Name: 뇌 조직에서 측정 세포 외 이온의 신호에 대한 두 번 질주과 동심 미소 전극 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 배우세요 뇌 조직에서 이온 선택성 미세 전극을 이용하여 세포 외 나트륨 및 칼륨 이온 농도 변화를 측정하는 방법을. 글루타메이트 자극에 따른 이온 역학을 분석하여 신경 활동 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

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저자는 전문 기술 지원을 다 Roderigo을 감사드립니다. 우리는 비디오 제작에 도움을 S. 쾰러 (고급 이미징 센터, 하인리히 하이네 대학 뒤셀도르프를) 감사합니다. (MC에) R01NS032123를 부여합니다 (롬 2327 / 8-1 CRR에 DFG), (NH까지) 하인리히 하이네 대학 뒤셀도르프와 건강의 국립 연구소에 의해 저자의 실험실에서 연구는 독일 연구 협회에 의해 투자되고있다.

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저자는 경쟁 이해관계가 없음을 선언합니다.

액체 캐리어 기반이, 이온 선택성 전극이 성공적으로 수십 년 동안 많은 이온을 위해 사용되어왔다, 매우 구체적인 센서는 22 ~ 26 사용할 수 있습니다. ECS의 폭은 단지 약 20 내지 50 nm 인, 선택적 이온의 직경 인 동안 : 척추 뇌 제제의 세포 외 공간 (ECS)에서 사용되는 경우, 하나의 문제는 상당히 침습적 방법이 있다는 것이 유념해야 미소 전극은 약 1 ㎛ (더블 질주 전극) 이상 (동심 전극)입니다. 이온 선택성 미소 전극의 끝은 이렇게뿐만 아니라 조직의 자신의 꿰 뚫기 동안 조직을 손상시킬뿐만 아니라, 이온 과도의 과소 평가를 선호, ECS을 확대 할 것이다. 이 함정에도 불구하고, 신경 세포의 활동에 응답 세포 외 이온 과도은이 방법의 신뢰성을 입증 다른 실험실 7, 8, 사이 현저하게 일치한다. 이온 선택성 전극의 성능 및 적합성사용되는 센서 칵테일 ( &#39;액체 막 이온 운반체&#39;)에 의해 정의되는 자신의 감도와 선택도에 따라 달라집니다. 센서 칵테일 칼륨 (27)에 대한 높은 선택성을 나타내는 K + -selective 미소 전극을 위해 발리 노마 이신 (Valinomycin) 예를 들어, 특별한 캐리어 분자가 포함되어 있습니다. 에도 불구하고, 다른 이온과 교차 반응이 발생할 수 있으며, 테스트해야합니다. 발리 노마 이신 (Valinomycin)는 결과를 해석 할 때 고려되어야 암모늄 대한 상당한 교차 반응 (예, 11, 12)를 나타낸다. 이오 노 포어의 전압 응답 Nernstian 동작 (참조, 수학 식 1)을 따르기 때문에 또한, 신호 대 잡음비와 검출 임계 값이 측정되는 이온의 농도에 의존한다. 따라서, 동안 작은 [K +] 오 과도 과도 훨씬 더 어려운 인사에 대해 감지 할 수있는 O를 낮은 기준 [K +] 오, 작은 [나 +]에 대한 큰 전압 변화를 보여주고GH 기준 [나 +] O (참조 그림 5, 6). 이온 선택성 전극의 성능은 대부분의 전기 시정이 적용됩니다 시간적 해상도에 의해 결정된다. 후자는 주로 센서의 축 방향의 저항에 의해 결정되고, 내부 용액 및 외부 사이의 유체 피펫의 길이를 따라 분산 커패시턴스에 의해된다. 이중 목적 구성에서, 저항은 백필 이온 센서의 컬럼 길이로 인해 높다. (이 경우 붕규산 유리) 지정된 절연 유전체의 경우, 용량은 유전체 두께의 적용을받습니다. 이중 목적의 전극에서, 유전체층의 폭은 피펫의 유리 벽에 달한다. 유리 선단 부근 얇아 같이, 유전체 폭이 떨어지는 및 용량이 증가한다. 이러한 요인은 수백 밀리 초에서 몇 범위 응답 시간 전극을 생성하기 위해 결합초, 이러한 요인은 다양하다. 동심 설계의 주요 장점은 축 및 저항 욕 용량 모두 크게 감소된다는 것이다. 팁 전에 마지막 몇 마이크로 미터 만 남은 떠나는 채워서 이온 교환기의 저항의 대부분 동심 피펫 션트. 또한, 동심 피펫 내의 도금액 물리적 용량을 크게 줄일 수 개의 유리 벽의 두께에 의해 분리 조로부터 이격된다. (10) 이전에 도시 된 바와 같이, 감소 된 저항 및 커패시턴스의 결합 된 효과는, 2 차의 크기의 시간적 해상도의 향상이다. 동심 칼슘하여 pH 미소 전극의 경우 90 %의 응답 시간은 낮은 밀리 10-20 : 10이었다. 동심 디자인 관련 장점은 낮은 노이즈 레벨 (참조 그림 8)입니다. 어떤 수면제에서 크게 감소 저항에 전압 과도 때문에T 소음은 최소화된다. 또한, 이러한 과도로부터 회복하기 때문에 빠른 시간 상수, 빠르다. 이러한 유물 따라서 작고 빠른, 그리고 생리 학적 기록 (참조 그림 8)에 덜 파괴적인 영향을 미친다. 동심 기술의 단점도 있습니다. 우선, 이들 어셈블리는 더 복잡하고, 시간 소모적이다. 두 번째 단점은 별도의 micromanipulator 또는 특수한 이중 매니퓰레이터 하나의 사용을 수반하는 그 팁 별도 기준 미세 전극을 배치 할 필요가있다. 마지막으로, 이중 목적 미소 전극 동심 전극 용 불가능 동시에 28에서 두 개의 서로 다른 이온 종의 검출을 가능하게 트리플 질주 설계로 확장 될 수있다. 가장 일반적인 함정 비효율적 인 실란 화. 모든 액체 SENS의 제조에있어서 가장 중요한 공정 및 주요 장애물또는 기반 이온 선택적 미세 전극은 실란 화의 절차입니다. 전극이 특정 이온 농도의 변화에 반응, 또는 서브 Nernstian 응답 (10 배 농도의 차이에 따라, 즉, 58도 미만 MV)에 대응하지 않을 때, 실란 화의 불량한 효능은 일반적 원인이다. 대기 습도가 여름 또는 겨울의 높이에서 조건의 전형적인, 너무 높거나 너무 낮은 경우 우리의 경험에 의하면,이 각각 발생할 수 있습니다. 그것은 실내 습도 일부 제어 발휘 가능한 경우, 이러한 문제는 극복 할 수있다. 전극 저항이 너무 높다. 필요한 경우, 이온 성 배럴의 저항은 베벨함으로써 감소 될 수있다. 이를 위해 몇 초 동안 물에 현탁 연마제 강한 제트 선단을 노출. 이것은 그것의 최상의 팁 깨고 원하는 저항 값을 저하시킬 것이다. 소금 다리. 소금이온 및 참조 배럴 사이의 다리는 잘못 또는 없음 - 응답 전극을 초래할 따라서도 크게 교정에서의 성능을 혼동 할 수 있습니다. (포인트 1.6 참조.) 상술 한 바와 같이, 이는 이중 목적 세타 유리가 선택 문제는 주로하지만 여기에 설명 오프셋 꼬인 배럴 기법을 사용할 때 드문하다. 염두에두고 제작의 용이성과 함께, 럭스 (29)의 원래 더블 질주 디자인은 종종 유익하게 사용할 수 있습니다. 이 방법은 또한 팁을 통해, 이온 교환기의 도입에 의해 다음, 소금 솔루션, 끝에서의 흡입 및 퇴학으로 실란 솔루션을 빠르고 노출 이온 및 참조 배럴의 사전 충전을 활용 (30, 31 참조) . 이 전극은 약 10 분으로 제작하지만, 자신의 팁 크기는 일반적으로 4 ㎛ 이상을 그리고 그들은 실험 기간 동안 실패 할 경향이있다 할 수있다. 대조적으로, 그 방법은 실란 화 실란 증기 및 열에 대한 노출을 포함ING는 작은 일 마지막 팁, 때로는 주와 전극을 생성 할 수 있습니다. 함께 찍은 여러 프로토콜이있다 이온 선택성 미소 전극을 준비하는 방법에 접근한다. 여기, 우리는 가까운 100 %의 성공률로, 우리의 실험실에서 잘 안정적으로 작동 트위스트 질주 더블뿐만 아니라 동심 미소 전극의 제조를 위해 두 가지 방법을 설명했다. 중요한 것은, 이들 기술은 산도 또는 칼슘 이온을 포함하는 다른 종의 측정에 양도 할 것이며, 또한 일반적으로 유체로 채워진 캐비티 또는 체액을 포함한 뇌 이외의 제제에 적용 할 수있을 것이다. 마지막으로,하지만 적어도, 이온 선택성 미소 전극은 세포 내부의 이온 농도의 결정을 할 수 있습니다. 상대적으로 큰 팁 크기 (~ 1 ㎛)의 때문에,이 뜻은, 그러나, 무척추 준비 28, 32에서 발견 된 같은 단지 예를 들어 큰 세포체와 세포에서 가능하다.

