희귀 세포 집단에서 TRAP-RC, 번역 리보솜 선호도 정화 초파리 배아

이 절차의 전반적인 목표는 초파리 배아에서 세포 유형의 특정 방식으로 번역 RNA에 종사하는 것을 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 형질전환 플라이 라인에서 배아를 수집하여 표적 세포 유형, 이 경우 구부정한 근육 세포에서 A GFP 태그가 지정된 리보솜 소단위체의 특정 발현을 허용함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 용해물을 생성하여 태그가 지정된 리보솜과 태그가 지정되지 않은 리보솜의 혼합물을 포함하는 폴리솜 제제를 얻는 것입니다.

다음으로, 용해물의 단백질 농도를 추정하고 GFP 항체에 결합된 비드로 친화성 정제를 수행하여 관심 세포 유형에서 리보솜 RNA 복합체를 캡처합니다. 마지막 단계는 트리올, RNA, 추출 및 정제에 전념합니다. 궁극적으로 품질 및 특이도 평가는 각각 바이오분석기와 R-T-Q-P-C-R을 사용하여 수행됩니다.

그런 다음 RNA는 RNA 염기서열분석 또는 마이크로어레이에 의한 전체 정량 분석에 사용할 수 있습니다. VX 정렬과 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 세포 해리의 labo 단계가 필요하지 않다는 것입니다. 벤치에서 수행 할 수 있습니다.

이는 빠르며 매우 작은 세포 집단에서 번역된 RNA를 직접 식별할 수 있으며, 이는 세포 특성 획득을 이해하는 데 도움이 되는 측정 이점입니다. 이 방법이 조세핀 배아의 근육 형성에 대한 통찰력을 제공할 수 있더라도 식물, 얼룩말, 물고기 또는 쥐와 같은 다른 조직이나 현대 유기체에도 적용할 수 있으며 병리학의 경우 단백질 합성에 대한 치료의 영향을 따르는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 박사 과정 학생인 Benjamin Berta입니다.엔지니어링 후 프로토콜의 서면 부분에 있는 지침에 따른 형질전환 라인과 트랩 이중 교차 형질전환 라인을 생성하기 위한 교차, 케이지당 약 40g의 어린 파리를 포함하는 8개의 대형 원통형 개체군 케이지를 먼저 준비하여 라인을 증폭합니다. 약 180, 케이지 당 000 파리에 해당합니다.

굳은 한천과 포도 주스의 혼합물이 들어있는 직경 11cm의 페트리 접시를 준비하고 표면의 1/3을 갓 만든 효모 페이스트로 덮고 파리가 이 접시에 1시간 동안 알을 낳도록 합니다. 파리가 ucts를 완전히 비울 수 있도록 두 세트의 신선한 포도 주스 플레이트에 이 과정을 반복합니다. 십자가에서 원하는 이중 형질전환 배아를 네 번째 플레이트에 놓을 것입니다.

케이지에서 원하는 배아가 들어있는 플레이트를 제거하고 실온에서 원하는 발달 단계까지 배양하도록 합니다. 여기에는 13시간 배양이 사용됩니다. 그런 다음 브러시를 사용하여 약 50ml의 물로 플레이트 내용물을 다시 매달아 놓습니다.

700, 355 및 112 미크론 직경의 3개의 체를 통해 액체를 통과시켜 죽은 파리에서 배아를 분리합니다. 수집된 배아를 가장 작은 직경의 체에 이온수로 헹굽니다. 이온수에 4.5% 표백제를 2분 동안 적신 배아를 코팅한 다음 30-60초 동안 이온수로 철저히 헹굽니다.

PBS 0.01%T에서 밀리리터당 20-100마이크로그램 사이의 배아를 배양합니다. 교반과 함께 실온에서 5-10분 동안 Cyclo hyde. 셀룰로오스 흡수 시트에서 배아를 건조시킨 후 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 다음 튜브의 무게를 측정하고 플래시를 만들고 액체 질소에 담가 배아를 동결합니다.

이 단계에서 건조된 배아는 영하 80도에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다. 트렌드는 건조된 배아 1.5g을 4ml의 폴리솜 추출, 완충 및 균질화를 포함하는 사전 냉각된 15ml 튜브로 옮깁니다. 멸균 10 밀리리터 혈청학 피펫을 사용합니다.

그런 다음 균질화된 배아를 2개의 냉장 전 튜브, 2밀리리터 튜브에 넣고 다방향 고속 스피드 비드 그라인더에서 배아를 분쇄합니다. 10, 5RPM에서 000초 동안 두 번 실행하도록 설정하고 각 주기 사이에 15초 동안 일시 중지합니다. 2000G에서 10분 동안 원심분리한 후 용해물을 얼음 위의 새로운 사전 냉각된 마이크로 원심분리기 튜브에 옮깁니다.

