뇌 조직에서 측정 세포 외 이온의 신호에 대한 두 번 질주과 동심 미소 전극

이 절차의 전반적인 목표는 뇌의 세포 외 공간에서 이온 역학을 감지하고 분석하는 것입니다. 조직. 이온 과도 측정은 이온 선택성 마이크로 전극을 사용하여 수행되며, 이는 이중 배럴 또는 동심 설계를 기반으로 준비할 수 있습니다. 첫 번째 단계로, 마이크로 전극은 실험조에서 보정됩니다.

그런 다음 전극을 급성 마우스 해마 절편에 삽입하여 세포 외 이온 이동을 유발하기 위해 기록하거나, 전달물질 글루타메이트를 유발하거나, 글루타메이트 작용제를 공급합니다. 글루타메이트는 시냅스후 척추에서 이온성 수용체와 결합하여 나트륨이 세포 안으로 유입되고 칼륨이 세포 밖으로 유입될 수 있도록 합니다. 궁극적으로 이는 세포 외 나트륨의 감소뿐만 아니라 이온 선택성 마이크로 전극에 의해 감지되는 세포 외 칼륨의 증가를 초래합니다.

이 방법은 뇌에서 세포 외 이온 조절 및 활동 유도 철 과도 현상을 연구하는 데 사용됩니다. 여기에서는 두 가지 유형의 이온 선택성 마이크로 전극의 준비 및 교정에 대해 설명합니다. 우리는 신경 전달 물질의 적용에 대한 반응으로 세포 외 칼륨 또는 나트륨의 변화를 측정하기 위해 급성 뇌 조직 절편에 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.

이 절차는 제 연구실을 위해 Nicole Hark와 Simon이 시연할 것입니다. 이 절차를 시작하려면 이온 감지 배럴에 사용할 필라멘트가 있는 버 실리케이트 유리 모세관을 준비하고 나중에 참조 배럴에 사용할 다른 모세관을 준비합니다. 다음으로, 두 개의 구성 요소 접착제 또는 작은 알루미늄 호일 스트립을 사용하여 양쪽 끝에서 긴 모세관과 짧은 모세관을 함께 고정합니다.

이중 모세관을 섭씨 60도의 용광로에서 1시간 동안 가열하여 잔여 수분을 제거합니다. 그 후, 리볼버 분필로 수직 풀러의 이중 모세관 중앙에 사용할 때까지 전극을 건조제에 보관하십시오. 모세혈관이 늘어나는 것을 방지하기 위해 분필을 사용하십시오.

유리가 리볼버의 수평 회전을 허용할 만큼 충분히 부드러워질 때까지 코일을 부드럽게 유지하십시오. 냉각 후 180도 척하고 기계적 틈을 제거하십시오. 두 번째 가열 프로토콜을 적용하여 모세관을 당겨 두 개의 날카로운 이중 배럴 모세관을 만듭니다.

이중 모세관의 팁 직경은 1미크론에 가까워야 합니다. 이제 집락화를 방지하기 위해 참조 배럴에 증류수를 끝까지 채우십시오. 다음 절차에서는 끝이 위로 향하게 하여 맞춤형 홀더에 이중 배럴 모세관을 놓습니다.

그런 다음 이 홀더를 사전 경고된 HMDS가 들어 있는 넓은 입 병에 놓고 70분 동안 배양합니다. 그런 다음 모세관을 금속 스탠드로 옮깁니다. 그 후, 예열된 용광로에 2시간 동안 넣어 집락화 후 두 배럴을 모두 건조시키고 사용할 때까지 모세관을 건조시킨 상태로 유지합니다.

실험 당일, 실리콘화된 배럴의 팁에 2-3마이크로리터의 이온 선택형 센서를 채워 이온 선택형 전극을 준비합니다. 그런 다음 나트륨에 민감한 마이크로 전극의 경우 100밀리몰의 염화나트륨으로 배럴을 채우거나 칼륨에 민감한 마이크로 전극의 경우 100밀리몰의 염화칼륨 식염수로 배럴을 다시 채웁니다. 이 절차를 수행하는 동안 추가 기포를 삽입하지 않도록 주의하십시오.

화가 성공하고 센서가 제대로 채워지면 센서 표면이 백필에 대해 명확하게 보이는 오목한 표면으로 나타나야 합니다. 그런 다음 기준 채널을 채운 다음 염소 처리된 은선을 두 배럴에 삽입하고 각 배럴을 치과용 왁스로 밀봉합니다. 이 절차에서는 수평 풀러에서 2mm 모세관을 당겨 짧은 테이퍼와 4미크론의 팁 직경을 만듭니다.

사용 직전에 실리콘화된 모세관에 0.2마이크로리터의 센서를 채웁니다. 내부 모세관을 준비하려면 작은 직경의 모세관을 당겨 긴 테이퍼와 날카로운 팁이 있는 두 개의 모세관을 만듭니다. 그런 다음 100 밀리몰 염화나트륨 또는 100 밀리몰 염화칼륨 식염수로 채웁니다.