An author's middle initial was omitted from the publication, <a href="http://www.jove.com/video/53058/double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue</a>. The author&#39;s name has been updated to:
Christine R. Rose
from:
Christine Rose

A correction was made to Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.

Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

뇌의 전기 신호는 원형질막을 가로지르는 이온의 흐름을 기반으로 합니다. 세포 외 공간으로의 주요 이온 이동은 전압 의존성 이온 채널을 통한 통과뿐만 아니라 시냅스후 이온성 수용체와 이온 수송체에 의해서도 매개됩니다. 따라서 뉴런 활동은 모든 주요 이온의 세포 외 농도의 복잡한 변화를 동반합니다 1. 예를 들어, 흥분 활동 중 뉴런으로 나트륨이 유입되면 세포 외 나트륨 농도([Na+]o)가 감소하는 것으로 나타났습니다 2. 세포 외 칼슘 농도에 대해서도 마찬가지인데, 칼슘 이온은 시냅스 전후 구조 모두에 빠르게 들어가기 때문입니다 3. 동시에 칼륨은 반대 방향으로 움직이며 이는 낮은 mM 범위 4,5에서 세포 외 칼륨 농도([K+]o)의 증가를 매개합니다. 시냅스 활성은 또한 세포 외 pH의 변화를 일으키며, 이는 신경교내 pH 6,7을 변화시키는 수반되는 신경교막 플럭스에 의해 부분적으로 완화됩니다. 이러한 세포 외 이온 농도의 활성 관련 변화는 중요한 기능적 결과를 초래합니다. 예를 들어, [K+]o가 조금만 증가해도 신경교세포뿐만 아니라 뉴런도 탈분극되어 뉴런 흥분성을 변화시키며, 과도한 칼륨 8을 제거하는 몇 가지 메커니즘이 존재합니다. 이러한 현상이 실패하면 뉴런의 간질 활동이 발생하거나 우울증이 퍼지는 것과 같은 현상이 발생할 수 있다 1. 
세포외 이온 농도의 정량적 측정은 생리학적 및 병태생리학적 조건에서 신경망의 기능과 기능 장애를 이해하는 데 매우 중요하기 때문에 종종 필요하고 필요합니다. 수십 년 동안 이중 배럴 이온 선택성 미세 전극은 뇌 조직에서 이러한 측정을 위한 탁월한 도구임이 입증되었습니다 9. 많은 이온의 경우, 다른 이온에 대한 낮은 교차 반응성을 가진 매우 특이적인 센서를 사용할 수 있습니다. 고전적인 이중 배럴 전극 외에도 소위 동심 전극이 최근에 도입되었습니다. 후자는 우수한 시간 해상도를 제공하지만 10을 구성하는 데 조금 더 많은 시간과 노력이 필요합니다. 
다음에서는 이 두 가지 유형의 이온 선택성 미세 전극의 준비 및 보정에 대해 설명합니다. 그런 다음 약물의 목욕 및 압력 적용을 포함한 다양한 자극 패러다임에 따라 흥분 활동에 의해 유도된 [K+]o 또는 [Na+]o의 변화를 측정하기 위해 이러한 전극을 뇌 절편 준비에 사용할 수 있는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>연마제&nbsp; &nbsp;</td><td>마이크로폴리쉬&nbsp;</td><td>Buehler GmbH</td><td>Dest</td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>1405059</td><td>Hilgenberg</td><td>응용 프로그램 피펫에 용해됨; 75 mm x 2 mm, 벽 두께 0.3 mm</td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관 필라멘트</td><td>GC 150 F-15&nbsp;</td><td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td><td>이중 배럴 미세 전극 센서용&nbsp;</td></tr><tr><td>필라멘트가 있는 보로실리케이트 유리 모세관</td><td>GC100-F-15</td><td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td><td>이중 배럴 미세전극 참조용&nbsp;</td></tr><tr><td>필라멘트가 있는 보로실리케이트 유리 모세관</td><td>GB-200TF-15&nbsp;</td><td>과학 제품</td><td>동심, 외부 채널. O.D. 2.0 mm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>필라멘트가 있는 붕규산 유리 모세관</td><td>GB-120TF-10</td><td>Science Products</td><td>동심, 내부 채널. O.D. 1.2 mm</td></tr><tr><td>Digidata</td><td>1322A</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>전위계 증폭기 헤드스테이지</td><td></td><td>맞춤형</td><td>Rin = 10 T&Omega; 및 Ibias=50 fA-1pA (상업적으로 이용 가능&nbsp; 대안: 예: Dagan IX2-700, 헤드스테이지 (10 Gig 피드백 저항기) 또는 EPMS-07, NPI, Tamm, Germany)</td></tr><tr><td>실험용 챔버</td><td></td><td>맞춤형</td><td>상업적으로 이용 가능한 예: &nbsp; 워너 인스트루먼트, 미국; &nbsp; Scientifica, 영국</td></tr><tr><td>용광로</td><td></td><td>헤레우스는</td><td>200 &deg에서 일정하게 유지되어야 합니다. C</td></tr><tr><td>하드 스티키 왁스 / 치과 왁스&nbsp;</td><td>데이버릿 502&nbsp;</td><td>Siladent 박사 Boehme & Schoeps GmbH</td><td></td></tr><tr><td>핫 플레이트</td><td></td><td>맞춤 제작</td><td>40°C에서 일정하게 유지되어야 합니다. </td></tr><tr><td>C 플렉시글라스</td><td></td>로 만든 미세 전극 홀더 <td>맞춤형</td><td>더블 배럴: O.D. &nbsp; 모세관 1.5mm, 동심원: O.D.&nbsp; 모세관 2 mm</td></tr><tr><td>마이크로매니퓰레이터</td><td></td><td>Leitz</td><td></td></tr><tr><td>마이크로매니퓰레이터</td><td>MD4R</td><td>라이카</td><td></td></tr><tr><td>스테레오 현미경</td><td>M205C</td><td>라이카</td><td></td></tr><tr><td>목표</td><td>계획 0.8xLWD</td><td>라이카</td><td></td></tr><tr><td>피펫 풀러</td><td>모델 PP-830</td><td>Narishige</td><td>동심원 마이크로전극&nbsp;</td></tr><tr><td>피펫 풀러</td><td>모델 P-97</td><td>셔터 기기&nbsp;</td><td>동심원 미세 전극의 센서&nbsp;</td></tr><tr><td>공압 약물 배출 시스템</td><td>Picospritzter Type II</td><td>General Valve TM Corporation</td><td></td></tr><tr><td>여행용 더브테일 스테이지</td><td>DT 25/M</td><td>Thorlabs</td><td></td></tr><tr><td>두 구성 요소 접착제</td><td>&nbsp; Araldite</td><td>Huntsman advanced materials GmbH</td><td>하나는 또한 작은 알루미늄 호일을 사용하여 모세혈관을 함께 붙일 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>실버와이어</td><td>99.9%&nbsp;</td><td>Wieland Edelmetalle</td><td></td></tr><tr><td>슬라이서 / Vibratome</td><td>Microm HM 650 V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어</td><td>AxoScope 8.1&nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>수직 풀러&nbsp;</td><td>PE-2</td><td>Narishige Scientific Instruments</td><td>용 회전 척 포함&nbsp; 이중 배럴 미세 전극</td></tr><tr><td>x / y 번역 단계</td><td></td><td>맞춤형</td><td></td></tr><tr><td>1 (S), 9 (R) - (&마이너스;)-Bicuculline methiodide</td><td>Sigma aldrich</td><td>14343</td><td>GABAA 수용체의 경쟁 길항제(감광성); 주의 독성</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>시그마 알드리치</td><td>C-127</td><td>AMPA / kainate 수용체 길항제; 주의 독성</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>시그마 알드리치</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>알파 Aesar</td><td>J64210</td><td>NMDA 수용체 길항제; 주의 독성</td></tr><tr><td>헥사메틸디실라잔 (HMDS)</td><td>시그마 알드리치</td><td>440191</td><td>주의: 가연성, 급성 독성(경구, 피부, 흡입) 및 금속 및 피부 부식성</td></tr><tr><td>L-아스파르트산 시</td><td>그마 알드리치</td><td>A9256</td><td>NMDA 및 비-NMDA 및 EAAT를 활성화</td></tr><tr><td>L-글루탐산 모노소듐 염 수화물</td><td>시그마 알드리치</td><td>G1626</td><td>NMDA-R, AMPA-R, QA-R 및 KA-R),&nbsp; mGluR 및 EAAT를 활성화합니다.</td></tr><tr><td>칼륨 이오노포어 I - 칵테일 B</td><td>Fluka&nbsp;</td><td>60403</td><td>발리노마이신 기준; 주의 독성</td></tr><tr><td>나트륨 이오노포어 II - 칵테일 A</td><td>Fluka&nbsp; &nbsp;</td><td>71178</td><td>ETH 157</td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>전압 의존성 Na+ 채널 억제제를 기반으로 합니다. 주의 독성</td></tr><tr><td>물, 초순수</td><td>시그마 알드리치</td><td>W3500&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

