뇌 조직에서 측정 세포 외 이온의 신호에 대한 두 번 질주과 동심 미소 전극

이 절차의 전반적인 목표는 뇌 조직의 세포 외 공간에서 이온 동역학을 검출하고 분석하는 것입니다. 이온 일시 변화의 측정은 이중 배럴 또는 동심원 설계로 제작할 수 있는 이온 선택성 미세 전극을 사용하여 수행됩니다. 첫 번째 단계로, 미세 전극을 실험용 배스에서 교정합니다.

그런 다음, 전극을 급성 마우스 해마 슬라이스에 삽입하여 기록하며, 세포 외 이온 이동을 유도하기 위해 전달물질인 glutamate 또는 glutamate 작용제를 공급합니다. Glutamate가 시냅스 후 스파인(postsynaptic spines)의 이온성 수용체에 결합하여 이를 개방시키면, 세포 내로 나트륨이 유입되고 세포 외로 칼륨이 유출됩니다. 최종적으로 이는 세포 외 나트륨의 감소와 세포 외 칼륨의 증가를 초래하며, 이를 이온 선택성 미세 전극으로 검출합니다.

이 방법은 뇌의 세포 외 이온 조절과 활동 유발 철 과도 현상을 연구하는 데 사용됩니다. 본 문서에서는 두 가지 유형의 이온 선택성 미세 전극의 제작 및 보정 방법을 설명합니다. 또한, 신경전달물질 처리 시 세포 외 칼륨 또는 나트륨의 변화를 측정하기 위해 급성 뇌 조직 절편에 이 전극들을 어떻게 적용할 수 있는지 보여줍니다.

이 절차는 Nicole Hark와 Simon이 저의 실험실에서 시연할 것입니다. 이 절차를 시작하려면, 이온 감지 배럴로 사용할 필라멘트가 포함된 보어 실리케이트 유리 모세관과 나중에 참조 배럴로 사용할 또 다른 모세관을 준비하십시오. 다음으로, 2액형 접착제나 작은 알루미늄 호일 조각을 사용하여 긴 모세관과 짧은 모세관의 양쪽 끝을 함께 고정하십시오.

잔류 수분을 제거하기 위해 이중 모세관을 가열로에서 60 °C로 1시간 동안 가열합니다. 그 후, 사용 전까지 전극을 데시케이터에 보관하십시오. 리볼버 척이 장착된 수직 풀러의 중앙에 이중 모세관을 배치합니다. 모세관이 늘어나는 것을 방지하기 위해 척을 사용하십시오.

리볼버를 수평으로 회전시킬 수 있을 만큼 유리가 충분히 부드러워질 때까지 코일을 조심스럽게 유지하십시오. 냉각 후 180도 회전시켜 고정하고, 기계적 파손 장치를 제거하십시오. 두 번째 가열 프로토콜을 적용하여 모세관을 당겨 두 개의 날카로운 이중 배럴 모세관을 생성하십시오.

이중 모세관의 팁 직경은 1 µm에 가까워야 합니다. 이제 오염을 방지하기 위해 증류수를 사용하여 참조 배럴의 팁 끝까지 채웁니다. 다음 절차에서는, 이중 배럴 모세관의 팁이 위를 향하도록 맞춤 제작된 홀더 위에 배치합니다.

그런 다음 이 홀더를 미리 가온된 HMDS가 들어 있는 광구병 위에 놓고 70분 동안 배양합니다. 그 후 모세관을 금속 스탠드로 옮깁니다. 이어서 가열된 가마에 2시간 동안 넣어 코팅 후 양쪽 배럴을 건조시키고, 사용할 때까지 데시케이터 안에서 모세관을 건조 상태로 유지하십시오.

실험 당일에, 실리콘 처리된 배럴의 팁에 2~3 µL의 이온 선택성 센서를 채워 이온 선택성 전극을 준비합니다. 그런 다음 나트륨 민감성 미세 전극의 경우 100 mM 염화나트륨으로, 칼륨 민감성 미세 전극의 경우 100 mM 염화칼륨 식염수로 배럴을 역충전합니다. 이 과정에서 추가적인 공기 방울이 들어가지 않도록 주의하십시오.

전처리(ization)가 성공적으로 이루어지고 센서가 적절하게 채워졌다면, 센서 표면은 백필(backfill)을 배경으로 뚜렷하게 보이는 오목한 표면으로 나타나야 합니다. 다음으로, 참조 채널을 채운 뒤, 두 배럴 모두에 염화은 와이어를 삽입하고 각 배럴을 치과용 왁스로 밀봉합니다. 이 과정에서 수평 풀러(horizontal puller)를 사용하여 2 mm 모세관을 당겨 짧은 테이퍼와 4 µm의 팁 직경이 되도록 만듭니다.

사용 직전에 실리콘 처리된 모세관에 0.2 µL의 센서를 채웁니다. 내부 모세관을 준비하려면, 소구경 모세관을 당겨 테이퍼가 길고 팁이 날카로운 두 개의 모세관을 만듭니다. 그다지 100 mM 염화나트륨 또는 100 mM 염화칼륨 식염수를 채웁니다.

