Dalbavancin에 대한 참조 국물 Microdilution 방법 체외 감수성 테스트

다음 절차의 전반적인 목표는 dalbavancin에 대한 최소 억제 농도를 결정하는 것입니다. 이를 위해 Dalbavancin의 고유한 핵심 단계에 초점을 맞춘 육수 마이크로 희석 방법을 사용합니다. dalbavancin의 스톡 및 중간 희석은 DMSO에서 이루어지고 최종 희석은 폴리소르베이트가 보충된 조정된 Mueller Hinton 육수에 양이온으로 이루어집니다.

희석액을 96웰 플레이트에 분배하고 표준화된 박테리아 현탁액을 접종합니다. 그런 다음 플레이트를 16-24시간 동안 배양하고 검사하여 박테리아 성장을 억제하는 데 필요한 달바반신의 최소량을 결정합니다. 이 표준화된 방법을 준수하면 임상 분리물 모두에서 일관된 결과를 보장할 수 있으며, 여기에서 볼 수 있듯이 품질 관리 분리 Dalbavancin은 그람 양성 유기체에 의한 급성 세균성 피부 및 피부 구조 감염 치료를 위해 2014년 5월 FDA에서 승인한 반합성 리포 글리코펩티드 항균제입니다.

이 방법은 다신에 대한 표준화된 국물, 마이크로 희석 감수성 방법을 설명하며, 여기에는 플라스틱에 대한 제제의 부착을 완화하기 위해 폴리소르베이트 80에서 스톡 용액을 준비하기 위해 DMSO를 사용하는 것이 포함됩니다. 이 방법의 시각적 시연이 도움이 됩니다. 스톡 및 MIC 플레이트 용액 준비 단계는 대부분의 항균제에 비해 일반적이지 않습니다. 이러한 단계는 lipo 글리코펩타이드(lipo Glycopeptide)제제에 고유하며 재현성 있고 정확한 MIC 결과를 얻기 위해 따라야 하는 중요합니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 연구 과학자인 지나 피셔(Gina Fisher)입니다. 다음 절차를 수행할 때 생물 안전성 레벨 2와 일치하는 적절한 안전 예방 조치를 취해야 합니다. 밀리리터당 800마이크로그램의 원액을 준비하기 위해 적절한 양의 달바반신의 무게를 측정하는 것으로 시작합니다.

멸균 유리 또는 플라스틱 튜브에 적당량의 NEAT DMSO를 첨가한 다음 분말을 튜브에 옮기고 와류로 만듭니다. 다음. 밀리리터당 800마이크로그램의 DALBAVANCIN 원액을 사용하여 1열에서 4열까지 표시된 대로 100개의 최종 MIC 플레이트 농도를 준비합니다. 이를 중간 농도라고 합니다.

준비된 총 볼륨은 MIC 패널의 수에 따라 다릅니다. 마지막으로, 0.004%P 80이 보충된 C-A-M-H-B라고도 하는 양이온 조정되지 않은 Mueller Hinten 육수에서 중간 농도를 1에서 100까지 희석합니다. 그 결과 DALBAVANCIN 및 P 80의 작업 농도는 최종 농도의 두 배입니다.

접종물을 추가하면 멸균 팁이 있는 다중 채널 피펫을 사용하여 1-2회 희석할 수 있으므로 각 dalbavancin 희석액 50마이크로리터를 96웰 멸균 마이크로 희석 패널의 적절한 웰에 분배합니다. MIC 플레이트 형식을 사용하면 플레이트당 8개의 이노큘러를 테스트할 수 있습니다. 패널을 즉시 사용하지 않을 경우 플라스틱 필름을 바르고 밀봉한 다음 비닐 봉지에 넣고 필요할 때까지 섭씨 영하 60도 이상의 해동되지 않는 냉동고에 보관하십시오.

이 시연에서는 갓 준비된 접시 하나를 접종합니다. 접종물을 준비하려면 18-24시간 혈액 오거 또는 기타 비선택적 오거 플레이트에서 잘 격리된 여러 콜로니를 선택합니다. 여기에서는 품질 관리의 aria 및 EPHI 굳은살 균주가 사용됩니다.

멸균 면봉으로 각 군집의 상단을 만지고 그 중 일부를 1-5ml의 C-A-M-H-B 또는 식염수가 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 준비 후 15-30분 이내에 탁도가 0.5 McFarland 표준과 일치할 때까지 계속 옮기고, 접종물을 C-A-M-H-B에서 1에서 100까지 희석하여 5 곱하기 10의 최종 농도에 도달합니다. 허용 범위는 2에서 8 곱하기 10에서 밀리리터당 5번째 CFU입니다.

멸균 팁이 있는 멀티채널 피펫을 사용하여 즉시 50마이크로리터의 최종 접종물을 MIC 패널 플레이트의 각 적절한 웰로 이송합니다. 4개의 행에 2개의 분리물 각각에 접종하여 분리물당 총 4번의 반복실험을 수행합니다. 다음으로, 순도 검사를 수행하려면 피펫을 사용하여 양성 성장 대조군의 용액 1-10 마이크로 리터를 5 % 양의 혈액을 함유 한 부패의 콩 한천을 시도하는 것과 같은 비 선택적 한천으로 옮깁니다.