뇌 조직에서 측정 세포 외 이온의 신호에 대한 두 번 질주과 동심 미소 전극

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

뇌의 전기 활동은 막을 가로지르는 상당한 이온 플럭스를 동반하여 모든 주요 이온의 세포 외 농도에 복잡한 변화를 일으킵니다. 이러한 이온 이동은 중대한 기능적 결과를 낳기 때문에 생리학적 및 병태생리학적 조건에서 신경망의 기능과 기능 장애를 이해하기 위해 정량적 결정이 필요한 경우가 많습니다. 본 연구에서는 뇌 조직에서 이러한 측정을 위한 탁월한 도구로 입증된 이중 배럴 이온 선택성 미세 전극의 제조 및 보정을 보여줍니다. 또한, 소위 "동심원" 이온 선택성 미세전극도 설명되며, 이는 서로 다른 설계를 기반으로 빠른 이온 변화에 대해 훨씬 더 나은 시간적 분해능을 제공합니다. 그런 다음 이러한 전극이 마우스 해마의 급성 뇌 절편 준비에 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 이중 배럴, 칼륨 선택성 미세 전극을 사용하여 글루타메이트 수용체 작용제의 외인성 적용에 대한 반응 또는 간질 활성 중 세포 외 칼륨 농도([K+]o)의 변화를 입증합니다. 또한, 나트륨에 민감한 전극, 이중 배럴 전극 및 동심원 전극의 반응 특성을 설명하고 약물의 목욕 또는 압력 적용에 의해 유발되는 세포 외 나트륨 농도([Na+]o)의 변화 감지를 비교합니다. 이러한 측정은 응답 진폭이 비슷하지만 동심원 나트륨 미세 전극이 이중 배럴 설계에 비해 우수한 신호 대 잡음비와 응답 시간을 나타낸다는 것을 보여줍니다. 일반적으로 입증된 절차는 pH 또는 칼슘을 포함한 다른 이온 종의 측정으로 쉽게 전환할 수 있으며 다른 제제에도 적용할 수 있습니다.

