Name: 혼합 폴리머 / 풀러렌 나노 입자 감광제를 실시와 광 역학 치료 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 학습하세요 전도성 폴리머 나노입자와 풀러렌을 혼합한 차세대 광감작제를 침전법으로 제조하는 방법을 배우세요. 이 기술은 광역학 치료에서 반응성 산소종을 생성하여 난소암 등 공격적인 암세포를 효과적으로 사멸시킵니다.

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저자는 CAREER 상(CBET-0746210)과 CBET-1159500 상을 통해 이 작업에 대한 재정적 지원을 해준 NSF(National Science Foundation)에 감사를 표합니다. 세포 배양에 도움을 주신 Turkson 박사(Univ. of Hawaii Cancer Center)와 Altomare 박사(Univ. of Central Florida College of Medicine)에게 감사드립니다.

1. 배양 세포주 <ol><li> 이하의 2 분 동안 온수에 냉각제 튜브를 보유함으로써 해동 TE 71 (마우스 흉선 상피 세포), MDA-MB-231 (인간 유방암 세포), A549 (인간 폐암 세포) 및 OVCAR3 (인간 난소 종양 세포) . 106 × g으로 6 분 동안 각각의 세포주를 원심 분리하고, 10 % FBS가 보충 된 10 mL의 DMEM 배지를 추가한다. </li><li> 서스펜션을 기음과 펠렛에 3 ㎖ 미디어를 추가 할 수 있습니다. 적절 수회 피펫 팅하여 세포를 섞는다. 이 용액을 셀 T75 플라스크에 10 % FBS가 보충 된 DMEM 7 mL의 배지를 예열 사전에 추가하고, 37 ℃에서 95 % 공기 / 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 플라스크를 유지한다. 통로 0으로이 플라스크 레이블. </li><li> 세포의 80 % 컨 플루 언시에 도달 할 때, 10 분 동안 0.05 % 트립신 이들을 배양하여 세포를 수확. 미디어의 동일한 양을 첨가함으로써 트립신을 중성화. 원심 분리기 106 X g에서 6 분 동안이 솔루션입니다. 서스펜션을 제거하고 여기에 3 ㎖에게 신선한 매체를 추가 할 수 있습니다. 아 믹스L 7 ml의 미디어를 포함하는 배양 플라스크에 소량 (100 μL)를 전송합니다. 인큐베이터에서 배양 플라스크를 품어. 항로 1과 플라스크 레이블. </li><li> 통로 11 또는 12까지 문화 세포주. </li></ol> 나노 입자의 2 제작 <ol><li> ~ 10 -6 M (조정) 희석 MEH-PPV 원액의 조제 <ol><li> 바이알 1 ㎎ 분자량 폴리 [2- 메 톡시 -5- (2- 에틸 헥 실옥시) -1,4- 페닐 렌 비닐 렌] (MEH-PPV) (평균 Mn)는 150,000-250,000 g / 몰, 3 ml의 테트라 히드로 푸란 (THF)을 첨가 . 핫 플레이트상에서 80 ℃에서 가열하면서 2 시간 동안 교반한다. </li><li> 0.2 μm의 주사기 필터를 사용하여 새로운 바이알에 상기 용액을 필터. &#39;희석 MEH-PPV 원액&#39;으로이 솔루션을 레이블. 단계 2.1.3과 2.1.4에 설명 된대로이 솔루션은 농도의 미세 조정 후 나노 입자 준비에 참여한다. </li><li> 3의 용액으로 희석 MEH-PPV 주식 솔루션의 50 μl를 추가. &#39;희석 MEH-PPV 원액&#39;으로이 솔루션을 레이블. 자외선 - 마주 분광에 의해 495 nm에서 흡광도를 1cm 석영 큐벳에 전송하고 측정한다. </li><li> 희석 MEH-PPV 원액의 흡광도가 0.17보다 높은 경우, 한 번에 THF 1 mL를 첨가하여 희석 MEH-PPV 스톡 용액을 희석하고, 495 nm에서의 흡광도가 될 때까지 단계 2.1.3을 반복 0.13-0.17의 범위. </li><li> 아래 그림과 같이 램버트 - 비어 법칙을 사용하여 희석 MEH-PPV 주식 솔루션의 몰 농도를 계산합니다. 여기에 0.15 흡광도 프로토콜의 나머지 예로서 사용된다 (예., 관측 흡광도 모든 다음 계산을 조정), 사용 MEH-PPV의 흡광 계수가 107 M -1 cm 사용 경로 길이가 -1이다 1cm. = ε xbxc (는 식 1) (ε - 몰 흡광 계수, A - 흡광도, B - 경로 길이, C - 용액의 농도) 0.15 = 10 7 M -1 cm -1 X 1cm의 XC (는 식 2) C = 1.5 × 10 -8 M (는 식 3) 다음과 같이 희석 MEH-PPV 원액의 농도를 찾기 위해 상기 농도를 사용 M 1 V 1 = M 2 V 2 (는 식 4) 0.15 × 10-7 M X 3050 μL = M 2 × 50 μL (는 식 5) M 2 = 9.15 × 10 -7 M (는 식 6) 이것은 &#39;조정 희석 MEH-PPV 원액&#39;의 농도이다. </li></ol></li><li> 조정 희석 MEH-PPV 원액에 MEH-PPV의 질량을 계산 <ol><li> 섹션 2.1.4에서 얻어진 몰 농도 10 6g / 몰이다 MEH-PPV의 분자량 (M w)를 사용하여 다음과 같이 조정 원액 원액 1 ml의 MEH-PPV의 질량을 계산한다. M = N / V (N -. 더 몰, V - L의 볼륨 ()는 식 7) 따라서, 1 ㎖ 중의 MEH-PPV의 질량의 조절 싶게iluted 원액 9.15 X 10-4 g이다. </li></ol></li><li> MEH-PPV의 혼합 PCBM <ol><li> 페닐 C 61 - 뷰티 르산 메틸 에스터 (PCBM)의 질량을 계산하는 것은 50 중량 % PCBM은 질량에 대해 정의 된 50 중량 % PCBM 도핑 MEH-PPV 용액을 만들기 위해 콘텐츠 MEH-PPV 용액에 첨가되는 MEH-PPV의 (즉, MEH-PPV의 절반 질량). 2.2 절에서 얻은 MEH-PPV의 무게를 사용하여. MEH-PPV × 100 % = 50 중량 % PCBM의 PCBM / 9.15 × 10 -4 G의 질량 (는 식 8) PCBM = 4.57 × 10 -4 G의 질량 (는 식 9) </li><li> 유리 병에 1 mg을 PCBM의 무게를 500 μL의 THF를 추가합니다. 