센서가 채워진 모세관과 식염수가 채워진 모세관을 커버슬립으로 제작된 맞춤형 스토퍼 위에 서로 일직선이 되도록 배치하십시오. 작은 모세관을 큰 모세관 내부로 부분적으로 삽입하십시오. 그 다음, 모세관들을 또 다른 커버슬립 위에 고정하십시오.

모델링 클레이를 사용하여 모세관을 현미경 스테이지로 옮기고 100배 배율로 관찰합니다. 마이크로 매니퓰레이터에 장착된 유리봉을 이용하여, 외부 모세관의 끝과 내부 모세관의 끝 사이의 거리가 약 5 µm가 될 때까지 외부 모세관을 내부 모세관 위로 천천히 전진시킵니다. 치과용 왁스를 사용하여 외부 모세관의 열린 끝을 내부 모세관에 고정하고 은선을 삽입합니다.

기준 전극을 준비하려면, 수직형 풀러(vertical puller)에서 필라멘트가 들어 있는 모세관을 당긴 후 상단 피펫은 버리고, 하단 척을 열어 하단 피펫을 약 5mm 들어 올립니다. 척을 다시 닫고 하단 전극의 팁이 가열 코일 위로 약 5mm 위치할 때까지 들어 올립니다. 이어서 코일을 가열하고 핀셋을 사용하여 팁을 측면으로 약 45도 굽힙니다.

팁이 메인 샤프트와 다시 평행하도록 약 -45도 방향으로 다시 구부립니다. 그 다음 기준 배럴을 HEPES 완충 식염수로 채웁니다. 여기에 염화은선을 삽입하고 치과용 왁스로 배럴을 밀봉합니다.

이 단계에서는 이온 민감 전극과 참조 전극 모두를 마이크로 조작기에 부착하고, A CSF가 관류되는 실험 챔버 내부로 내립니다. 실체 현미경 하에서 염화은 도선을 차동 증폭기 헤드 스테이지의 각 입력단에 연결합니다. 그 후 전극 저항을 측정합니다.

그 후, 전압 신호를 0으로 조정하고 캘리브레이션을 위한 기록을 시작합니다. 안정적인 베이스라인을 얻으면 측정 대상 이온이 정해진 농도로 포함된 식염수로 교체합니다. 이제, 250 micron 두께의 해마 슬라이스를 실험 챔버로 옮기고 그리드로 고정합니다.

보정된 이온 선택성 미세 전극을 슬라이스 표면으로 내립니다. 그다음 전극을 CA1 영역의 방사상층(stratum radiatum) 내로 약 50 microns 정도 더 내립니다. 신경전달물질 작용제를 처리하기 위해, 도포 피펫을 0.5 millimolar glutamate로 채웁니다.

피펫을 마이크로 조작기에 부착하고 압력 인가 장치에 연결합니다. 다음으로, 인가 피펫을 조직 내부로 내려 이온 선택성 미세 전극의 팁 근처에 조심스럽게 배치합니다. 40 millibars에서 압력 인가를 시작합니다.

여기에는 배스 나트륨 농도 변화에 따른 이중 배럴 전극과 동심 전극의 기준 배럴 전압 변화가 나타나 있습니다. 그리고 이는 배스 나트륨 농도 변화에 따른 이중 배럴 전극과 동심 전극의 나트륨 전위 전압 변화입니다. 이 그림은 두 전극의 배스 나트륨 농도와 나트륨 전위 전압의 관계를 나타낸 반로그 그래프입니다.

선형 그래프를 통해 두 전극 모두 약 48 millivolts의 기울기를 나타내는 것을 알 수 있습니다. 다음은 배양액의 급격한 변화, 즉 나트륨 농도가 152 millimolar에서 70 millimolar로 변화했을 때 이중 배럴 전극과 동심 전극의 반응입니다.

동심 전극의 응답 시간이 훨씬 더 빠르다는 점에 유의하십시오. 이 그림은 이중 배럴 전극과 동심 전극으로 검출한 세포 외 나트륨 과도 현상을 보여주며, 막대로 표시된 것과 같이 10 millimolar aspartate를 120초 동안 욕조 관류하여 기준 배럴의 전압과 세포 외 나트륨 농도의 일시적인 변화를 유도했습니다. 또한, 이 그림에서는 10 millimolar glutamate를 0.2초 동안 국소 압력 적용하여 기준 배럴의 전압과 세포 외 나트륨 농도의 일시적인 변화를 유도했습니다.

이 조건 하에서는 원추형 전극의 응답 시간이 상당히 더 빠르다는 점에 유의하십시오. 이 절차를 수행할 때, 적절한 연마(silent) 과정이 철 선택적 미세 전극을 성공적으로 제작하는 핵심 단계라는 점을 명심하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 뇌 조직 내 세포 외 철의 일시적 변화를 검출하기 위해 이러한 전극을 준비하고 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.