<html> 모니터링하려면 [K +]는 O 및 변경은 내부에 흥분성 활동에 대한 응답으로, 이중 질주 칼륨 선택적 미세 전극은 CA1 영역의 지층 radiatum에 삽입되었다. 몇 분 꿰 뚫기 후에 전극의 이온 선택 배럴은 약 2.8 mm의 사용 ACSF의 [K +]에 가까운 값 (아 [K +]에 대응하는, 안정한 기준선 (도 7a)에 도달 2.5 mm)이다. 10 초 동안 0.5 mM의 글루타메이트의 목욕 응용 프로그램은 ~ 0.7 밀리미터 (그림 7A)에 달하는 기준선 아래 언더 다음, 약 4 mm 정도 O를 [K +]에서 가역적 인 증가를 유도. 0.4, 0.3 글루타메이트 농도를 낮추고, 0.2 mm의 일시적 증가 [K +] 오 (그림 7A)에 언더 모두의 진폭에 대응 감소를 일으키는 원인이되었다. OAD / 53058 / 53058fig7.jpg &quot;/&gt; 그림 흥분성 활동에 응답 7. 세포 외 칼륨 과도. (A) [K +] 오 과도, 지시 된 바와 같이 10 초 동안 글루타메이트의 서로 다른 농도의 목욕 응용 프로그램에 의해 유도 된 기준 아래 언더 다음의 증가, 구성. (B) 글루타메이트 수용체 차단제와 관류의 영향 (CNQX, 100 μM, APV, 100 μM)과 테트로도톡신 (TTX 0.5 μM) [K +] O 과도에 10 초 동안 0.5 mM의 글루타메이트의 목욕 응용 프로그램에 의해 유도. 0Mg 2+ / BIC의 존재 (C) 자발적인 [K +] 오 과도. AC에 표시된 실험은 두 번 질주 전극을 사용하여 수행 하였다. 그림을 위해, 흔적 Sawitzky - 골 레이 필터 (폭 20)와 함께 부드럽게했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig7large.jpg" target="_blank">카스티하세요</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 ICK. 이전 실험은 글루타메이트에 의한 [K +] O 신호가 크게 TTX의 응용 프로그램 중 변경되지 것을 보여, 따라서 전압 문이 나트륨 채널과 신경 활동 전위 세대 (15, 16)의 개방에 거의 독립적있다. 글루타메이트에 반응하여 관찰 된 [K +] O 변화를 기본 메커니즘을 연구하기 위해, 우리는 글루타메이트 수용체 차단제, 즉 CNQX (100 μM; AMPA 수용체 차단제) 적용 및 APV를 (100 μM; NMDA 수용체 차단제)의 존재하에 TTX (0.5 μM). (도 7B 예를 들어, 17)이 차단제 목욕 관류시, 글루타메이트에 의한 [K +] 변화 o를하기 전에보고 된 이온 성 글루타메이트 수용체 채널의 개방에 대한 의존도를 확인, 사실상 폐지했다. 더 T를 보여주기 위해세포의 생성을위한 글루타메이트 여기의 그는 관련성 [K +] 신호, 조각은 명목상의 Mg 2+ - 무료 식염수 10 μm의 bicuculline의 메티 (0Mg 2+ / BIC)를 포함하여 관류 하였다. 이는 NMDA 수용체의 전압 의존성의 Mg 2+ - 블록을 완화하고 (예 : 18,19) 네트워크에서 자발적인 간질 재발 활동을 일으키는, GABA 수용체를 차단함으로써 억제를 감쇠시킨다. 예상대로 20, 자연, 재발 [K +] 오 과도, 약 1.5 밀리미터에 달하는이 0Mg 2+ / BIC 식염수 (그림 7C)에서 검출되었다. 약 0.2의 평균 진폭이 응답 사이의 작은 [K +] 오 과도 전월 (그림 7C)를 발생했습니다. 제 2 세트의 실험에서는, 도포에 의해 유발 [나 +] O 변화를 결정하기 위해 [나 +] 민감한 미소 전극을 사용글루타민산 작용제. 여기, 우리는 두 개의 서로 다른 응용 프로그램의 패러다임을 사용하는 더블 질주과 동심 미소 전극의 응답 특성을 비교 하​​였다. [나 +]는 민감한 미소 전극은 약 50 μm의 깊이의 지층 radiatum에 위치했다. 안정한 기준선을 달성 한 후, 글루타메이트 작용제 L 아스파라긴산은 (2.5 ㎖ / 분으로 10 mm의 120 초, 목욕 관류) 목욕 관류 당 도포 하였다. 이전 21 관찰, 아스 파르 테이트의 응용 프로그램은 약 5 분을 지속 한 후베이스 라인에 다시 (그림 8A)를 복구하기 시작 약 15 밀리미터에 의해 O를 [나 +]에 느린 감소를 일으키는 원인이되었다. 