산화 티타늄을 사용하여 수성 환경에서 단백질과 세포를 포토 패터닝

다음 실험의 전반적인 목표는 이산화티타늄의 광촉매 활성을 이용하여 세포 배양 스캐폴드의 표면 개질을 수행하는 것입니다. 이는 유리 커버슬립 위에 이산화티타늄 박층을 증착한 후, 전체 표면을 소수성으로 만들기 위해 Octadecylsilane으로 코팅함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 기질을 혈청 알부민이 포함된 세포 배양 배지에 담가 블로킹 처리를 합니다.

알부민이 표면에 흡착되어 세포 부착이 일어나지 않는 상태가 됩니다. 다음으로, 시료를 콜라겐이 포함된 수용액으로 옮긴 후 집중된 UV 광선을 사용하여 표면을 조사합니다. 이를 통해 콜라겐 분자가 광조사된 영역에 선택적으로 흡착되어 해당 영역이 세포 부착이 가능한 상태가 됩니다.

이 과정은 여러 단백질이나 세포 유형을 패턴화하기 위해 반복될 수 있습니다. 이 비디오에서는 UV 조사를 통해 PC 12 세포의 접착 영역을 선택적으로 수정하는 방법을 보여줍니다. 우리는 이산화티타늄 광촉매 작용이 빛 조사 시 표면의 유기 오염 물질을 제거하는 자가 세정 유리창으로 상업적으로 응용된다는 점을 깨달았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었으며, 이는 해당 절차가 가능함을 입증합니다. 본 연구는 제 실험실의 대학원생과 공동으로 수행되었습니다.

다이아몬드 스크라이버를 사용하여 샘플의 올바른 면이 위를 향하도록 확인할 수 있게 커버 슬립에 번호를 매깁니다. 그런 다음 커버 슬립을 먼저 흐르는 2회 증류수로 세척하고, 이어서 피라냐 용액에 10분 동안 담가 세척합니다. 10분 후, 커버 슬립을 2회 증류수로 8회 헹구고 질소 흐름 하에서 건조합니다.

다음으로, 무선 주파수(RF) 스퍼터링 시스템에 산화 티타늄 타겟을 장착하고, 폴리아미드 테이프를 사용하여 세척된 커버 슬립을 샘플 홀더에 부착합니다. 샘플 홀더를 스퍼터링 챔버에 넣고 압력이 2.0 × 10⁻⁴ Pa에 도달할 때까지 챔버를 진공 상태로 만듭니다. 그 다음, 챔버에 아르곤 가스를 주입하고 셔터를 닫은 상태에서 증착 압력을 4.0 mTorr로 설정합니다. RF 전력을 70 W까지 서서히 올립니다.

그런 다음 셔터를 열고 15분 동안 스퍼터링하여 120에서 150 nanometers 두께의 박막을 얻습니다. 먼저 유리 비커와 핀셋을 120 °C 오븐에서 30분 동안 건조합니다. 다음으로, 커버 슬립을 플라스마 반응기에 넣고 산소 유량을 100 standard cubic centimeters per minute, 출력 200 watts 조건에서 5분 동안 이산화티타늄 표면을 산소 플라스마로 처리하여 표면의 친수성을 높입니다.

그런 다음 샘플을 꺼내 이중 증류수에 담가 표면이 초친수성인지 확인하고, 질소 흐름 하에서 표면을 완전히 건조시킵니다. 다음으로, 건조된 비커와 핀셋 및 샘플을 질소가 충전된 글로브 백으로 옮기고, 톨루엔에 용해된 1 mM Octadecyltrichlorethylene 용액을 준비합니다. 샘플을 실온에서 해당 용액에 1시간 동안 담가 이산화티타늄 위에 자기 조립 단분자막을 형성합니다.

그 다음, 톨루엔, 아세톤, 에탄올로 시료를 세척하여 모든 페이저(phasor) 분자를 제거합니다. 마지막으로, 각각 5분 동안 2회 증류수로 세척합니다. 그 후 깨끗한 2회 증류수로 시료를 4회 헹구고 질소 흐름 하에서 표면을 건조합니다.

코팅된 커버슬립 샘플을 70% ethanol에 5분 동안 담가 멸균합니다. 그다음 멸균된 2중 증류수로 샘플을 두 번 헹굽니다. 이어서 샘플을 35mm 디시에 넣고 2mL의 PC 12 성장 배지를 추가합니다.