910.88 g / 몰로서 PCBM의 분자량을 사용하여이 용액에 PCBM의 농도를 계산할 PCBM 솔루션 = 0.001 g / (910.88 g / 몰 * 500 μL)의 몰 농도 (는 식 10) PCBM 용액의 몰 농도 = 2.19 × 10 -9 몰 / μL (는 식 (11)) </li><li> PCBM 용액의 부피를 계산하는 조정에 추가 할 필요 ME를 희석하지H-PPV 스톡 용액을 단계 2.3.2에서 산출 몰 농도를 사용하여 THF의 50 중량 % 도핑 PCBM MEH-PPV 용액을 얻었다 4.57 X PCBM X 1 몰 / 910.88 GX 1 μL / 2.19 × 10 -9 몰 = 229 μL의 10 -4 G (는 식 (12)) 조정 희석 MEH-PPV 원액 1 ㎖로 PCBM 용액 229 μl를 넣고 잘 섞는다. </li></ol></li><li> 재 침전 방법에 의한 나노 입자의 제조 <ol><li> 전송에 연결된 바늘로 1 ML의 주사기에 혼합 MEH-PPV / PCBM 용액 1ml를. </li><li> 급속 1,200 rpm으로 교반 DI 물 4 ㎖ 중에 혼합 MEH-PPV / PCBM 용액 1 ㎖을 주입. 주사 후 즉시 교반 중지합니다. 추가 처리없이 이러한 나노 입자를 사용합니다. </li></ol></li></ol> 이미징을위한 나노 입자와 세포 라인의 3 배양 참고 : 모든 영상 실험은 35mm 페트리 접시에 완성되었다 <ol><li> nanoparti의 통풍 관세포주에서 사이클 사용 <ol><li> 12 번째 통로까지 배양 세포주. 35mm 배양 접시에서 12 일 통과 배양 세포에서. 24 시간 후 세포가 40 %의 합류이되도록 35mm 배양 접시에 추가 세포의 농도를 조정합니다. </li><li> 이 단계에서, 배양 접시에서 10 % FBS가 첨가 된 DMEM 미디어를 제거 두 번 1X DPBS로 세포를 씻어하고 페트리 접시에 2 ml의 DMEM에 나노 입자 현탁액의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 24 시간 후 배양 접시에서 DMEM / 나노 입자 현탁액을 제거하고 1X DPBS 3 회와 세포를 씻으십시오. 그런 다음 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드와 인큐베이션하여 세포를 고정한다. DPBS로 두 번 씻으십시오. 2 분 동안 인큐베이션하여 염료가 300nm DAPI와 세포를 염색. DPBS로 두 번 씻으십시오. 그런 다음 이미징 DPBS에서 세포를 유지합니다. </li></ol></li><li> ROS의 탐지 <ol><li> 문화 A549 및 섹션 3.1.1에 설명 된대로 페트리 접시, 세포주 당 6에서 OVCAR3 세포 라인. 레이블페트리 접시는 표 1에 도시. </li><li> 표 1과 24 시간 동안 배양으로 배양 접시의 세에 2 ml의 DMEM에 나노 입자 현탁액의 100 μl를 추가합니다. 빛 복용량을받을 24 시간 후 세포를 씻어 HBSS (행크의 균형 소금 용액)의 셀을 중단 무료 미디어를 염색 할 배양 접시하십시오. </li><li> 15 분의 솔라 시뮬레이터의 램프를 따뜻하게. 자외선을 걸러 램프의 전면에 UV 필터를 놓습니다. 페트리 접시의 표면에서 0.5 일 (50 mW의 / cm 2)의 강도를 얻기 램프 전력을 조정함으로써 기준 태양 전지와 램프를 보정. 이 특정 설정에서 해당 조건 램프에 공급되는 218 W의 전력을 얻을 수 있었다. </li><li> 180 J 아래의 계산과 같이 / ㎠의 빛 복용량 결과 60 분 동안 램프 (뚜껑 오픈)에서 배양 접시를 놓고 : 50 mW의 / cm 2 × 3,600 초 / 1,000 = 180 J / ㎠ </li><li> HBSS를 제거하고 세척하지 않고 더 배양 접시에 10 % FBS가 첨가 된 2 ml의 DMEM 미디어를 추가 할 수 있습니다. 또 다른 2 시간 동안 세포를 배양한다. </li><li> 양성 대조군을 30 분 동안 100 μM 과산화수소 (H 2 O 2)와 함께 세포를 배양한다. </li><li> 37 ° C에서 30 분 동안 염색을 가진 세포를 배양하여 ROS 검출 시약 5 μM의 최종 농도로 모든 배양 접시에 세포를 염색. </li><li> 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드와 인큐베이션하여 세포를 고정한다. DPBS로 두 번 씻으십시오. 2 분 동안 인큐베이션하여 염료가 300nm DAPI와 세포를 염색. DPBS로 두 번 씻으십시오. 그런 다음 이미징 DPBS에서 세포를 유지합니다. </li></ol></li><li> PI와 아 넥신 V FITC에 의해 세포 사멸 및 괴사 <ol><li> 문화 5 페트리 접시에 각각의 세포주. 나머지 2 페트리 접시 제어 샘플 될 것이지만이 배양 접시의 세 가지 실험이 될 것입니다. 전자와 같은 나노 입자 실험 3 페트리 접시를 품어섹션 3.1.2에 xplained. 제어 샘플을 나노 입자로 배양되지 않습니다. </li><li> 24 시간 배양 후 단계 3.2.3을 따르십시오. </li><li> 램프 (뚜껑 오픈)에서 3 실험 배양 접시를 놓고 20 분, 40 분에 한 60 분에서 하나에 하나를 제거합니다. 이 60, 120, 180의 가벼운 용량 J / ㎠, 각각 (섹션 3.2.4에서 계산)에 노출 된 세 개의 샘플을 얻을 수 있습니다. 다음에, 제어 배양 접시 중 하나에 180 J / cm 2 광 투여를 관리. 이는 나노 입자의 부재 하에서인가 광 복용량 제어이다. 빛 나머지 제어 샘플 용량 (NO 나노 입자 및 적용 등 없음 용량)를 적용하지 마십시오. </li><li> 10 % FBS가 첨가 된 DMEM 매체와 HBSS를 교체하고 4 시간 동안 인큐베이터에서 배양 접시를 유지한다. </li><li> 15 분 동안 염색하여 세포를 배양하여 실험 및 아 넥신 V의 FITC 20 μL와 제어 배양 접시에 세포를 염색. DPBS로 두 번 씻으십시오. C를 얼룩2 분 동안 염료로 배양 300 나노 DAPI뿐만 아니라 300 나노 PI (요오드화 프로피 듐)와 ELL 학생. DPBS로 두 번 씻으십시오. 