July 23rd, 2015
이 프로토콜은 조직 또는 종양에서 ECM 단백질을 농축하고 ECM이 풍부한 제제를 펩타이드로 탈당화 및 분해하여 질량 분석법으로 단백질 구성을 분석하는 절차를 설명합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 질량 분석법으로 조직에서 세포외 기질의 구성을 특성화하는 것입니다. 이것은 먼저 선택된 조직이 완전히 균질화될 때까지 파괴함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 조직을 탈세포화하여 세포 외 기질 단백질을 농축하는 동시에 세포 내 구성 요소를 고갈
시키는 것입니다.다음으로, ECM 농축 단백질 샘플은 최종 단계에서 변성되고, 변성된 ECM 농축 단백질 샘플은 dec glycosylated 및 펩타이드로 분해됩니다. 서양 혈액 분석은 탈세포화 및 ECM 단백질 농축의 품질을 모니터링하는 데 사용됩니다. 궁극적으로, 펩티드의 질량 분석법에 의한 분석은 특정 조직에 대한 ECM 구성의 특성화를 허용합니다.
이 방법은 정상 조직의 세포외 기질 구성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 암과 같은 질병 조직과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 시작하려면 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 모든 버퍼를 준비합니다. 표 1, 프로테아제 억제제의 추가를 포함한다.
그런 다음 균일한 현탁액이 얻어질 때까지 조직 균질기로 500마이크로리터의 완충액 C에 있는 100mg의 조직을 파괴합니다. 균질액을 튜브 회전기로 옮기고 20분 동안 배양합니다: 섭씨 4도에서 파이프는 10-20마이크로리터의 샘플을 총 조직 추출물 또는 출발 물질 플래시로 표시된 튜브에 넣었습니다. 샘플을 액체 질소에 동결하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.
다음으로, 16, 000 번 G에서 균질산물을 섭씨 4도에서 20 분 동안 원심 분리한다. 깨끗한 튜브에 상층액을 모으고 세포질 또는 C 분획으로 표시합니다. 플래시. C 분율을 동결하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.
저기 피펫. 펠릿을 400마이크로리터의 버퍼 더블에 현탁시킨 다음 섭씨 4도에서 20분 동안 튜브 회전체에서 배양합니다. 다음으로, 샘플을 원심분리하고 상등액을 버리고 핵 단백질을 먼저 추출합니다.
펠릿을 150마이크로리터의 완충액 N에 재현탁시키고 섭씨 4도에서 30분 동안 튜브 회전체에서 배양합니다. 다음으로, 샘플을 원심분리하고 깨끗한 튜브에 상층액을 수집합니다. 원심주입 후 버퍼 N에서 배양을 반복합니다.
상등액을 결합하고 핵 또는 N 분획으로 표시합니다. 플래시. N 분수를 얼려 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 100 마이크로 리터의 버퍼 M을 추가하고 펠릿을 현탁시킵니다.
다음으로, 원심 분리하기 전에 섭씨 4도에서 30분 동안 튜브 로테이터에서 샘플을 배양합니다. 깨끗한 튜브에 상층액을 모으고 멤브레인 또는 M fraction flash로 표시합니다. M 분율을 동결하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.
격렬하게 피펫팅하여 펠릿을 200마이크로리터의 버퍼 CS에 다시 현탁시킨 다음 튜브 회전기에서 샘플을 30분 동안 배양합니다. 실온에서 실온에서 30분 동안 샘플을 원심분리하고 깨끗한 튜브에 상층액을 수집하고 세포골격계 또는 CS 분획으로 표시합니다. 이제 탄환이 눈에 띄게 작아졌습니다.
펠릿을 150 마이크로 리터의 완충액 C.Transfer에 현탁시키고 샘플을 튜브 회전기로 옮기고 섭씨 4도에서 20 분 동안 배양합니다. 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 수집합니다. 다음으로, 상층액을 이미 세포골격계 또는 CS 분획으로 표시된 튜브의 CS 버퍼의 상층액과 결합합니다. 플래시.