멸균 루프를 사용하여 용액을 플레이트 표면에 펴 바릅니다. 플레이트를 90도 돌리고 다시 줄무늬를 만들어 접종물이 고르게 분포되도록 합니다. 접시를 덮고 따로 보관하십시오.

콜로니 카운트를 준비하기 위해, 단일 채널 피펫을 사용하여 성장 제어 웰의 용액 10 마이크로 리터를 10 밀리리터의 식염수 혼합물로 옮긴 다음 100 마이크로 리터를 멸균 루프를 사용하여 5 % 양 혈액으로 toay soy 한천을 시도하고 용액을 전체 농업 표면에 펴십시오. 접종물이 균일하게 분포되도록 이 과정을 다른 방향으로 두 번 반복합니다. 다음으로, 플라스틱 용기에 최대 4개의 MIC 패널을 쌓아 상단 패널이 뚜껑으로 단단히 밀봉되도록 합니다.

그런 다음 젖은 종이 타월을 플라스틱 용기 안에 넣고 접종 후 30분 이내에 뚜껑으로 단단히 닫습니다. MIC 패널, 콜로니 카운트 플레이트 및 순도 확인 플레이트를 섭씨 35도 또는 영하 2도의 주변 공기 인큐베이터에서 16-20시간 동안 배양합니다. 다음 날, 맨눈으로 감지된 우물에서 박테리아 성장을 완전히 억제하는 가장 낮은 농도로 최소 억제 농도를 읽습니다.

콜로니 카운트 플레이트에서 콜로니의 수를 결정합니다. 계산된 숫자에 희석 계수를 곱합니다. 예를 들어, 50개 콜로니에 희석 계수 10, 000을 곱하면 10에 5를 곱한 10리터당 5번째 CFU와 같습니다.

허용 가능한 범위는 20 - 80 콜로니이며, 이는 ml당 2 - 8 곱하기 10 곱하기 5 콜로니 형성 단위와 같습니다. 접종물의 농도는 정확한 결과를 얻기 위해 감수성 검사를 제어하는 데 중요한 변수입니다. 마지막으로 순도 플레이트를 확인합니다.

모든 군체가 접종물로 사용되는 군체와 유사하면 순수한 것으로 간주 될 수 있습니다. 다른 콜로니가 존재하는 경우 MIC 패널에 오염 물질이 존재할 가능성이 있으므로 테스트를 반복해야 합니다. DAL은 여기에 표시된 바와 같이 농업 희석 방법을 사용하여 얻은 결과와 MIC 결과를 비교했습니다.

Dal bevans에 대한 농업 MIC 결과는 일반적으로 육수보다 2배에서 8배 높습니다. 마이크로 희석, MIC 결과. 이 대조 vancomycin 결과는 육수와 농업 방법에 의해 이루어집니다.

따라서 농업 희석은 dalbavancin dalbavancin 육수 테스트에 권장되지 않습니다. 마이크로 희석 MIC, 품질 관리 결과는 여기에 표시된 대로 예상 범위 내에 있어야 합니다. SS 품질 관리 유기체인 A TCC 2 9 2 1 3은 밀리리터당 0.06마이크로그램의 매우 명확한 모달 마이크를 사용하여 방법 변동을 나타내는 좋은 지표였습니다.

얻은 결과가 품질 관리 유기체에 대한 예상 범위를 벗어나거나 범위의 낮음 또는 높음으로 추세를 보이는 경우 방법에 대한 추가 검증이 보증됩니다. 품질 관리 유기체를 사용하여 방법을 검증하는 것 외에도 지역 항균 감시 프로그램의 MIC 데이터는 다음과 같이 임상 실험실 환경에서 기대할 수 있는 MIC 결과의 기초를 제공할 수 있으며, Dal b Anson MIC, 2011년에서 2013년 사이에 유럽과 미국에서 수집된 분리물에 대한 결과는 SIU의 99.9%와 연쇄상 구균의 100%에 대해 밀리리터당 0.25마이크로그램 미만이었습니다. 이러한 감시 데이터에 근거하여, 포도상구균 및 연쇄상구균에 대한 달바반신 MIC 결과가 밀리리터당 0.12마이크로그램 이상인 것은 드문 것이 분명합니다.

더 높은 수치가 확인되면 테스트를 반복하거나 검증을 위해 표준 실험실로 보내야 합니다. DMSO에서 스톡 희석액을 준비하고 최종 MIC 웰에서 0.002% 농도의 브로스 희석액에 P 80을 첨가하는 것은 정확하고 재현 가능한 dalbavancin MIC 결과를 얻기 위한 중요한 단계입니다.항상 그렇듯이 특히 박테리아 내성 발달 분야에서 정확한 항균제 감수성 결과는 임상의가 적절한 요법을 선택하는 데 매우 중요합니다.