그런 다음 이미징 DPBS에서 세포를 유지합니다. </li></ol></li></ol> 나노 입자 4. 내장 세포 독성 <ol><li> 96 웰 플레이트에 세포 배양을 계산 <ol><li> 미디어를 제거하고 10 분 동안 0.05 % 트립신으로 세포를 인큐베이션 DPBS로 두 번 세포를 세척하여 배양 플라스크로부터 세포를 수확. 그 결과 세포 용액에 10 % FBS가 첨가 된 2 ml의 DMEM 미디어를 추가합니다. 단봉으로 세포 클러스터를 분리하는 제대로 솔루션을 섞는다. </li><li> 세포 현탁액 100 ㎕을 취하여 10 % FBS가 보충 된 900 ㎕의 DMEM 배지에 추가. 잘 섞는다. 혈구에이 서스펜션의 10 μl를 놓습니다. 혈구를 사용하여 세포를 세어 4.1.1 4 × 10 5 세포 / ml의 세포 현탁액의 농도를 조절한다. </li><li> 5 96 웰 플레이트는 0 시간, 24 시간으로 표시 가지고 가십시오R, 48 시간, 72 시간, 96 시간. 따라서 / 웰의 세포를 파종 2500, 표 2에 나타낸 바와 같이 우물에 5 × 104 세포 / ㎖의 세포 용액 50 ㎕의 TE (71, A549)를 추가한다. OVCAR3 및 MDA-MB-231 세포주에 대해 동일한 절차를 수행합니다. </li><li> 24 시간 후 1X DPBS 가진 웰을 세척하고, 표 2에 나타낸 바와 같이 우물에 나노 입자의 농도가 증가하는 50 μL를 추가한다., 20 (100)를 추가하여 다양한 나노 입자의 농도를 준비하고, DMEM 2.4.2로부터의 나노 입자 현탁액을 180 μL에 각각 최종 0.4 × 10-4 ㎎ / ㎖ 농도의 나노 입자를 얻을 수 2 ㎖의 부피, 2.0 × 10 -4 ㎎ / ㎖, 3.6 X 10-4 ㎎ / ㎖를 얻었다. 각 셀 라인은 나노 입자의 각 농도 삼중있다. </li></ol></li><li> 어둠 속에서 세포 생존 능력을 측정 <ol><li> 바로 나노 입자를 추가 한 후 0 시간 플레이트에 10 μL의 MTT를 추가합니다. 포르 마잔 크리스 í 4 시간 동안 접시를 품어루게릭 병은 형성한다. 우물에 50 μL의 가용화 솔루션을 추가합니다. 포르 마잔 결정을 용해 6 시간 동안 접시를 품어. </li><li> 마이크로 플레이트 리더와 570 nm에서 흡광도를 기록하여 0 시간 플레이트의 세포 생존율을 측정한다. </li><li> 24 시간 플레이트를 들어, 1X DPBS로 세포를 씻어 나노 입자와 각 웰 후 24 시간 배양에 50 μL 미디어를 추가 할 수 있습니다. MTT를 추가하고 4.2.1과 4.2.2에서 설명 판을 읽어 보시기 바랍니다. </li><li> 48 시간, 72 시간, 96 시간 플레이트, 1X DPBS로 세포를 씻어 나노 입자와 24 시간 배양 한 후 우물에 50 μL 미디어를 추가 할 수 있습니다. 남은 시간 동안 세포를 품어. </li><li> 4.2.1 4.2.2 4.2.5에서 설명 된 바와 같이) 특정 시점에서 세포 생존 능력을 측정한다. </li><li> (N = 3) 3 회 반복 실험을 완료 </li></ol></li></ol> 5. PDT 후 세포 생존 능력을 측정 <ol><li> 세포를 계산하고 96 웰 플레이트에서 배양. <ol><li> 9 세트 레이블TE A549 71 + 판 OVCAR3 + 및 MDA-MB-231 플레이트 모두 표 3에 나타낸 바와 같이 6 웰 플레이트. 4.1.3에 도시 된 바와 같이 판의 배치는 동일하다. </li><li> 섹션 4.1.2에서 표 2에 나타낸 바와 같이 동일한 레이아웃 4.1 절에서 설명한 바와 같이 96 웰 플레이트 종자. </li><li> 24 시간이 판에 나노 입자를 추가 한 후 4.1.4에 설명 된대로. </li><li> 나노 입자의 첨가 한 후 24 시간이 1X DPBS로 세포를 씻어 각 웰에 50 μl의 HBSS를 추가합니다. </li><li> 3.2.3에서 설명한 바와 같이 각각의 빛의 용량을 가진 판을 조사. </li><li> 10 % FBS가 첨가 된 50 μL DMEM 매체와 HBSS를 교체하고 PDT 후 각각의 기간에 대한 번호판을 품어. </li><li> 4.2.1과 4.2.2에서 설명한 바와 같이 각각의 시간 후 세포 생존율을 측정한다. </li></ol></li></ol> 6. 형광 현미경 <ol><li> 나노 입자의 통풍 관 <ol><li> 현미경의 램프를 켜십시오차 영상 전에 레이저 30 분. 현미경의 무대에 (3.1 절에서 설명) 고정 된 세포를 포함하는 배양 접시를 넣어. </li><li> . 표 4에 나타낸 바와 같이 필터를 사용하여 나노 입자 및 DAPI에서 형광을 수집 ImageJ에 소프트웨어의 위상차, 나노 입자 및 DAPI 이미지를 오버레이. </li></ol></li><li> ROS의 탐지 <ol><li> 촬영 전에 현미경 30 분의 램프를 켭니다. 현미경의 무대에 (3.2 절에서 설명) 세포를 포함하는 배양 접시를 넣어. </li><li> . 표 4에 나타낸 바와 같이 필터를 사용하여 나노 입자를 검출 시약, DAPI 및 형광 ROS로부터 수집 ImageJ에 소프트웨어의 위상차, 나노 입자, 및 DAPI ROS 검출 시약 이미지를 오버레이. </li></ol></li><li> PI와 아 넥신 V FITC에 의해 세포 사멸 및 괴사 <ol><li> 촬영 전에 현미경 30 분의 램프를 켭니다. 에서 설명한 바와 같이 (세포를 포함하는 페트리 접시를 넣어현미경의 무대에 3.3 절). </li><li> . 표 4에 나타낸 바와 같이 필터를 사용하여 나노 입자, DAPI, PI 및 넥신 V에서 FITC 형광을 수집 ImageJ에 소프트웨어의 위상차, 나노 입자, DAPI, PI 및 넥신 V FITC 이미지를 오버레이. </li></ol></li></ol>

