도구로 미주 신경 자극은 멸종 학습을위한 관련 진학 가소성을 유도

이 절차의 전반적인 목표는 미주신경 자극을 통해 조건 형성된 공포의 소거를 촉진하는 것입니다. 이를 위해 먼저 미주신경에 전류를 전달하기 위한 전극을 제작합니다. 다음 단계는 회복 기간을 거친 후, 이 전극들을 미주신경의 경부 중간 부분에 식립하고 헤드 캡을 장착하는 것입니다. 이후 동물들은 미주신경 자극 또는 가짜 자극과 함께 청각 공포 조건화 및 소거 훈련을 받게 됩니다.

마지막 단계는 조건화된 공포 표현을 테스트하고 조건화된 동결 반응의 감소를 평가하는 것입니다. 궁극적으로, 미주 신경 자극은 소멸 네트워크의 가소성을 유도함으로써 소멸 학습을 강화하는 데 사용됩니다. 전신 약물 치료와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 현재 진행 중인 행동과 결합될 수 있는 신경전달물질의 네트워크 특이적 방출을 달성하기 위해 치료 시점을 정밀하게 조절할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 정서적 학습 및 기억 분야의 핵심적인 질문, 특히 에피네프린과 글루코코르티코이드 같은 스트레스 호르몬의 방출이 장기 기억의 공고화에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 함의는 불안 및 트라우마 관련 장애 치료에 사용되는 노출 요법뿐만 아니라 중독 재활 분야까지 확장됩니다. 또한, 미주신경 자극은 뇌졸중 또는 외상성 뇌 손상 후의 운동 학습과 같은 시냅스 가소성의 다른 학습 모델에도 적용될 수 있습니다.

준비 단계로, 바늘을 이용하여 천공 도구를 제작합니다. 먼저 마이크로 레나인(micro renaine) 튜브 4cm를 드릴 베드에 끼웁니다. 그다음 바늘 드릴을 사용하여 2mm 간격으로 4개의 구멍을 뚫어 정사각형의 모서리를 형성합니다. 이때 구멍은 거친 모서리 없이 깨끗하게 뚫려야 합니다.

다음으로, 구멍 사이의 튜브를 길이 방향으로 자릅니다. 이제 봉합사를 사용하여 양쪽의 미주신경에 커프를 고정하기 위한 리깅을 구축합니다. 튜브와 실이 삼각형 모양이 되도록 플라스틱에서 약 2cm 떨어진 지점에서 봉합사를 서로 묶고, 각 봉합사의 길이를 매듭 너머로 약 8cm 정도 연장합니다.

다음으로, 절연 처리된 7심 백금 메리듐 와이어를 70 millimeter 길이의 세그먼트로 자릅니다. 이제 보석용 토치를 사용하여 와이어의 한쪽 끝에서 약 1 centimeter 정도의 절연체를 제거합니다.

그런 다음 화염을 사용하여 노출된 백금 메리듐을 녹입니다. 이 기술을 사용하여 노출된 7가닥의 백금 메리듐 와이어를 하나의 더 강한 와이어로 합치고, 융합된 와이어 세그먼트의 반대쪽 끝단에서 와이어 끝을 녹여 구슬 모양으로 만듭니다. 절연체 박리를 최소화하면서 백금 메리듐 와이어를 작은 구슬 모양으로 녹입니다.

이제 나사산이 있는 플라스틱 커프를 절단된 모서리가 수평면을 따라 오도록 배치하고, 나사산을 팽팽하게 당겨 커프를 펼친 상태에서 테이프로 고정합니다. 포셉을 사용하여 준비된 와이어의 노출된 끝부분을 오른쪽 하단 구멍으로 통과시켜 커프 중앙까지 당깁니다. 그런 다음 와이어를 오른쪽 상단 구멍으로 밀어 넣어 와이어가 커프 위로 루프를 형성하도록 되돌립니다.

