공부 단백질 기능 및 항체의 간섭과 3 차원 재건에 의해 변경 단백질 발현의 역할

다음 실험의 전반적인 목표는 효율적이고 엄격하게 통제된 방식으로 단백질 기능과 변형된 단백질 발현의 역할을 연구하는 것입니다. 이는 세포가 사용할 수 있는 기능성 단백질의 양을 줄이기 위해 항체를 적용함으로써 달성됩니다. 이를 달성하기 위해 항체는 세포막을 가로지르는 통로를 매개하는 Chariot이라는 펩타이드에 결합됩니다.

다음으로, 치료 효과를 평가하기 위해 관심 세포 구조를 이미지화하고 3D로 재구성합니다. 결과는 Chariot 펩티드가 항체 간섭에 의한 핵 단백질을 표적으로 삼는 데 특히 적합하다는 것을 보여줍니다. RNA 간섭과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포로 이동하는 항체가 즉시 효과가 나타나고 연구자가 항체 투여량을 조정하여 간섭 정도를 엄격하게 제어할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 많은 세포 유형에서 단백질 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 치료에 매우 민감하지만 Chariot을 매우 잘 견디는 1차 신경 배양에서 단백질을 표적으로 삼는 데 특히 흥미롭습니다. 준비시, 동결건조된 Chariot 펩타이드 분말을 마이크로리터당 2마이크로그램의 멸균수에 재현탁합니다. 튜브를 조심스럽게 두드려 분말을 용액에 섞습니다.

그런 다음 각 반응에 대해 2마이크로리터만 필요한 작은 작업 분취액을 준비하고 분취액을 섭씨 20도에서 보관합니다. 다음으로, 항생제가 함유된 배지 반 밀리리터가 있는 24웰 플레이트에 포유류 세포를 파종하여 형질 주입을 위해 준비합니다. 뉴런을 사용할 때는 두 개의 중앙 행에만 세포를 낮은 밀도로 시드하십시오.

빈 우물은 나중에 유용합니다. 서두르세요. 배양된 뉴런은 인큐베이터 밖으로 몇 분 이상 나오지 않아야 합니다.

뉴런이 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 일주일에 두 번 배지의 약 1/4에서 1/2을 교환합니다. 비신경 세포 배양은 세포가 50% 합류할 때 사용해야 합니다. 다음 절차는 6개의 테스트 및 6개의 대조군 샘플에 대해 표시됩니다.

각 화물에 대해 샘플당 1X PBS 50마이크로리터에 0.1-2마이크로그램의 희석액을 준비합니다. 사전 결합된 1차 및 2차 항체의 고분자 복합체도 화물로 사용할 수 있습니다. 용액을 부드러운 소용돌이와 혼합한 다음 간단한 원심분리를 합니다.

그런 다음 각 반응에 대해 50 마이크로 리터의 PBS에 2 마이크로 리터의 전차 재고 용액을 희석하십시오. Chariot의 자체 결합을 방지하기 위해 모든 샘플에 대해 별도의 튜브를 사용하십시오. 이제, Chariot 희석액에 준비된 단백질을 결합하십시오.

결합된 단백질을 혼합하고 회전시킵니다. Chariot 화물 단지를 형성할 수 있도록 실온에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 최적의 단백질 펩타이드 양은 화물과 사용되는 세포 유형에 따라 다릅니다.

따라서 이 금액은 경험적으로 결정되어야 합니다. 사전에 첨가제가 없는 일부 성장 배지와 0.5밀리몰 염화마그네슘과 염화칼슘을 함유한 1X PBS를 섭씨 37도까지 예열합니다. 이제 시작하려면 준비된 Chariot 복합체를 100 마이크로 리터의 매체로 희석하십시오.

도금된 셀에서 매체를 제거하고 재사용을 위해 빈 웰로 옮깁니다. 그런 다음 예열 된 500X PBS, 칼슘, 염화마그네슘 용액 1 마이크로 리터로 세포를 부드럽게 씻습니다. Chariot 복합체를 운반하는 매체를 세포에 적용하고 플레이트를 부드럽게 흔들어 용액의 균일한 분포를 보장합니다.

세포를 신속하게 인큐베이터로 되돌리고 한 시간 전에 기다립니다. 뉴런의 경우, 한 시간 동안 배양한 후 저장된 배지를 웰로 옮깁니다. 다른 모든 세포의 경우 최종 농도 10%에 혈청을 추가합니다.배양된 뉴런은 배지 온도 및 pH 변화와 같은 매우 민감합니다.

따라서 이러한 세포는 사전 예열된 용액으로 부드럽게 세척하고 형질 주입한 후 가능한 한 빨리 인큐베이터로 반환해야 합니다. transfection된 화물과 세포 유형에 따라 필요한 만큼 인큐베이션을 계속합니다. 배양 후 평소와 같이 후속 분석을 위해 세포를 처리합니다.