양 전극에 의해 결정 [나 +] O 신호의 피크 진폭과 동력학은 이들 조건 하에서 거의 동일했다하면서 특히, 동심 전극보다 안정한 기준선 및 낮은 잡음 레벨 (도 8a)를 나타냈다. R을 테스트하려면<html> 더 빠른 애플리케이션 패러다임에서 다른 전극의 특성을 저 응답, 우리는 이온 선택적 미세 전극의 끝에서 20 ~ 40 ㎛의 거리에서 지층 radiatum에 위치 미세 유리 피펫을 통해 글루타메이트를-인가 압력. (21) 예상대로, 200 MS에 대한 글루타메이트의 응용 프로그램 (10 mM)을 [나 +] O (그림 8B)의 저하를 일으키는 원인이되었다. [나 +] O 감소의 피크 진폭이 전극의 두 가지 유형에 대해 동일한 범위에 있었다 (:; : 19.1 밀리미터, N = 15 - - 2.0 동심 13.5 밀리미터, N = 14 4.5을 두 번 질주). 그러나, 느린 목욕 관류 (위 참조), 신호 대 잡음비, 또한 전극의 두 가지에 의해 검출 [나 +] O 신호의 시간 경로뿐만 얻어진 결과와 대조적 크게 달랐다. 피크 평균 시간은 동심 미소 전극의 질주 - 더블, 1.3 초 3.5 초였다. ve_content &quot;&gt; 따라서, 이러한 결과를 보여 주 및 대 동심을 두 번 질주 나 + -selective 미소 전극의 빠른 반응 속도론을 확인, (참조 그림 6C 및도 8b)으로는 CA의 유명했다 2+ pH를 선택적 대응 (10) . 짧은 버스트 시냅스 자극이 빠른 시냅스에 의한 이온 과도를 연상하기 위해 수행되었던 이전의 연구와는 달리, 단지 경향이 있지만, 우리의 응용 프로그램과 동심을 두 번 질주 전극 사이의 평균 피크 진폭에서 유의 한 차이가 있었다 패러다임. 이는 사실에 아마이었다 그 결과적으로 두 개 (20 ~ 40 μm의)의 인자에 의해 변경 이온 선택 미세 전극의 팁으로부터 애플리케이션 피펫의 거리, 즉 타깃 영역에서 최대 글루타메이트 농도 피크 진폭의 기존 차를 막고, 다른 실험에서 같은 아니었다. (가) 위쪽 추적 : 볼타의 변화를이중 질주 전극 (검은 색 점선 추적)와 욕조 나 + 농도의 변화에 따라 동심 전극 (회색 추적)의 기준 배럴 (V 심판)의 GE ([나 +는] b)에 나타낸 바와 같이. 양 전극의 전압 응답 사실상 동일하다. 바닥 흔적 : 이중 질주 전극 (블랙 추적)와 [나 +] B 변화에 대응 동심 전극 (회색 추적)의 나 + -potential (V 나 +)의 전압의 변화. 양 전극의 V 나 + 대 B (B) [나 +]의 하프 로그 플롯. 데이터의 선형 그래프는 양 전극에 대한 약 48 MV의 기울기를 알 수있다. 70 밀리미터에 152 밀리미터에서 B를 두 번 질주 (블랙 추적)의 V 나 +의 (C) 응답하고, [나 +]의 빠른 변화에 동심 전극 (회색 추적). 동심 전극의 응답 시간이 크게 FAS 유의터. 예시를 위해, 트레이스 Sawitzky - 골 레이 필터와 평활화 된 (폭 20). <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/53058/53058fig8.jpg" /> 그림 8 : 두 번 질주와 동심 전극에 의해 검출 된 세포 외 나트륨 과도. (A) 과도 V 심판의 변화와 [나 +] 막대로 나타낸 바와 같이 O 120 초 동안 10 mM의 아스 파르 테이트 목욕 관류에 의해 유도. 상단 트레이스는 이중 질주 전극 수행 기록, 낮은 흔적 동심 전극을 사용하여 기록 하였다 보여준다. (B)에 화살표로 표시된 바와 같이 0.2 초 동안 10 mM의 글루타메이트 현지 압력 응용 ​​프로그램에 의해 유도 O를 V 심판와 [나 +]에 과도 변경됩니다. 상단 트레이스는 이중 질주 전극 수행 기록, 낮은 흔적 동심 전극을 사용하여 기록 하였다 보여준다.빨간 점선 라인은 최대로 신호의 시작 사이의 시간 선형 발작을 나타낸다. 동심 전극의 응답 시간이이 조건에서 상당히 빠르다는 것을주의. 그림을 위해, 흔적 Sawitzky - 골 레이 필터 (폭 20)와 함께 부드럽게했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 뇌 조직의 이온 농도 측정을 위한 두 가지 유형의 이온 선택성 미세 전극(이중 배럴 및 동심원)의 제조, 보정 및 특성을 보여줍니다. 그런 다음 이들은 쥐 해마 절편 준비에 사용되어 흥분 활동이 세포 외 칼륨과 나트륨 농도를 모두 변화시킨다는 것을 보여줍니다.

