; Drosophila</em&gt; 프로테옴 실험을위한 배아 추출물

우리는 RNA 정화와 결합된 리보솜에 있는 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 EC 특정 유전 꼬리표를 통해 마우스 두뇌, 폐 및 심혼 조직에서 직접 혈관 내피 세포 (Ec)에서 리보솜 결합mRNA를 정화하는 접근을 제시합니다 .

생체 내피 세포에서 RNA 격리를 위한 리보솜 친화성 정제(TRAP) 번역

리보솜 친화도 정제(TRAP)를 번역하면 장기와 조직의 최소한의 처리로 개발 프로그램을 해부할 수 있습니다. 이 프로토콜은 녹색 형광 단백질(GFP)으로 표적화된 세포로부터 고품질의 RNA를 산출합니다. qRT-PCR 또는 RNA-seq와 같은 다운스트림 분석 도구는 조직 및 세포 유형별 발현 프로파일을 밝힙습니다.

세포 유형 별 척도에서 애기장대 뿌리 개발을 조사하기 위해 리보솜 친화성 정제 (TRAP) 번역

여기서, 우리는 리보태그 시스템을 사용하여 성인 남성 마우스 생식세포의 선택집단으로부터 리보솜 및 관련 RNA의 면역침전을 기술한다. 전략적 번식과 신중한 면역 침전은 세균 세포 트랜스라토메에 알리고 돌연변이 표현형의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 깨끗하고 재현 가능한 결과를 초래합니다.

남성 마우스의 생식 세포에서 리보태그 면역 강하

공동 번역 상호 작용은 초기 체인 수정, 타겟팅, 폴딩 및 조립 경로에서 중요한 역할을합니다. 여기에서, 우리는 선택적 리보솜 프로파일링, 생체 내에서, 모델 진핵생물 사카로마이세스 세레비시아에서 이러한 상호작용의 직접적인 분석을 위한 방법을 설명한다.

선택적 리보솜 프로파일링을 통한 공동 번역 상호 작용 네트워크의 글로벌 식별

이 프로토콜은 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 유형 특이적 번역 리보솜 mRNA를 분리하는 것을 목표로 합니다.

세포 분류 없이 스냅 동결 이종 조직 샘플에서 세포 유형 특이적 RNA 분리

INAD 단백질 복합체의 조립 메카니즘에 기초하여, 이 프로토콜에서, 내인성 초파리 TRP 채널을 정제하기 위해 변형된 친화성 정제 플러스 경쟁 전략이 개발되었다.

내인성 초파리 일시적인 수용체 잠재적 채널의 정제

AviTag 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화(ALIBi)는 리보솜의 아세포 집단을 표지하고 친화력을 정제하기 위해 개발된 새로운 광유전학 활성화 방법으로, 하위 시퀀싱과 단백질체 분석을 위해 개발되었습니다.

재조합 펩타이드 태그 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화를 기반으로 한 세포 내 리보솜 하위 집단의 분리

이 프로토콜은 Drosophila melanogaster의 X 또는 Y 염색체 리보솜 DNA 자리에서 유래한 리보솜 RNA 전사체를 구별하기 위해 단일 뉴클레오티드 다형성에 민감한 제자리 형광 혼성화(SNP-FISH) 방법을 설명합니다.

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH: Drosophila melanogaster에서 유전자좌 특이적 리보솜 RNA 전사 검출

여기서는 해상 추출액을 준비하고 초파리 배아를 이용한 시험관 내 번역 방법에 대해 자세히 설명합니다.

초파리 용해액에서 세포 없는 시험관 내 mRNA 번역

학습하세요 TRAP-RC 방법으로 초파리 배아의 희귀 근육 세포에서 번역 중인 mRNA를 분리하는 기술입니다. GFP 표지 리보솜을 이용한 친화성 정화로 세포 유형별 유전자 발현을 연구할 수 있습니다.

희귀 세포 집단에서 TRAP-RC, 번역 리보솜 선호도 정화

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