생성 및 펄스 저주파 초음파의 정량 분석​​은 종 양성 세포를 치료하지의 소닉 감도를 결정하고 치료합니다

다음 실험의 전반적인 목표는 콜레스테롤 고갈제의 존재 또는 부재 하에서 펄스 저주파 초음파가 인간 백혈병 세포 집단에 손상을 주는 효능과 재현성을 평가하는 것입니다. 이는 초음파 처리 시스템을 세척하고 그 안정성을 평가함으로써 달성됩니다. 이후 methyl beta cyclodextrin의 존재 및 부재 하에서 인간 백혈병 세포를 초음파 처리합니다.

다음으로, 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 생존율과 초음파 처리 및 콜레스테롤 고갈의 효과를 평가합니다. 백혈병 세포의 미토콘드리아 활성은 XTT 분석법을 통해 평가합니다. 최종적으로, 본 데이터는 저주파 초음파가 악성 세포를 손상시키는 데 사용될 수 있으며, 콜레스테롤 고갈제를 사용함으로써 그 효과가 증폭될 수 있음을 시사합니다.

본 연구실은 초음파의 항종양 효과와 초음파의 효과를 증폭시키는 특수 제제를 결합한 새로운 치료 방식인 소노남프(sonar namp) 치료에 관심을 두고 있습니다. 본 프로토콜에서는 종양 세포와 정상 세포 모두의 소닉 감수성을 평가하여, 추가적인 전임상 연구가 필요한 잠재적인 소노 화학요법 접근 방식을 결정합니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 소노 시스템의 안정성을 평가하는 데 사용되는 장비를 다루는 데 어려움을 겪을 수 있으며, 해당 장치들을 최적으로 적용하는 방법을 익히는 데 어느 정도 시간이 걸릴 수 있습니다.

세척 및 안정화 절차는 초음파 처리 시스템을 평가하는 데 필수적이며, 재현성 있는 결과를 얻기 위해 매우 중요하므로 이 방법에 대한 시각적 시연이 중요합니다. 실험을 시작하기 전, 클로로포름과 면봉을 사용하여 혼(horn)과 컨버터(converter) 사이의 연결 부위를 세척하십시오. 그다음, 혼과 컨버터의 나사산에 가벼운 오일을 도포하십시오.

금속 파편, 녹 또는 산화물 축적물을 추가로 제거한 후, 더 많은 클로로포름을 사용하여 유니온에서 오일 및 기타 오염 물질을 제거하고 혼(horn)을 컨버터에 다시 부착합니다. 시스템의 토크를 적절하게 조절하려면, 컵 바닥에서 혼을 당겨 빼내고 컨버터 상단 근처의 세 개의 작은 구멍 중 하나에 슬롯 렌치를 끼웁니다. 이제 1/2인치 크로우풋(crow's foot)이 장착된 토크 렌치를 혼의 슬롯 부분에 맞추고, 토크 미터의 수치가 39.99 foot pounds가 될 때까지 표준 시계 방향으로 조입니다.

조인 후, 컨버터와 혼을 컵에 다시 맞추고 각 부품을 링 스탠드에 수직으로 장착하며, 컨버터를 전원 공급 장치에 다시 연결한 다음 시스템을 펄스 투여(pulse dosing) 모드로 설정합니다. 펄스 간격을 1초로 하여 1초 동안 초음파 처리를 수행하고, 시스템을 원하는 진폭으로 조정하여 sauna Fire 시스템의 강도와 기능을 평가합니다. 먼저 공동 현상 측정기(cavitation meter)를 1.5 cm 거리에 두고, 측정기 프로브 표면에 기포가 없는지 주의하며 측정을 시작하십시오.

캐비테이션 측정기 화면을 읽어 시스템이 적절한 강도로 작동하고 있는지 확인하십시오. 다음으로, 12.5 milliliters의 물이 담긴 샘플 바이알에 하이드로폰 센서를 완전히 담그고, 링 스탠드를 사용하여 하이드로폰을 매달아 고정하십시오. 파형 특성의 안정성을 확인하기 위해 하이드로폰을 오실로스코프의 입력단에 연결하고 뚜렷한 사인파가 나타나는지 확인하십시오. 비정상적인 파형은 시스템의 주파수를 변화시킬 수 있기 때문입니다.

초음파 처리를 위해 세포를 준비하려면, 우선 신선하게 제조된 배지를 사용하여 25 square centimeter 플라스크에 mL당 4 × 10⁴개의 세포를 분주합니다. 트립판 블루 배제법으로 생존 세포 수를 확인한 후, 배양이 원하는 농도에 도달할 때까지 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 세포가 초음파 처리를 위한 준비가 되면, 진공 펌프와 뷰흐너 플라스크를 사용하여 일정량의 탈이온 증류수를 탈기합니다.

그 다음, 물을 사용하여 컵 혼의 상단으로부터 15 millimeters 높이까지 채웁니다. 탈기된 물(Degas water)을 사용하여 시스템을 약 7분 동안 가동합니다. 이어서 3 milliliters의 세포를 20 milliliter 유리 신틸레이션 바이알에 옮기고, 바이알을 고정 장치에 연결합니다.