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

이 절차의 전반적인 목표는 뇌 조직의 세포 외 공간에서 이온 동역학을 검출하고 분석하는 것입니다. 이온 일시 변화의 측정은 이중 배럴 또는 동심원 설계로 제작할 수 있는 이온 선택성 미세 전극을 사용하여 수행됩니다. 첫 번째 단계로, 미세 전극을 실험용 배스에서 교정합니다.그런 다음, 전극을 급성 마우스 해마 슬라이스에 삽입하여 기록하며, 세포 외 이온 이동을 유도하기 위해 전달물질인 glutamate 또는 glutamate 작용제를 공급합니다. Glutamate가 시냅스 후 스파인(postsynaptic spines)의 이온성 수용체에 결합하여 이를 개방시키면, 세포 내로 나트륨이 유입되고 세포 외로 칼륨이 유출됩니다. 최종적으로 이는 세포 외 나트륨의 감소와 세포 외 칼륨의 증가를 초래하며, 이를 이온 선택성 미세 전극으로 검출합니다.이 방법은 뇌의 세포 외 이온 조절과 활동 유발 철 과도 현상을 연구하는 데 사용됩니다. 본 문서에서는 두 가지 유형의 이온 선택성 미세 전극의 제작 및 보정 방법을 설명합니다. 또한, 신경전달물질 처리 시 세포 외 칼륨 또는 나트륨의 변화를 측정하기 위해 급성 뇌 조직 절편에 이 전극들을 어떻게 적용할 수 있는지 보여줍니다.이 절차는 Nicole Hark와 Simon이 저의 실험실에서 시연할 것입니다. 이 절차를 시작하려면, 이온 감지 배럴로 사용할 필라멘트가 포함된 보어 실리케이트 유리 모세관과 나중에 참조 배럴로 사용할 또 다른 모세관을 준비하십시오. 다음으로, 2액형 접착제나 작은 알루미늄 호일 조각을 사용하여 긴 모세관과 짧은 모세관의 양쪽 끝을 함께 고정하십시오.잔류 수분을 제거하기 위해 이중 모세관을 가열로에서 60 °C로 1시간 동안 가열합니다. 그 후, 사용 전까지 전극을 데시케이터에 보관하십시오. 리볼버 척이 장착된 수직 풀러의 중앙에 이중 모세관을 배치합니다. 모세관이 늘어나는 것을 방지하기 위해 척을 사용하십시오.리볼버를 수평으로 회전시킬 수 있을 만큼 유리가 충분히 부드러워질 때까지 코일을 조심스럽게 유지하십시오. 냉각 후 180도 회전시켜 고정하고, 기계적 파손 장치를 제거하십시오. 두 번째 가열 프로토콜을 적용하여 모세관을 당겨 두 개의 날카로운 이중 배럴 모세관을 생성하십시오.이중 모세관의 팁 직경은 1 µm에 가까워야 합니다. 이제 오염을 방지하기 위해 증류수를 사용하여 참조 배럴의 팁 끝까지 채웁니다. 다음 절차에서는, 이중 배럴 모세관의 팁이 위를 향하도록 맞춤 제작된 홀더 위에 배치합니다.그런 다음 이 홀더를 미리 가온된 HMDS가 들어 있는 광구병 위에 놓고 70분 동안 배양합니다. 그 후 모세관을 금속 스탠드로 옮깁니다. 이어서 가열된 가마에 2시간 동안 넣어 코팅 후 양쪽 배럴을 건조시키고, 사용할 때까지 데시케이터 안에서 모세관을 건조 상태로 유지하십시오.실험 당일에, 실리콘 처리된 배럴의 팁에 2~3 µL의 이온 선택성 센서를 채워 이온 선택성 전극을 준비합니다. 그런 다음 나트륨 민감성 미세 전극의 경우 100 mM 염화나트륨으로, 칼륨 민감성 미세 전극의 경우 100 mM 염화칼륨 식염수로 배럴을 역충전합니다. 이 과정에서 추가적인 공기 방울이 들어가지 않도록 주의하십시오.전처리(ization)가 성공적으로 이루어지고 센서가 적절하게 채워졌다면, 센서 표면은 백필(backfill)을 배경으로 뚜렷하게 보이는 오목한 표면으로 나타나야 합니다. 다음으로, 참조 채널을 채운 뒤, 두 배럴 모두에 염화은 와이어를 삽입하고 각 배럴을 치과용 왁스로 밀봉합니다. 이 과정에서 수평 풀러(horizontal puller)를 사용하여 2 mm 모세관을 당겨 짧은 테이퍼와 4 µm의 팁 직경이 되도록 만듭니다.사용 직전에 실리콘 처리된 모세관에 0.2 µL의 센서를 채웁니다. 내부 모세관을 준비하려면, 소구경 모세관을 당겨 테이퍼가 길고 팁이 날카로운 두 개의 모세관을 만듭니다. 그다지 100 mM 염화나트륨 또는 100 mM 염화칼륨 식염수를 채웁니다.센서가 채워진 모세관과 식염수가 채워진 모세관을 커버슬립으로 제작된 맞춤형 스토퍼 위에 서로 일직선이 되도록 배치하십시오. 