고정 프로토콜과 라이브 이미징은 모두 이 기술과 호환됩니다. 63X 렌즈가 장착된 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 약 0.25 - 0.5 미크론의 거리에서 이미지를 촬영하여 표백을 피하면서 충분한 디테일의 Z 스택을 얻을 수 있습니다. 정확한 레이어 거리는 재구성할 구조의 크기에 따라 다르며 개별적으로 결정해야 합니다.

이미지를 복원하려면 Imaris에서 LSM 파일을 엽니다. 이 소프트웨어를 사용하면 Esc 버튼을 사용하여 선택과 탐색 사이를 전환할 수 있습니다. 또한 Control 키를 누른 상태에서 여러 개체를 선택할 수 있습니다.

디스플레이 조정을 사용하여 각 채널로 이동하여 가장 밝은 구조가 채도에 도달할 때까지 대비를 조정합니다. 이 조정은 표면 구성에 영향을 주지 않지만 이미지의 임계값을 설정하는 데 도움이 됩니다. 재구성할 개체가 다른 파일에 포함되어 있는 경우 Edit and Add Slices 기능을 사용하여 해당 파일을 결합합니다.

그런 다음 Add New Surfaces 아이콘을 클릭하고 Segment only a Region of Interest를 선택합니다. 이제 관심 있는 개체에 맞게 선택 상자의 여백을 조정합니다. 필요한 모든 구조가 상자 안에 들어갈 때까지 사각형 모양의 모양과 기울기를 조정합니다.

Z-평면을 통해 각 이미지에서 선택 영역을 조정해야 합니다. 원하지 않는 개체는 나중에 제거될 수 있습니다. 그런 다음 적절한 채널을 선택합니다.

계속하려면 임계값 설정 도구를 사용하여 관심 있는 구조를 재구성합니다. 지표면 세부 정보 수준 또는 구 지름은 재구성 중인 구조와 일치하도록 설정해야 합니다. 신호 특성에 따라 절대 강도 또는 국부 대비를 사용할 수 있습니다.

일반적으로 국소 대비는 확산 신호에 더 잘 작동합니다. 이 신호의 특성으로 인해 핵 내부의 단백질을 재구성하기 위해 국소 대비가 사용됩니다. 어쨌든 관심있는 각 신호 또는 구조에 대해 설정을 개별적으로 조정해야합니다.

화면 하단의 녹색 화살표를 클릭하여 재구성을 완료합니다. 그런 다음 연필 도구를 사용하여 개체를 추가로 조정합니다. 재구성을 원래 신호와 주의 깊게 비교하고, 절단 도구가 목적을 정확하게 수행할 수 있도록 필요에 따라 이미지를 기울여 표면을 자르고 제거합니다.

이제 Statistics(통계), Detailed statistics(세부 통계) 및 Average Values(평균 값)를 선택하여 각 표면의 부피, 면적 및 강도를 측정합니다. 원하는 경우 해당 표면의 Color 탭을 선택하고 선택한 옵션을 Base에서 Statistic Coded로 변경하여 색상으로 구분된 통계를 생성할 수 있습니다. Take Snapshot 도구를 사용하면 게시를 위해 사진을 찍을 수 있습니다.

동일한 영역 내의 여러 개체를 재구성해야 하는 경우 매개 변수 저장 기능을 사용하여 정보를 저장할 수 있습니다. HEK293 세포에서 발현된 Simiate는 Chariot 펩타이드에 의해 세포로 왕복하는 Simiate 항체에 의해 특이적으로 검출되었습니다. Simiate 항체 집합체는 적용 후 소마(soma)와 핵(nucleus)으로 들어가 노란색 화살표로 표시된 대로 FLAG-Simiate와 특이적으로 공동 국소화합니다.

용량 의존적 방식으로, Simiate 항체는 HEK293 세포에서 대량 세포사멸을 유도한 반면 대조 항체는 효과가 없었습니다. 신경 세포가 독성 효과에 매우 민감하다는 점을 감안할 때, 이 기술은 모의 세포나 치료되지 않은 세포와 전차 처리된 세포를 비교할 때 뉴런의 생존 능력에 영향을 미치지 않는 1차 해마 배양에 적용되었습니다. 동일한 적용 계획에 따라, 염소 항기니피그 Alexa568 항체 집합체는 소마타와 핵에서 발생한 세포의 약 83%에서 다양한 정도로 관찰되었습니다.

이러한 관찰은 HEK293 세포의 결과와 일치하는 3D 분석에 의해 더욱 뒷받침되었습니다. 그러므로, Chariot 기술은 해리된 1차 해마 뉴런을 transfection하는데 성공적으로 사용될 수 있습니다. 일단 숙달되면 이 기술을 제대로 수행하면 3시간에서 6시간 안에 완료할 수 있습니다.

Chariot과 관심 단백질의 복잡한 형성에는 약 40분이 걸립니다. 이러한 복합체로 세포를 transfection하는 데 70분이 소요되며 화물의 크기와 특성에 따라 1-4시간이 추가로 소요됩니다. 이 절차에 따라 단백질의 기능을 보다 자세히 분석하기 위해 라이브 이미징 및 운동성 분석, 분석 및 전기생리학적 기록과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.