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나노 입자를 제조하는 동안 나노 입자의 흡수를 달성하기 위해 그것은 몇 가지 중요한 조치를 유지하기 위해 필요한이었다. 이 용액의 농도가 형성되는 나노 입자의 크기를 결정하는데 중요한 역할을하는 것으로 관찰되었다로 THF에 (50 중량 % PCBM 혼합) × 10-6 M MEH-PPV 용액을 DI 물 내로 주입하도록 준비 하였다. 농도는 자외선 - 마주 분광에 의해 확인되었다. 프로토콜 단계에서 그 처음이 솔루션 때문에 자외선 - 마주 스펙트럼을 복용하기 전에 초기에 준비 MEH-PPV 용액 (원액 MEH-PPV 원액)을 희석 할 필요가 있었다 2.1.3 참고 1. 주입의 속도보다 훨씬 더 흡광도를 가지고 또한, 나노 입자의 크기를 결정하는데 중요한 역할을하고, 격렬히 DI 물을 교반하면서 가능한 한 빨리한다. 천천히 주입은 더 큰 나노 입자가 발생합니다. 또한, 교반을 추가로 응집을 방지하기 위해 주입 후 즉시 중단되어야한다. 주입하는 동안용액을 물에 나노 입자의 크기에 영향을 미칠 것이다 기포 형성을 방...