작은 모세관을 큰 모세관 내부로 부분적으로 삽입하십시오. 그 다음, 모세관들을 또 다른 커버슬립 위에 고정하십시오.모델링 클레이를 사용하여 모세관을 현미경 스테이지로 옮기고 100배 배율로 관찰합니다. 마이크로 매니퓰레이터에 장착된 유리봉을 이용하여, 외부 모세관의 끝과 내부 모세관의 끝 사이의 거리가 약 5 µm가 될 때까지 외부 모세관을 내부 모세관 위로 천천히 전진시킵니다. 치과용 왁스를 사용하여 외부 모세관의 열린 끝을 내부 모세관에 고정하고 은선을 삽입합니다.기준 전극을 준비하려면, 수직형 풀러(vertical puller)에서 필라멘트가 들어 있는 모세관을 당긴 후 상단 피펫은 버리고, 하단 척을 열어 하단 피펫을 약 5mm 들어 올립니다. 척을 다시 닫고 하단 전극의 팁이 가열 코일 위로 약 5mm 위치할 때까지 들어 올립니다. 이어서 코일을 가열하고 핀셋을 사용하여 팁을 측면으로 약 45도 굽힙니다.팁이 메인 샤프트와 다시 평행하도록 약 -45도 방향으로 다시 구부립니다. 그 다음 기준 배럴을 HEPES 완충 식염수로 채웁니다. 여기에 염화은선을 삽입하고 치과용 왁스로 배럴을 밀봉합니다.이 단계에서는 이온 민감 전극과 참조 전극 모두를 마이크로 조작기에 부착하고, A CSF가 관류되는 실험 챔버 내부로 내립니다. 실체 현미경 하에서 염화은 도선을 차동 증폭기 헤드 스테이지의 각 입력단에 연결합니다. 그 후 전극 저항을 측정합니다.그 후, 전압 신호를 0으로 조정하고 캘리브레이션을 위한 기록을 시작합니다. 안정적인 베이스라인을 얻으면 측정 대상 이온이 정해진 농도로 포함된 식염수로 교체합니다. 이제, 250 micron 두께의 해마 슬라이스를 실험 챔버로 옮기고 그리드로 고정합니다.보정된 이온 선택성 미세 전극을 슬라이스 표면으로 내립니다. 그다음 전극을 CA1 영역의 방사상층(stratum radiatum) 내로 약 50 microns 정도 더 내립니다. 신경전달물질 작용제를 처리하기 위해, 도포 피펫을 0.5 millimolar glutamate로 채웁니다.피펫을 마이크로 조작기에 부착하고 압력 인가 장치에 연결합니다. 다음으로, 인가 피펫을 조직 내부로 내려 이온 선택성 미세 전극의 팁 근처에 조심스럽게 배치합니다. 40 millibars에서 압력 인가를 시작합니다.여기에는 배스 나트륨 농도 변화에 따른 이중 배럴 전극과 동심 전극의 기준 배럴 전압 변화가 나타나 있습니다. 그리고 이는 배스 나트륨 농도 변화에 따른 이중 배럴 전극과 동심 전극의 나트륨 전위 전압 변화입니다. 이 그림은 두 전극의 배스 나트륨 농도와 나트륨 전위 전압의 관계를 나타낸 반로그 그래프입니다.선형 그래프를 통해 두 전극 모두 약 48 millivolts의 기울기를 나타내는 것을 알 수 있습니다. 다음은 배양액의 급격한 변화, 즉 나트륨 농도가 152 millimolar에서 70 millimolar로 변화했을 때 이중 배럴 전극과 동심 전극의 반응입니다.동심 전극의 응답 시간이 훨씬 더 빠르다는 점에 유의하십시오. 이 그림은 이중 배럴 전극과 동심 전극으로 검출한 세포 외 나트륨 과도 현상을 보여주며, 막대로 표시된 것과 같이 10 millimolar aspartate를 120초 동안 욕조 관류하여 기준 배럴의 전압과 세포 외 나트륨 농도의 일시적인 변화를 유도했습니다. 또한, 이 그림에서는 10 millimolar glutamate를 0.2초 동안 국소 압력 적용하여 기준 배럴의 전압과 세포 외 나트륨 농도의 일시적인 변화를 유도했습니다.이 조건 하에서는 원추형 전극의 응답 시간이 상당히 더 빠르다는 점에 유의하십시오. 이 절차를 수행할 때, 적절한 연마(silent) 과정이 철 선택적 미세 전극을 성공적으로 제작하는 핵심 단계라는 점을 명심하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 뇌 조직 내 세포 외 철의 일시적 변화를 검출하기 위해 이러한 전극을 준비하고 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

세포 중 신경 agonists과 antagonists의...