배지 내의 혈청 알부민이 커버슬립 표면에 흡착되는 동안, 샘플을 37°C의 CO2 버퍼 배양기에서 최소 3시간 동안 배양하며 기다립니다. 먼저 아크 램프를 켜서 도립 형광 현미경을 준비합니다. 그다지 UV 필터 큐브를 삽입하고 대물렌즈를 20배 배율 렌즈로 회전시켜 맞춥니다.

UV 강도계로 빛의 세기를 측정하고, 200 joules per square centimeter의 조사량을 위한 조사 시간을 계산합니다. 다음으로, 스테이지 마이크로미터를 사용하여 시야 조리개를 조절함으로써 조사 영역의 직경을 200 microns로 설정합니다. 3시간의 배양 후, 커버슬립을 덮고 있는 배지에 200 microliters의 3.0 milligrams per milliliter Type four collagen을 첨가합니다.

그 다음 35 millimeter 디쉬를 현미경 스테이지로 옮기고, 스크래치 표시를 이용하여 현미경의 초점을 시료 표면에 맞춥니다. 커버슬립의 일정 영역에 200 joules per square centimeter의 선량으로 UV 광선을 조사합니다. 그런 후 배지를 NGF가 포함되고 Type four collagen은 포함되지 않은 2 milliliters의 신선한 성장 배지로 교체하고 시료를 다시 인큐베이터에 넣습니다.

배양된 NGF 분화 PC 12 세포를 15 mL 코니컬 튜브에 수확하고 150 ×g에서 4분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 흡입하고 성장 배지 1 mL를 추가합니다. 헤모사이토미터를 사용하여 부드럽게 파이펫팅하여 세포를 재현탁합니다.

세포 밀도를 측정하고, 수정된 커버슬립이 들어있는 35 millimeter 디쉬에 3.0 × 10⁵개의 세포를 분주합니다. XC two 수정 표면에서 1~2일 동안 배양한 후, 37 degrees Celsius, 5% CO2 인큐베이터에서 1~2일 동안 디쉬를 배양합니다. 현미경을 사용하여 세포가 커버슬립의 UV 조사 영역에서만 부착되어 성장하는지 확인합니다.

그다음, 표면 패턴 형성을 위해 현미경을 설정한 상태에서, 배양된 세포가 담긴 디쉬에 4형 콜라겐 67 µL를 첨가하여 콜라겐의 최종 농도가 100 µg/mL가 되도록 합니다. 디쉬를 현미경 스테이지 위에 놓고 조사 영역을 현재 세포 위치에 인접하게 배치합니다. 커버슬립에 200 J/cm²의 선량으로 UV 광선을 조사합니다.

조사 후, 배지를 콜라겐이 없는 것으로 교체하고 샘플을 다시 인큐베이터에 넣으며, 단일 샘플의 처리를 30분 이내에 완료하도록 합니다. 이것은 스퍼터 증착된 이산화티타늄 박막의 단면 주사 전자 현미경 이미지입니다. 관찰 결과, 박막의 두께는 약 150 nanometers로 추정되었습니다.

여기서 증착된 이산화티타늄 박막의 평탄함 또한 눈에 띕니다. 원자 힘 현미경을 이용한 추가 분석 결과, 표면의 제곱 평균 제곱근(root mean square) 거칠기는 0.2 nanometers에 불과한 것으로 나타났습니다. 4형 콜라겐과 용액은 레이저에 의해 알부민이 제거된 UV 조사 영역에 우선적으로 흡착됩니다.

이 접근법의 다재다능함을 입증하기 위해, 피브린과 같은 다른 단백질 또한 동일한 기술을 사용하여 패턴화되었습니다. 여기에서 세포들은 커버슬립의 XC 2 패턴 영역과 점선으로 정의된 영역의 바로 옆에서 성장하고 있습니다. 커버슬립은 최근 in situ 2에서 UV 조사를 받은 후 type four collagen으로 코팅되었습니다.

이후 5일 동안, 세포는 증식하고 이동하여 새롭게 코딩된 영역을 덮습니다. 여기서 제시된 절차는 배양 중인 세포를 임의로 조작하는 데 활용될 수 있으며, 잠재적으로 여러 종류의 세포를 패턴화하여 정교한 공동 배양 시스템을 구축하는 데 사용할 수 있습니다.