광 역학 요법 (PDT) 감광제는 조직을 대상으로 투여하고, 감광제를 노광시에 활성 산소 종 (ROS)를 생성한다. 이러한 중항 산소와 슈퍼 옥사이드 등의 활성 산소 종은 산화 스트레스 및 세포 및 조직 1-4 이후에 구조적 손상을 유도 할 수 있습니다. 때문에 응용 프로그램의 용이성이 방법을 적극적으로 조사되었으며, 임상 시험 장소 5,6를 촬영했다. 그러나, (감소 생체 이용률 및 잠재적 인 급성 독성에 이르게) 증감의 어두운 증감의 독성, 빛 (으로 인한 증감의 비 선택적 분포) 환자 감도 및 소수성과 같은 중요한 문제가 남아있다. 여기에서 우리는 제작과 시험관 PDT의 차세대 감광제로 풀러렌과 혼합 고분자 나노 입자를 실시하고 평가하는 방법을보고합니다. 나노 입자의자가 응집에 의해 형성된다반도체 성 중합체 MEH-PPV (폴리 [2- 메 톡시 -5- (2- 에틸 헥 실옥시) -1,4- 페닐 렌])이 물질에 용해 호환 플러렌 PCBM (C-61 페닐 - 부티르산 메틸 에스터)와 용매를 신속하게 호환되지 않는 용매 (그림 1A)에 주입된다. 호스트 중합체로서 MEH-PPV의 선택은 삼중 형성 높은 속도에 이르게 높은 흡광 계수에 의해 동기 및 플러렌 PCBM 7 효율적인 초고속 충전 및 에너지 전달을 모두한다. 이러한 속성은 단일 산소와 PDT의 과산화물 형성의 증감에 이상적입니다. 플러렌은 실제로 두 분자 및 나노 입자 형태로 8-13 PDT에 적용되어왔다. 그러나 심각한 독성은 추가 개발 (12) 방해했다. 여기에서 우리는 MEH-PPV의 호스트 매트릭스에 풀러렌을 캡슐화하는 PDT 증감 재료 복합 MEH-PPV / PCBM 나노 입자의 결과를 얻을 것을 보여 그 전본질적으로 세포 독성이 아니다 인해 상기 광 물리 특성에 암 나노 입자의 크기 및 표면 전하에 의한 세포 및 낮은 조명 용량에서 수율이 매우 효과적인 PDT 치료 대한 특이성을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>폴리[2-메톡시-5-(2-에틸헥실옥시)-1,4-페닐렌비닐렌](MEH-PPV)</td><td>시그마 에이드리치</td><td>536512-1G</td><td>평균 Mn&nbsp; 150,000-250,000</td></tr><tr><td>[6,6]-페닐 C61&nbsp; 부티르산 메틸 에스테르 (PCBM)</td> <td>시그마 에이드리치</td><td>684449-500MG</td>><td>99.5%</td></tr><tr><td>테트라하이드로푸란 (THF)</td><td>EMD</td><td>TX0284-6</td><td>Drisolv</td></tr><tr><td>1 ml 주사기</td><td>National Scientific Company</td><td>37510-1</td><td>MEH-PPV 용액</td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>VWR</td><td>28145-495</td><td>25 mm, 0.2 &micro의 여과용; m, PTFE</td></tr><tr><td>1ml 주사기</td><td>Hamilton Company</td><td>81320</td><td>나노 입자를 만들기 위해 MEH-PPV 용액을 물에 주입하기 위해</td></tr><tr><td>Dulbecco의 Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM)</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-350</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS)</td><td>Quality Biological (VWR)</td><td>10128-740</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수, 칼슘 및 마그네슘 없는 식염수 1개(DPBS)</td><td>코닝(VWR)</td><td>45000-436</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 일반(열 비활성화)(FBS)</td><td>코닝(VWR)</td><td>45000-736</td><td></td></tr><tr><td>트립신 EDTA 1x 0.25%</td><td>코닝(VWR)</td><td>45000-664</td><td>중탄산나트륨, 칼슘 및 마그네슘이 없는 HBSS의 트립신/2.21mM EDTA 돼지 파보바이러스</td></tr><tr><td>테스트 16% 파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학&nbsp;</td><td>15710</td><td>16% 파라포름알데히드는 PBS DAPI를 첨가하여 4%로 희석됩니다</td></tr><tr><td></td><td>. 비오튬 VWR</td><td>89139-054</td><td>핵 염색</td></tr><tr><td>5ml 피펫</td><td>VWR</td><td>82050-478</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 배양 플라스크</td> 세포 <td>배양용</td><td>VWR</td><td>82050-856</td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>MTT 분석용</td><td>VWR</td><td>82050-771</td></tr><tr><td>통풍구가 있는 조직 배양 접시</td><td>Greiner Bio-One(VWR)</td><td>82050-538</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>분자 프로브</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V FITC</td><td>Invitrogen</td><td>A13199</td><td>염료 apoptosis</td></tr><tr><td>Celltiter 96 non-R 1000 assays</td><td>Promega (VWR)</td><td><a href="https://www.vwrsp.com/catalog/product/index.cgi?catalog_number=PAG4000">PAG4000</a></td><td>MTT</td></tr><tr><td>CellROX Green Reagent, ROS용</td><td>Invitrogen</td><td>C10444</td><td> 검출</td></tr><tr><td>UV-vis 분광계</td><td>Agilent 8453</td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광 분광계</td><td>NanoLog HoribaJobin Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>동적 광 산란</td><td>PD2000DLS, 정밀 검출기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>NuAir DH 자동 흐름</td><td></td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Zeiss Axioskop2</td><td></td><td>63X 오일 이멀젼 대물 렌즈</td></tr><tr><td>에피루미네센스 현미경</td><td>Olympus IX71</td><td></td><td>60X 물 몰입 대물 렌즈, Andor Zyla sCMOS 카메라</td></tr><tr><td>솔라 시뮬레이터</td><td>Newport 67005 Oriel Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>참조 태양 전지</td><td>Oriel&nbsp;</td><td></td><td>VLSI 표준 통합</td></tr><tr><td>Microplate 리더</td><td>BioTek Ex808</td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Hausser Scientific Partnership</td><td>3200</td><td>세포 계수용</td></tr></tbody></table>