와이어를 오른쪽 상단 구멍으로 다시 밀어 넣은 다음, 가볍게 잡아당겨 와이어를 조이고 단단히 고정되었는지 확인하십시오. 전달되는 전류가 미주신경으로만 흐르도록, 커프의 홈에 위치한 와이어 부분은 절연되지 않은 상태여야 하며 커프 하단 외부에 있는 와이어는 절연 상태를 유지하는 것이 매우 중요합니다. 다음으로, 커프 내부에서 피복이 벗겨진 끝부분을 오른쪽 하단 구멍으로 밀어 넣으십시오.

루프를 완성하기 위해, 커프의 왼쪽에 와이어를 와이어 끝부분과 동일한 방식으로 배치하되 커프에 고정하지는 않습니다. 와이어의 피복이 벗겨진 끝부분을 금색 핀에 납땜합니다. 납땜 부위를 식힌 후 다시 녹여 연결 상태가 양호한지 확인합니다.

필요에 따라 납을 더 추가하십시오. 이제 각 입력 부위의 VNS 입력부 헤드 캡용 커넥터를 준비합니다. 26 AWG 구리선 30mm 세그먼트 두 개의 끝단을 벗겨내고, 금도금 핀의 좁은 끝부분을 잘라낸 후, 다음과 같이 각 와이어 쌍을 핀에 납땜하여 연결하십시오.

전선의 느슨한 끝부분을 커넥터의 두 플럭스 치아(flux teeth)에 납땜합니다. 이렇게 하면 커넥터가 완성됩니다. 정위 고정틀(stereotaxic frame)에서 수술을 위해 동물을 준비한 후, 메스를 사용하여 두개골 위의 피부를 절개하고 람다(lambda)와 브레그마(bgma)를 노출시킵니다.

뭉툭한 포셉을 사용하여 절개 부위부터 귀 앞쪽 왼쪽으로 내려가 목의 왼쪽까지 피하 경로를 만듭니다. 이 경로는 커프를 위한 것입니다. 다음으로, 메스를 사용하여 앵커 나사를 고정할 작은 시작 구멍 두 개를 뚫습니다.

이 구멍들을 정중선 바로 위에 배치하지 마십시오. 그런 다음 포셉과 드라이버를 사용하여, 나사 아래쪽에 아크릴이 채워질 공간을 남겨둔 채로 골나사 두 개를 박으십시오. 그 후 나사들 사이의 둥근 공간 하단을 아크릴로 채우되, 아크릴이 주변 조직에 닿지 않게 하고 나사 사이에 아크릴을 추가로 도포하십시오.

다음으로, 표시된 와이어가 표시되지 않은 와이어보다 앞쪽(rostral)에 오도록 임플란트를 잡습니다. 그리고 빠르게 임플란트를 아크릴 내에 배치합니다. 금 핀, 클래스프 영역 또는 입력 부위에 아크릴이 묻지 않도록 주의하십시오.

5분 동안 건조시킨 후 실체현미경 하에서 작업을 계속할 준비를 합니다. 턱뼈와 쇄골 사이의 왼쪽 경정맥 위에 작은 절개를 가합니다. 둔성 박리를 통해 근육층까지 절개 부위를 넓힙니다.

흉늑유돌근, 흉설골근 및 견갑설골근을 노출시킵니다. 근육 사이의 홈을 따라 둔성 박리를 계속하여 경동맥을 찾습니다. 경동맥을 포함하는 초에는 미주신경도 포함되어 있습니다.

가위를 사용하여 신경초를 조심스럽게 절개하여 미주신경을 5 mm 길이로 노출시킵니다. 다음으로 머리 절개 부위에서 리드선 반대편 커프 측면에 있는 실을 사용하여 커프를 피하 터널을 통해 목 절개 부위로 끌어옵니다. 유리 도구로 신경을 부드럽게 들어 올린 후 커프 실을 신경 아래로 밀어 넣습니다.

신경에 마찰이 가지 않도록 주의하십시오. 커프의 윗면이 동물의 상단을 향하게 해야 합니다. 이제 신경을 커프 중앙에 넣고 헤드 캡 부분에서 커프를 닫으십시오.