S 상등액에 10%non P 40을 최종 농도 0.1%로 첨가하고 튜브를 뒤집어 부드럽게 혼합합니다. 300마이크로몰의 DHPC를 최종 농도 30밀리몰에 추가하고 튜브를 뒤집어 부드럽게 혼합합니다. 혼합물을 얼음에서 5분 동안 배양하고 배양 중에 여러 번 반전하여 혼합합니다.

얼음에서 부화 후. 20, 000 G.Bradford 방법에 의하여 단백질 농도를 측정하고 밀리리터 당 60에서 80 밀리그램 사이 단백질 농도를 얻은 후에 섭씨 4 도에 10 분 동안 원심 분리에 의하여 포스트 미토콘드리아 supinate를 준비하고, 신선한 전 냉각된 마이크로 분리기 관에 SNAT를 옮기고 전 흡수 단계에 즉시 진행하십시오. 부드러운 교반으로 마그네틱 비드를 재현탁한 다음 용해액 1밀리리터당 30마이크로리터의 비드를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

자석에 비드를 모으고 스내트에서 피펫을 제거한 다음 비드와 500마이크로리터의 폴리솜 추출 버퍼를 다시 현탁시킵니다. 다음으로 자석에 구슬을 모으십시오. 다시 배아를 첨가하고 용해한 다음 회전체에서 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다.

구슬을 제거하고 면역 정제 단계까지 앙와위 제제를 얼음 위에 놓습니다. 면역 정제 후 수집된 샘플과 비교하기 위해 100마이크로리터의 supinate를 글로벌 RNA 샘플로 예약하여 샘플을 면역 정제한 후, GFP 항체에 결합된 90마이크로리터의 차단된 비드가 들어 있는 RNA free 튜브에 1ml의 사전 흡수된 용해물을 추가합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 2시간 동안 또는 밤새 배양 후 튜브 로테이터에서 말단 전체를 부드럽게 혼합하여 배양합니다.

먼저 미니 원심분리기에서 나머지 구슬을 회전시켜 구슬을 씻습니다. 그런 다음 자석에 모아 500 마이크로 리터의 세척에 재현탁하고 완충하고 그 이상으로 배양합니다. 냉장실에서 10분 동안 혼합을 끝내고 다시 자석에 구슬을 모읍니다.

비드를 새로운 pre shield R RNAs free 튜브로 옮기고 두 번 더 세척합니다. 마지막으로 자석에 비드를 모은 후 비드에 TRIOL을 1ml씩 첨가하고 제조사의 지시에 따라 추출을 수행하여 RNA 추출을 진행합니다. 제조업체의 지침에 따라 RNEZ 마이크로 키트를 사용하여 RNA를 정리하십시오.

포획된 RNA의 특이성을 테스트하기 위해 표준 절차에 따라 3나노그램의 면역 정제 및 입력 RNA에 대해 역전사를 수행합니다. 그런 다음 QPCR에 대해 얻은 CDNA를 유전자 특이적 프라이머 세트와 함께 사용합니다. 16기 배아의 이 컨포칼 이미지는 RPL 10 A-E-G-F-P 발현을 보여주며, 특히 각 HEMI 분절에 있는 6개의 구부정한 근육 세포에서 RPL 10 A-E-G-F-P와 일반 근육 마커 베타 3 튜불린의 공동 국소화가 관찰됩니다.

포획된 RNA는 품질 관리 목적으로 바이오분석기에서 실행되었습니다. 1개의 8s 및 2개의 8s 리보솜 RNA의 완벽한 무결성에 주목하십시오. 이 그림은 16기 배아의 3가지 생물학적 복제에 대한 RT QPCR 분석 결과를 보여주며, 트랩 분리된 mRNA의 높은 특이성을 보여줍니다.

FO 변화는 입력과 비교하여 계산되고 RPL 32 유전자 필로폰에 대해 정규화되었습니다. 모든 근육 계통에 존재하는 두 개의 전사체는 입력에 비해 2.3배 농축된 반면, 더 제한된 구부정한 전사체는 프로스페로와 양말을 발현하는 5.6배 농축 신경 세포이며 유전자는 발달 후 각각 2.2배 및 5.5배 고갈됩니다. 이 기술은 특히 발달 생물학 분야의 연구자들이 두프 배아의 분화 동안 자기 원조 헌신과 세포 특성의 획득을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.