혼합 폴리머 / 풀러렌 나노 입자 감광제를 실시와 광 역학 치료

Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers

이 기사에서는 광역학 요법(PDT)을 위한 차세대 광감작제로 풀러렌과 혼합된 전도성 고분자 나노 입자의 제조 및 재현 가능한 체외 평가 방법을 보고합니다. 나노 입자는 반도체 고분자 MEH-PPV (폴리 [2- 메 톡시 -5- (2- 에틸 헥실 옥시) -1,4- 페닐 렌 비닐 렌])과 풀러렌 PCBM (페닐 -C61- 부티르산 메틸 에스테르)의 소수성 상호 작용에 의해 형성된다. MEH-PPV는 높은 흡광 계수를 가지고 있어 삼중항 형성 속도가 높고 풀러렌 PCBM으로의 효율적인 전하 및 에너지 전달이 가능합니다. 후자의 프로세스는 풀러렌 보조 삼중항 및 라디칼 형성을 통해 PDT 시스템의 효율성을 향상시키고 MEH-PPV의 초고속 비활성화를 통해 흥분된다고 밝혔습니다. 여기에 보고된 결과는 이 나노입자 PDT 감작 시스템이 매우 효과적이며 암 세포주에 대해 예상치 못한 특이성을 보인다는 것을 보여줍니다.

통풍 및 나노 입자의 고유 세포 독성 50 중량 % 혼합 MEH-PPV / PCBM 나노 입자 TE (71)와 함께 배양하고, MDA-MB-231, A549 및 OVCAR3 세포주. PCBM 혼합 수준은 공액 폴리머 및 풀러렌 (14) 사이의 최적의 충전 및 에너지 전달 특성을 제공하는 것으로 나타났다 50 중량 % PCBM로서 선택되었다. 나노 입자의 흡수 형광 이미지는도 1b에 도시되어있다. 나노 입자는 세포 흡수를 보장하기 위해 나노 입자로 24 시간 동안 배양 하였다. 세포를 촬상 전에 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하고, 세포 및 핵의 위치를​​ 검출하기 위해 DAPI로 염색 하였다. 화상 충분히 분리하기 위해 세포 40 % 컨 플루 유지 하였다. 해당 위상차 이미지 형광 이미지 A549 및 OVCAR3 암 세포주에 의한 나노 입자의 우선적 인 흡수가 있다는 것을 보여준다. 검출 가능한 형광 TE (71) 제어에서 ...

이 프로토콜은 풀러렌과 혼합된 전도성 폴리머 나노 입자의 제조 방법을 설명합니다. 이러한 나노 입자는 광역학 요법(PDT)을 위한 차세대 광감작제로 잠재적으로 사용할 수 있도록 조사되었습니다.

In this article a method for the fabrication and reproducible in-vitro evaluation of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene as the next ...