채워진 센서와 식염수로 채워진 모세관을 커버 슬립으로 만든 맞춤형 빌드 스토퍼에 서로 직접 일직선으로 놓습니다. 더 작은 모세관을 더 큰 모세관에 부분적으로 삽입합니다. 그런 다음 모세혈관을 다른 커버 슬립에 고정합니다.

모델링 점토를 사용하여 모세혈관을 현미경 스테이지로 옮기고 100배 배율을 사용하여 시각화합니다. 마이크로 매니퓰레이터에 장착된 유리 막대를 사용하여 팁 사이의 거리가 약 5미크론이 될 때까지 외부 모세관을 내부 모세관 위로 천천히 전진시킵니다. 치과 용 왁스를 사용하여 외부 모세 혈관의 열린 끝을 내부 모세 혈관에 고정하고 은선을 삽입합니다.

기준 전극을 준비하려면 수직 풀러에서 필라멘트가 있는 모세관을 당기고 상단 피펫을 버린 다음 하단 척을 열고 하단 피펫을 약 5mm 들어 올립니다. 척을 다시 닫고 하부 전극의 끝이 가열 코일에서 약 5mm 위에 위치할 때까지 들어 올립니다. 그런 다음 코일을 가열하고 집게를 사용하여 팁을 측면으로 약 45도 구부립니다.

팁을 메인 샤프트와 평행하게 다시 향하게 하려면 약 영하 45도로 다시 구부립니다. 그런 다음 참조 배럴을 버퍼링된 식염수 더미로 채웁니다. 염소 처리된 은선을 삽입하고 치과용 왁스로 배럴을 밀봉합니다.

이 단계에서는 이온 민감성 전극과 기준 전극을 모두 마이크로 매니퓰레이터에 부착하고 A CSF 관류 실험 챔버로 낮춥니다. 실체 현미경 아래에서 염소 처리된 은선을 차동 증폭기의 헤드 스테이지의 각 입력에 연결합니다. 그런 다음 전극 저항을 결정합니다.

그런 다음 전압 신호를 0으로 조정하고 보정을 위해 녹음을 시작합니다. 안정적인 기준선을 얻은 후 측정할 이온의 정의된 농도를 포함하는 식염수로 전환합니다. 이제 250미크론 두께의 해마 조각을 실험실로 옮기고 그리드로 고정합니다.

보정된 이온 선택성 마이크로 전극을 슬라이스 표면으로 내립니다. 그런 다음 전극을 약 50미크론 더 CA 한 영역의 지층 라디에이터로 내립니다. 트랜스미터 작용제를 적용하려면 어플리케이션 피펫에 0.5 밀리몰 글루타메이트를 주입하십시오.

피펫을 마이크로 매니퓰레이터에 부착하고 압력 적용 장치에 연결합니다. 다음으로, 어플리케이션 피펫을 조직 안으로 내리고 이온 선택성 마이크로 전극의 끝 근처에 조심스럽게 놓습니다. 40mbar에서 압력 적용을 시작합니다.

여기에 표시된 것은 수조 나트륨 농도의 변화에 반응하여 이중 배럴 전극과 동심 전극의 기준 배럴의 전압 변화입니다. 그리고 이것들은 수조 나트륨 농도의 변화에 반응하여 이중 배럴 전극과 동심 전극의 나트륨 전위의 전압 변화입니다. 이 그림은 두 전극의 나트륨 전위 전압 대 수조 나트륨 농도의 절반 로그 플롯을 보여줍니다.

선형 플롯은 두 전극에 대해 약 48m볼트의 기울기를 보여줍니다. 다음은 수조의 빠른 변화에 대한 이중 배럴 및 동심 전극의 반응입니다. 나트륨 농도는 152 밀리 몰에서 70 밀리 몰입니다.

동심 전극의 응답 시간이 훨씬 더 빠릅니다. 이 그림은 이중 배럴 및 동심 전극에 의해 감지된 세포 외 나트륨 과도 현상, 기준 배럴의 전압 및 세포 외 나트륨 농도의 일시적인 변화를 보여줍니다. 그리고 이 그림에서 기준 배럴의 전압과 세포 외 나트륨 농도의 일시적인 변화는 0.2초 동안 10밀리몰의 글루타메이트로 국소 압력 가하에 의해 유도되었습니다.

이 조건에서 원뿔 전극의 응답 시간이 훨씬 더 빠릅니다. 이 절차를 시도하는 동안 적절한 침묵이 철 선택 마이크로 전극의 성공적인 생산의 핵심 단계라는 점을 명심하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 뇌 조직에서 일시적인 세포 외 철을 감지하기 위해 이러한 전극을 준비하고 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.