맥락총 상피 세포의 섬모 운동의 관측 전의 VIVO

다음 실험의 전반적인 목표는 맥락막 신경총 상피 세포인 Celia ex vivo의 움직임을 분석하는 것입니다. 이것은 먼저 맥락막 신경총 조직을 분리하기 위해 쥐 배아 또는 새끼에서 뇌를 절제함으로써 달성됩니다. 모 섬모 이동은 미분 간섭 대비 또는 DIC 현미경에 의해 시각화된 다음, 섬모 팁 위치의 수동 추적을 위해 섬모 팁의 디지털 비디오를 획득합니다.

궁극적으로, 셀리아의 재구성된 팁 움직임은 그들의 움직임 패턴에 따라 분류되고 정량화됩니다. 이 방법은 발달 중 셀리아 사망률이 어떻게 조절되는지, 시간이 지남에 따라 이동성 패턴이 어떻게 변하는지와 같은 세포 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 기술의 의미는 경로 생리학적 분석 및 진단이었습니다.

시리아 관련 질병은 운동 시리아에 대한 우리의 근본적인 이해가 여전히 박차를 가하고 있습니다. 70% 에탄올로 헹궈낸 신생아 마우스를 얼음처럼 차가운 liebovitz L 15, 중간 정도의 참수 직후 멸균 된 10cm 접시에 넣는 것으로 시작하십시오. 그런 다음 시계 제작자 집게를 사용하여 두개골에서 두피를 제거합니다.

그런 다음 세로 봉합선을 따라 정중절로 두개골을 절개하여 뇌를 노출시킨 다음 뇌 신경을 절개하여 전체 장기를 적출합니다. 고립된 뇌를 신선한 얼음, 차가운 매체로 채워진 새 접시에 넣고 등쪽이 위를 향하게 하고 접시를 실체 현미경 아래에 놓습니다. 그런 다음 후각구가 3시 방향에 위치하도록 조직의 방향을 잡고, 워치메이커 집게로 뇌를 부드럽게 잡는다.

다른 한편으로는 미세한 해부 겸자를 사용하여 대뇌 반구와 대뇌 몸통을 연결하는 대뇌 푼을 자릅니다. Dion Cephalon을 꼬집어 반구를 더 분리하고 절단면을 위로 향하게 한 다음 얇은 판을 당겨 해마의 측면에 부착된 외측 심실 맥락막신경총을 제거합니다. 맥락막신경총이 분리되면 새로운 배지가 들어 있는 35mm 유리 바닥 접시에 조직을 옮기고 안락사 후 25분에서 60분 이내에 조직에 무게를 싣고 대물렌즈의 초점을 눈으로 조정하여 맥락막총 상피 세포 Celia의 실시간 이미징을 시작합니다.

중심과 초점이 Kula 조명에 부합하도록 콘덴서를 조정합니다. 그런 다음 DIC 광학 장치를 준수하기 위해 적절한 광학 요소를 광 경로에 삽입합니다. DIC 프리즘을 움직여 조직의 표면 구조가 명확하게 인식되는 위치로 이미지의 대비를 조정합니다.

그런 다음 광 경로를 비디오 카메라로 전환하고 광 파워를 높입니다. neutral density filters를 제거하여 원하는 이미징 기간 동안 비디오 카메라의 시간 해상도를 200Hz로 설정하고 노출 시간을 0.1밀리초로 설정하여 관찰 및 초점 영역을 조정합니다. 그런 다음 이미지 스택을 얻은 후 이미지를 획득하면 각 단일 프레임에 Celia의 선명한 이미지가 표시되어 각 섬모의 박동 패턴을 수동으로 추적합니다.

마우스 포인터를 사용하여 각 프레임에서 섬모 팁의 위치를 표시합니다. 그런 다음 적절한 소프트웨어를 사용하여 궤적 데이터를 분석하고 궤적을 앞뒤로 또는 눈으로 회전하는 두 가지 모드 중 하나로 분류합니다. 공식을 사용하여 여러 섬모 박동 주기에 대한 섬모 박동 빈도를 계산합니다.

같은 세포에 있는 다른 셀리아와 마찬가지로 각 섬모의 움직임을 방해할 수 있습니다. 다음으로, 단일 세포 내에서 섬모 박동 축의 각도 균일성을 분석합니다. 앞뒤 궤적의 경우 Celia 팁의 위치를 직선에 맞추고, 세타를 선이 X축과 함께 만드는 각도로 정의합니다.

회전 궤적의 경우, 위치를 타원에 맞추고, 세타를 타원의 장축이 x축과 함께 만드는 각도로 정의합니다. 마지막으로, 각 궤적에 대한 정량적 설명을 위해 세타(theta)를 사용하여 궤적을 회전하고, 종횡비를 x축과 y축을 따른 분포 너비 사이의 비율로 정의합니다. 이 첫 번째 클립에서는 고속 비디오 현미경 검사로 촬영한 출생 후 2일차 새끼 생쥐의 Celia가 있는 맥락막 신경총 상피 세포의 평면도를 보여주며, 맥락막 신경총 조직의 불규칙한 표면으로 인해 초점이 맞는 평면과 초점이 맞지 않는 평면 모두에서 볼

이 두 번째 클립에서는 이전 영화의 상자 영역을 확대하여 개별 섬모가 나타내는 회전 및 앞뒤 움직임을 자세히 관찰할 수 있습니다. 여기서, 여러 주기에 걸쳐 영화 기록으로부터 재구성된 대표적인 섬모 팁 이동의 궤적은 그래프에 표시된 팁 위치의 x 및 y 좌표의 시간 경과와 함께 제공됩니다. 이 그래프에서 두 좌표 사이의 위상 변이를 보여주기 위해 x 및 Y 좌표를 정규화하고 오버레이했습니다.

운동성 CLIA는 실시간 이미징으로 쉽게 인식되지만 이 방법으로 비운동성 CLIA를 식별하는 것은 쉽지 않습니다. 이러한 어려움을 극복하기 위해 주사 전자 현미경은 운동성에 관계없이 clia의 전체 이미지를 얻는 데 필수적일 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 샘플의 신선도가 보존되고 시리아의 운동성이 유지될 수 있도록 충분히 신속하게 해부를 수행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 바이러스 시리얼로 조직 샘플을 준비하는 방법과 CX vivo의 폐사율을 모니터링하고 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.