다음 실험의 전반적인 목표는 암 치료를 위한 광역학 치료 또는 PDT 응용 분야의 차세대 광감작제를 개발하는 것입니다. 이는 수분산성 전도성 고분자 나노입자를 제조하기 위해 침전법 제작 방식을 적용함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 나노입자를 in vitro에서 암세포와 함께 배양한 다음, 빛을 조사하여 PDT에 관여하는 활성 라디칼인 활성 산소종 또는 ROS를 생성시킵니다.다음으로, 세포 집단 내의 생존 분율과 TED 분율을 결정하기 위해 정량적 분석과 정성적 이미징을 통해 치료 효과를 평가합니다. 결과에 따르면, 여기서 OAR three로 모델링된 난소암과 같은 공격적인 암세포는 본 연구에서 보고된 나노입자 광감작제를 풍부하게 흡수하며, PDT 치료가 in vitro에서 매우 효과적임을 보여줍니다. 이 경우, PDT의 효과는 서로 다른 세포주가 흡수한 나노입자의 양과 직접적인 상관관계가 있습니다.화학요법, 방사선 요법 및 수술과 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 치료를 질환 부위에 특이적으로 타겟팅하여 부작용을 줄일 수 있다는 점입니다. 사용된 활성 물질은 in vitro 세포독성을 보이지 않았으며, 향후 개발을 통해 나노물질 시스템을 tDCS 부위에 더욱 특이적으로 만들 수 있을 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포주 배양과 M-E-H-P-P-V 스톡 용액 준비로 이 절차를 시작하십시오. 희석하지 않은 M-E-H-P-P-V 스톡 용액 50 µL를 3 mL의 TETRAHEDRAN 또는 THF에 첨가하십시오.이 용액을 희석된 M-E-H-P-P-V 스톡 용액으로 라벨링하고 1 cm 쿼츠 큐벳으로 옮긴 후, 자외선 가시광선 분광법(ultraviolet visible spectroscopy)을 사용하여 495 nm에서의 흡광도를 측정합니다. 희석된 M-E-H-P-P-V 스톡 용액의 흡광도가 0.17보다 높으면, 495 nm에서 측정된 흡광도가 0.13에서 0.17 범위에 들어올 때까지 희석되지 않은 M-E-H-P-P-V 스톡 용액에 THF를 1 mL씩 추가하여 희석합니다. 다음으로, 혼합된 M-E-H-P-P-V-P-C-B-M 용액 1 mL를 바늘이 장착된 1 mL 주사기에 빠르게 옮겨 침전법으로 나노입자를 제조합니다.혼합된 M-E-H-P-P-V-P-C-V-M 용액 1 mL를 1200 RPM으로 교반 중인 4 mL의 탈이온수에 주입하고, 주입 직후 교반을 즉시 중단합니다. 추가 처리 없이 이 나노입자들을 사용하여 나노입자와 함께 배양된 세포에 PDT를 수행합니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 96웰 플레이트 세트에 라벨을 붙입니다.배양 플라스크에서 배지를 제거하고 DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline)로 세포를 2회 세척하여 세포를 회수한 다음, 0.05% trypsin과 함께 10분 동안 배양합니다. 생성된 세포 용액에 10% fetal bovine serum이 첨가된 2 mL의 Dulbecco's modified eagle medium을 가합니다. 용액을 적절히 혼합하여 세포 집락을 단일 세포로 분리합니다. 세포 현탁액 100 µL를 취해 10% FBS가 첨가된 900 µL의 DMEM에 넣고 잘 섞은 후, 이 현탁액 10 µL를 혈구계수기(hemocytometer)에 접종합니다.헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정하고 세포 현탁액의 농도를 mL당 50,000 cells로 조정합니다. 그런 다음 세포 용액 50 µL를 웰에 첨가하여 96 웰 플레이트에 분주함으로써 웰당 2,500 cells가 되도록 합니다. 이어서, 준비된 나노입자 현탁액 2100 µL 및 180 µL를 DMEM에 첨가하여 최종 부피가 2 mL가 되도록 하여 서로 다른 나노입자 농도를 준비합니다.24시간 후, 웰을 1X DPBS로 세척하고 농도가 증가하는 나노입자 50 µL를 각 웰에 첨가합니다. 각 세포주당 나노입자의 농도별로 3반복(triplicates)으로 구성합니다. 나노입자 첨가 24시간 후.세포를 1X DPBS로 세척하고 각 웰에 50 µL의 Hank's balanced salt solution 또는 HBSS를 첨가합니다. 세포에 조사하기 위해 솔라 시뮬레이터의 램프를 15분 동안 예열합니다. UV 광선을 차단하기 위해 램프 앞에 UV 필터를 설치합니다. 기준 태양전지를 사용하여 96-웰 플레이트 표면에서 0.5 sun 강도가 되도록 램프 전력을 조정하여 램프를 교정합니다.해당 조건은 램프에 218 watts의 전력을 공급하여 달성되었습니다. 96 well plate의 뚜껑을 연 상태로 램프 아래에 두고 세포를 60분 동안 조사하며, 조사 후 광량은 180 joules per square centimeter가 됩니다. HBSS를 10% FBS가 보충된 DMEM 50 microliters로 교체하고, 광역동 치료 후 각각의 정해진 시간 동안 plate를 배양합니다.각 시간 간격 후에, 웰에 10 µL의 MTT를 첨가하여 세포 생존율을 측정합니다. 결정이 형성될 수 있도록 플레이트를 4시간 동안 배양합니다. 그런 다음, 웰에 50 µL의 가용화 용액을 첨가하고 플레이트를 6시간 동안 배양합니다.포레스온 결정을 용해합니다. 나노입자의 고유 세포독성을 측정하기 위해 마이크로플레이트 리더로 570 nanometers에서 흡광도를 기록하여 세포 생존율을 측정합니다. 나노입자의 흡수량을 측정하기 위해 PDT를 적용하지 않은 96 웰 플레이트를 판독합니다.PDT 후 형성된 ROS 검출 및 PDT 후 세포 사멸 및 괴사 검출. 먼저 현미경 램프와 레이저를 켭니다. 이미징 30분 전. 고정된 세포가 들어 있는 페트리 접시를 현미경 스테이지 위에 올립니다.나노입자로부터 형광을 수집합니다. RROS 검출 시약은 propidium iodide입니다. Image J에서 XIN five fitsi 및 DPI를 통해 위상차 이미지와 형광 이미지를 중첩합니다. 서로 다른 세포주와 나노입자를 함께 배양한 후의 대표적인 소프트웨어 결과가 여기에 제시되어 있습니다.Ocar three 세포주가 가장 높은 흡수율을 보였으며, 5 49와 MDA MB 2 31이 그 뒤를 이었습니다. TE 71에서는 나노입자의 형광이 나타나지 않았습니다. 암실 상태로 유지했을 때 이들 세포주의 세포 생존율 측정 결과가 여기 막대 그래프로 표시되어 있습니다.모든 세포주에서 96시간까지 세포 사멸이 거의 일어나지 않았습니다. ROS 검출 시약을 통해 검출된 ROS 생성 결과가 여기 세 가지 세포주에 대해 나타나 있습니다. 이 대조군 샘플에서.나노입자와 광조사가 모두 없으므로 녹색 형광이 나타나지 않습니다. 그러나 PDT 직후 세포에 나노입자와 광조사를 모두 처리하면, R os 검출 시약에 의한 밝은 녹색 형광을 확인할 수 있습니다. DT 후의 세포 생존율을 다양한 나노입자 농도에 따른 막대그래프로 나타내었습니다.여기 live dead 이중 염색 실험 결과가 제시되어 있으며, 여기서 car three 세포주는 고광량 조사 시 괴사를 겪는 반면, 저광량 조사 시에는 세포 사멸(apoptosis)을 겪습니다. 이 영상을 시청한 후에는 광역학 치료 기반 질환 치료에 적용하기 위한 복합 전도성 고분자 나노입자를 제조하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