CS 분획을 동결하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 펠릿 resus를 세척하기 위해. 500마이크로리터의 PBS에 현탁시킨 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 튜브 회전판에서 배양합니다.
튜브를 원심분리하고 상층액을 버립니다. 총 세 번 세탁하십시오. ECM 강화 펠릿을 얻으려면 실험의 Western block QC 분석을 위해 ECM 분획의 작은 부분을 보관하십시오.
액체 질소에서 분획을 급속 동결하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 소화를 시작합니다. 먼저, ECM 농축 펠릿을 8 몰 요소에 다시 현탁시키고 Dihi 3 에톨 용액을 물에 첨가하여 10 밀리 몰의 최종 농도를 만듭니다.
튜브를 인큐베이터로 옮기고 섭씨 37도에서 2시간 동안 1400RPM으로 흔듭니다. 다음으로, 샘플을 실온으로 냉각하고 물에 재구성된 iota acetamide 용액을 최종 농도 25 millimolar까지 첨가합니다. 혼합물을 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.
실온에서 100 밀리몰 중탄산 암모늄으로 2 몰 요소 농도로 희석한 다음 P PGA F.Transfer를 첨가하여 샘플을 인큐베이터에 넣고 1400 RPM에서 2 시간 동안 흔듭니다. 섭씨 37도에서 엔도 프로테아제를 넣고 혼합물에 C를 얇게 썬 다음 섭씨 37도에서 2시간 동안 1400RPM으로 흔듭니다. 다음으로 트립신을 넣고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 1400RPM으로 흔듭니다.
하룻밤 동안 트립신의 두 번째 델리 쿼드에서 분해한 후 탁한 용액이 투명해지고 추가로 2시간 동안 흔들어 pH가 2 미만이 될 때까지 1마이크로리터 단위로 혼합물에 트립신 피펫 50%tri fluoro acetic acid를 비활성화해야 합니다. pH 종이에서 1마이크로리터의 펩타이드 용액을 찾아 pH를 모니터링합니다. 용액을 실온에서 5분 동안 원심분리합니다.
마지막으로 깨끗하고 유지력이 낮은 튜브에 상층액을 수집합니다. ECM 펩타이드 용액은 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 거울 폐 조직의 탈세포화로 인한 웨스턴 블롯은 중간 분획에서 ASIN, 베타 원, 액틴 GA, dh 및 히스톤과 같은 세포 내 구성 요소의 추출을 보여줍니다.
이러한 성분은 ECM 분획에서 거의 완전히 빠져 있지만 약간의 히스톤 오염이 남아 있습니다. 대조적으로, 콜라겐 1은 ECM 분획에서 고도로 농축되어 있지만 다른 분획에서는 검출되지 않는데, 이는 추출의 중간 단계에서 콜라겐이 손실되지 않음을 시사합니다. 인간 기억 암종(human memory carcinoma)에서도 유사한 결과가 얻어졌다.
이종이식 콜라겐 one은 ECM 분획에서 현저하게 농축되었으며 CS 분획에 대한 손실은 미미했습니다. 일부 잔류 액틴 오염은 개발 후 ECM 분획에 남아 있었습니다. 이 기술은 생물학자와 임상의가 정상 조직과 질병 조직의 세포 외 기질의 복잡성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
이 프로토콜은 조직에서 세포외 기질(ECM) 단백질을 농축하고 질량 분석을 사용하여 그 구성을 분석하는 방법을 설명합니다. 이 과정에는 조직 파괴, 세포 제거 및 상세한 분석을 위한 후속 펩타이드 소화가 포함됩니다.
Characterizing extracellular matrix (ECM) composition enables target validation and biomarker discovery in fibrosis, cancer, and cardiovascular diseases. This method supports mechanistic de-risking by isolating disease-relevant ECM proteins for downstream mass spectrometry analysis. It provides predictive confidence in target selection by linking ECM remodeling to pathological mechanisms.
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing ECM-specific molecular insights that inform early target prioritization.