커프에 연결된 핀을 자극 입력단의 핀에 연결하여 커프가 적절한 위치에 배치되었는지 확인합니다. 호흡 정지를 유도합니다. 테스트 호흡이 잠시 중단되어야 하며 심박수 또한 감소해야 합니다.

커프 위치를 확인한 후, 아크릴을 사용하여 핀을 자극 입력 부위에 고정합니다. 그런 다음 수술 부위를 봉합하고 Marcaine과 국소 항생제로 동물을 처치합니다. 동물은 다른 개체와 분리하여 5일 동안 회복시킵니다.

테스트를 수행하기 전, 비디오 카메라 감시 하에 조작적 조건 형성 상자를 설치하십시오. 행동 훈련 첫째 날에는 톤에 대한 선천적 공포가 없음을 입증하기 위해 30초 동안 톤을 5회 제시합니다. 초기 톤 제시 이후, 1일 차와 2일 차에 걸쳐 쥐에게 공포 조건화를 실시합니다.

1초 동안 랜덤하게 가해지는 0.5 mA 발 충격과 함께 32분음표 톤을 재생합니다. 톤 제시 사이에 3~5분 간격을 두고 매일 8회의 톤-충격 짝짓기를 실시합니다. 셋째 날에 톤-충격 연합의 강도를 테스트합니다.

톤을 3~5분 간격으로 네 번 단독으로 들려줍니다. 4일 차와 5일 차에 동물의 프리징 행동을 기록합니다. 미주 신경 자극 또는 가짜 자극을 통해 소거 훈련을 수행합니다.

쥐를 자극기에 연결하고 조작성 조건 형성 상자에 넣습니다. 150 milliseconds. 각 톤(tone)이 제시되기 전, 미주신경을 30초 동안 자극합니다.

3~5분 간격으로 네 번의 자극 톤 짝지음을 수행합니다. 설명된 프로토콜에 따라 오실로스코프를 사용하여 VNS 커프와 입력 부위의 전기적 무결성을 주기적으로 확인합니다. 쥐를 대상으로 소멸 과정 중 미주신경 자극을 동반한 청각 공포 조건화 과제 훈련을 실시하였습니다.

소거 단계 동안 조건성 톤에 대해 강화되지 않은 제한된 횟수의 노출을 경험한 동물들은 조건 공포의 감소를 보이지 않았습니다. 반면, BNS 처리된 쥐들은 연장된 소거 훈련을 받은 가짜 처리(sham treated) 동물들과 유사하게 freezing 행동의 큰 감소를 나타냈습니다. BNS 처리 동물들은 조건성 톤 제시 외의 상황에서도 freezing 행동의 감소를 보여, 이들의 소거 훈련이 맥락으로 일반화되었음을 시사했습니다.

추가 연구 결과, VNS와 소멸 훈련을 병행하면 전전두엽 내측 하부 피질(infra limbic cortex)과 편도체 기저 외측핵(basal lateral amygdala) 사이 경로의 메타가소성이 변화하는 것으로 나타났습니다. 조건 공포 반응이 소멸되지 않은 마취 상태의 가짜 자극 동물군에서 전전두엽 내측 하부 피질의 반복 버스트 자극을 가하자, 편도체 기저 외측핵의 유발 국소 전위의 장기 저하가 유도되었습니다.

이러한 시냅스 억제는 조건 공포 반응의 유의미한 소멸을 보인 동물들에서 역전되었습니다. 또한, 단일 소멸 세션 동안 VNS를 투여했을 때 장기 강화의 유도가 촉진되었습니다. 이 영상을 시청한 후, 행동 훈련과 병행하여 VNS를 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

VNS 구성 요소 제작 및 수술법을 완전히 숙달하면, 적절하게 수행될 경우 약 3시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 전기 연결 상태를 온전하게 유지하는 것이 중요함을 기억하십시오.