다음으로, 고정 장치를 컵 혼 상단에 부착하고 슬라이딩 메커니즘을 사용하여 수면 기준 혼 상단으로부터 15 millimeters 높이에 고정 장치를 설정합니다. 이제 33 및 50% 진폭에서 1초 간격으로 1초 동안 3회의 초음파 펄스를 가하여 세포를 초음파 처리하고, trypan blue 배제법을 통해 초음파 처리 후의 세포 생존율을 평가합니다. 세포 손상을 평가하기 위해, Z two 입자 분석기의 구경을 등장성 식염수로 최소 2회 세척합니다.

다음으로, 초음파 처리된 세포 100 µL를 20 mL의 등장성 식염수에 넣고, 세포 샘플을 카운터 홀더로 옮깁니다. 그런 다음 플랫폼을 구경까지 올리고 제조업체의 지침에 따라 세포 손상, 생존율 및 파편을 분석합니다. XTT 분석을 통해 초음파 처리된 세포의 생존율을 평가하려면, 1에서 3 사이의 범위로 세포를 초음파 처리하십시오.

XTT 키트로 평가할 다양한 수준의 손상을 유도하기 위해 1초 간격으로 1초 펄스를 가한 후, 세포를 원심 분리하고 펠렛을 갓 준비한 배양액에 1×10⁵ cells/mL 농도로 재현탁합니다. 다음으로, 개별 평底 96웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 100 µL의 세포를 분주하며, 바탕값 흡광도 측정을 위해 완전 배양액만 100 µL 포함된 대조군 웰 3개를 포함하여 3반복으로 준비합니다.

분석 당일 아침에 세포를 24시간 동안 배양하고, 37 °C로 가온된 XTT 및 활성화 시약 분주액을 용액이 투명해질 때까지 부드럽게 소용돌이치듯 섞어줍니다. 그런 다음, XTT 시약 5 mL에 활성화 시약 0.1 mL를 첨가합니다. 다음으로, 활성화된 XTT 용액 50 µL를 U 9 37 및 THP one이 접종된 플레이트의 각 웰에 첨가하고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 다시 옮깁니다.

2시간 후에 플레이트를 가볍게 흔들어 양성 웰의 오렌지색 염료를 고르게 분산시킨 다음, 마이크로타이터 플레이트 리더를 사용하여 450에서 500 nm 사이의 흡광도를 측정합니다. 마지막으로, 모든 분석 웰의 흡광도를 630에서 690 nm 사이에서 다시 측정합니다. 예상한 바와 같이, 33% 진폭보다 50% 진폭에서 초음파 처리된 세포군에서 더 광범위한 세포 손상이 관찰됩니다.

그러나 33%의 진폭은 약물을 처리했을 때 추가적인 손상을 검출할 수 있게 합니다. 본 실험에서는 콜레스테롤 고갈제인 methyl beta cyclodextrin의 용량 의존적 효과가 U 9 37 세포의 초음파 민감도를 어떻게 증폭시키는지 평가하였습니다.

methyl beta cyclodextrin을 처리하지 않은 세포의 생존율은 처리하지 않은 대조군 세포와 유사했으나, 40 kHz의 초음파를 1초 간격으로 3회 조사한 후에는 생존율이 현저히 감소하였습니다. 또한, XTT 분석 결과, 콜레스테롤 고갈제인 methyl beta cyclodextrin을 5 mM 처리했을 때 세포 수가 가장 크게 감소했으며, 1 mM과 0.5 mM 처리 순으로 감소하여 초음파 조사 후의 생존율 감소는 농도 의존적인 것으로 나타났습니다. THP-1 세포가 U937 세포보다 초음파에 약간 더 저항성이 있는 것으로 보였으나, 두 인간 백혈병 세포주 모두 농도 의존적인 방식으로 손상되었습니다.

또한, 더 높은 농도의 methyl beta cyclodextrin과 더 많은 횟수의 초음파 펄스를 결합했을 때 U 9 37 및 THP one 세포 모두에서 XTT가 수용성인 밝은 주황색 유도체로 환원되는 정도가 가장 낮았으며, 이는 두 세포주 모두에서 세포 생존력과 미토콘드리아 활성이 더 낮음을 나타냅니다. 이 절차 이후, 세포골격 표적제 또는 반응성 산소종 생성제와 같은 다른 음파 감작제를 사용하여 음파 민감도 증강 효과를 평가함으로써, 전임상 효능을 조사할 수 있는 새로운 치료적 접근법을 수립할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, TC 및 Z two 카운터에서 획득한 SON 데이터를 적절하게 정리하는 것이 중요합니다. 해당 데이터는 치료 프로토콜의 효능에 대한 상세한 정보를 제공하며, 정리하지 않을 경우 이를 분실할 수 있기 때문입니다.

물류 체계가 사용되지 않은 경우, 이 영상을 시청한 후에는 전임상 in vitro 모델에서 잠재적 아노 감작제와 저주파 초음파를 병용하여 그 치료적 유용성을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.