광역학 요법(PDT)은 폐암 치료를 위한 비침습적 비수술적 방법입니다. 광감작제는 종양 조직에 선택적으로 축적되어 산소와 적절한 파장의 빛이 있는 상태에서 종양 세포를 사멸시킵니다. 이 프로토콜 비디오에서는 PDT 기반 방법을 사용하여 폐암 세포에서 잠재적인 광감작제의 광독성 가능성을 평가합니다.

체외 광독성 분석법: 폐암 세포에서 광감작제의 광독성 가능성을 평가하기 위한 PDT 기반 방법

유기 염료 분자와 올레산으로 코팅된 상향 변환 나노 입자는 수용성이 아닙니다. 이 프로토콜은 유기 염료 분자를 전달하고 입자를 초기 소수성 용매에서 물로 상향 변환할 수 있는 '플러그 앤 플레이' 방법을 설명합니다.

&#39;플러그 앤 플레이&#39;방법은 양친 매성 고분자, 유기 염료 및 업 컨버팅 나노 입자를 포함하는 수분 산성 Nanoassemblies 만들기

유기 반도체 폴리머의 사용을 기반으로 가시광선으로 체외 세포 배양 전기 활성을 자극하는 방법이 설명됩니다.

공액 고분자에 의해 세포를 전기적 활동을 생활의 광 제어

전기 활성 폴리머로 구성된 나노 입자의 합성 및 제조를 위한 프로토콜이 제시됩니다.

전기 활성 고분자 나노 입자 출전 광열 등록

광역학 요법(PDT)은 폐암 치료를 위한 대안입니다. PDT의 치료 효과를 높이기 위해 화학요법과 결합된 폐암 표적 나노입자를 개발했습니다. 제조된 나노입자를 사용한 PDT의 시험관 내 및 생체 내 항암 효능을 모두 평가했습니다.

폐암 표적 나노 입자와 광 역학 치료의 항암 효능

Photodynamic 치료 (PDT)는 것 적용된 photosensitizer (PS) 뒤에 보이는 빛 photoactivation apoptosis 유도 보육 관련 의료 절차입니다. 우리는 생체 외에서 PDT 프로토콜 PS 인큐베이션 및 가벼운 치료 매개 변수는 차이 연구 하는 데 사용할 수 있습니다 태평양 표준시를 시뮬레이션 하도록 설계 되었습니다 제시.

Photodynamic 치료 체 외에서 접근

약물 내성 칸디다 알비 칸스의 발생률이 증가하는 것은 전 세계적으로 심각한 건강 문제입니다. 항균 광역학 요법 (aPDT)은 약물 내성 곰팡이 감염에 맞서 싸울 수있는 전략을 제공 할 수 있습니다. 본 프로토콜은 시험관내에서 다약제 내성 C. 알비칸 균주에 대한 로즈벵골 매개 aPDT 효능을 기술한다.

로즈 벵골 매개 광역학 치료 칸 디다 알비칸을 억제하기 위해

여기에서는 2차원 HeLa 세포 배양 및 베르테포르핀을 감광제로 사용하여 체외 광역학 치료(PDT) 분석을 성공적으로 수행할 수 있는 새롭고 간단하며 저렴한 장치에 대해 설명합니다.

2D 세포 배양 모델에서 Verteporfin 세포 독성을 향상시키기 위한 자체 제작 및 발광 다이오드 기반 광역학 치료 장치

이 프로토콜은 광반응성 전구약물-염료 나노어셈블리의 제조 및 특성화를 설명합니다. 광 조사 설정을 포함하여 광 트리거 분해에 의한 나노 입자로부터의 약물 방출 방법론이 명시 적으로 설명된다. 광 조사 후 나노 입자로부터 방출 된 약물은 인간 대장 종양 세포에 우수한 항 증식 효과를 나타냈다.

Prodrug-Dye Nanoassemblies의 용이한 준비 및 광활성화

이 논문은 플라즈몬 광열 요법을 위해 광학적 특성을 복제하는 종양 조직 팬텀을 준비하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 백서는 팬텀 준비, 광열 평가 및 치료 매개변수를 평가하기 위한 광열 온도 측정을 기반으로 개발된 수치 모델의 검증에 대해 자세히 설명하며, 예비 테스트를 위한 생체 내 연구에 대한 윤리적이고 비용 효율적인 대안을 제공합니다.

플라즈모닉 광열 암 치료: 광열 온도 분포 시각화를 위한 나노 입자 내장 종양 조직 모방 팬텀

학습하세요 전도성 폴리머 나노입자와 풀러렌을 혼합한 차세대 광감작제를 침전법으로 제조하는 방법을 배우세요. 이 기술은 광역학 치료에서 반응성 산소종을 생성하여 난소암 등 공격적인 암세포를 효과적으로 사멸시킵니다.

혼합 폴리머 / 풀러렌 나노 입자 감광제를 실시와 광 역학 치료

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