에 대한 Multibarrel 전극을 제조 및 꽃돼지 - 다시 사용<em&gt; 생체에</em신경 응답&gt; 약리 노는

이 동영상은 이온 선택성 및 이온 영동 미세전극을 사용하여 전기 신호를 측정하고 비교함으로써 뇌 절편의 세포 외 공간을 특성화하는 방법을 보여줍니다. 이 프로세스는 공간의 부피 분율과 비틀림 정도를 결정하는 데 도움이 됩니다.

Ion-Selective and Iontophoresis microelectrodes를 사용한 뇌 절편의 세포외 공간 특성화

여기에서는 약물의 미세 주입에 의한 뇌 심부 구조 억제와 동시 전기 생리학적 기록을 통한 실시간 모니터링이라는 두 가지 기능을 가진 유리 피펫을 제작합니다.

동시 전기 생리 녹화 및 설치류의 뇌에서 억제 에이전트의 마이크로 주사

세포막의 수송체는 세포막 또는 세포층을 가로질러 이온을 차등적으로 분리할 수 있으며 조직 생리학, 복구 및 병리학에서 중요한 역할을 합니다. 우리는 생체 내에서 단일 세포 및 조직에서 특정 이온 플럭스를 측정할 수 있는 이온 선택적 자체 참조 미세전극에 대해 설명합니다.

이온 선택적 자체 참조 미세 전극 기술을 이용하여 세포 외 이온 플럭스 측정

깨어 있는 쥐의 기록 부위 부근에서 세포 외 신경 활동을 동시에 기록하고 여러 신경 활성 물질을 방출하는 전극 구성 방법을 제시합니다. 이 기술을 사용하면 관심 있는 뉴런에 대한 추정 국소 시냅스 입력값을 자세히 분석할 수 있습니다.

깨어 마우스의 신경 활성 물질의 Microiontophoretic 응용 프로그램과 결합하여 신경 활동의 세포 외 기록

칼륨 이온은 세포의 휴식 막 잠재력에 기여 하 고 extracellular K+ 농도 세포 흥분의 중요 한 레 귤 레이 터 이다. 우리가 확인 하 고, 보정 하 고 monopolar K+를 사용 하는 방법을 설명-선택 microelectrodes. 같은 전극을 사용 하 여 성인 hippocampal 조각 전기 evoked K+ 농도 역학 측정 수 있습니다.

만들기, 테스트 및 성인 뇌의 조직 조각에 칼륨 이온 선택적 Microelectrodes를 사용 하 여

여기, vivo에서 microdialysis 뇌 파 기록 함께에서 간 질 및 간 질 비 쥐의 복 부 해 마에 aspartate 및 조미료 자료를 분석 하는 방법을 설명 합니다. Extracellular 농도 aspartate 및 조미료의 질병의 다른 단계와 상관 될 수 있습니다.

자유롭게 이동 하는 쥐에서 뇌 파 기록 하는 동안 흥분 성의 아미노산의 Microdialysis

이 프로토콜 신경 문화에 활동 전위 전송 공부에 대 한 미세 장치 microelectrode 배열 시험관에서 결합 하는 방법을 설명 하는 것을 목표로. 데이터 분석, 즉 탐지 및 전파 하는 활동 전위의 특성은 수행을 사용 하 여 새로운 고급, 아직 사용자 친화적이 고 자유롭게 사용할 수, 계산 도구.

Microelectrode 배열 마이크로 신경 통신 및 Axonal 신호 전파 공부에 대 한 인터페이스

이 프로토콜은 여러 뇌 영역에서마우스(Mus musculus)및 페렛(무스텔라퍼토리우스 후로)의 만성 및 급성 생체 내 전기 생리학적 기록을 위한 탄소 섬유 미세 전기 전극 어레이를 구성하는 절차를 설명합니다. 미전지어 어레이 이식에 대한 원시 탄소 섬유를 구입한 후 각 단계는 미세 전기 전하 배열 구조에 중점을 두고 자세히 설명됩니다.

만성 및 급성 생체 내 기록을 위한 탄소 섬유 미세 전하 배열의 구성 및 구현

본 프로토콜은 다수의 뇌 구조로부터 생체 내 국소 장 전위를 동시에 기록하기 위해 맞춤 제작된 마이크로전극 어레이의 구축을 기술한다.

여러 뇌 구조에서 동시에 생체 내 녹음을위한 로컬 필드 잠재적 인 미세 전극 구축

밀리미터 크기의 코일과 결합된 저비용 뇌파 기록 시스템은 생체 내에서 마우스 뇌의 경두개 자기 자극을 유도하기 위해 제안되었습니다. 맞춤형의 유연한 다중 전극 어레이 기판이 있는 기존의 나사 전극을 사용하여 경두개 자기 자극에 대한 반응으로 마우스 뇌에서 다중 부위 기록을 수행할 수 있습니다.

생체 내에서 마우스 뇌를 경두개로 자극하기 위해 밀리미터 크기의 코일과 결합된 저비용 뇌파 기록 시스템

배우세요 뇌 조직에서 이온 선택성 미세 전극을 이용하여 세포 외 나트륨 및 칼륨 이온 농도 변화를 측정하는 방법을. 글루타메이트 자극에 따른 이온 역학을 분석하여 신경 활동 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

뇌 조직에서 측정 세포 외 이온의 신호에 대한 두 번 질주과 동심 미소 전극

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