압축 된 콜라겐에 다진 조직 : 단일 무대 재건 복구를위한 세포 함유 Biotransplant

다음 절차의 전반적인 목표는 재건 수술 중 조직 확장을 위해 자가 조직을 이식하는 것입니다. 이는 먼저 관심 조직에서 생검 조직을 채취함으로써 수행됩니다. 그다음, 생검 조직을 잘게 다져 플라스틱 압축 폴리카프로락톤(polycapro-lactone, PCL) 콜라겐 자가 이식편을 제작합니다.

그 다음 PCL과 자가 다진 조직을 통합하여 3D 스캐폴드를 제작합니다. 본 실험에서는 1:6의 확장 비율을 사용하였습니다. 이후, 스캐폴드를 피험자에게 다시 이식합니다.

최종적으로, 자가 이식된 조직의 재생은 스캐폴드와 세절된 조직 입자 내 세포의 증식 및 재구성에 대한 면역조직화학 분석을 통해 평가할 수 있습니다. 이 방법은 동물 모델, 피부 및 요로상피에서 시연될 것입니다. 이 기술의 함의는 심각하게 기형인 조직의 치료나 외상 후 수술적 복구에 필요한 조직이 심각하게 부족한 경우의 치료로 확장됩니다.

in vitro 배양과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 단일 단계의 수술 절차로 수행할 수 있다는 점입니다. 조직 채취부터 이식까지의 모든 단계가 무균 상태에서 수행되어야 하므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 돼지 방광 생검 표본을 얻으려면, 먼저 포셉으로 방광을 잡고 멸균된 줄자를 사용하여 조직의 크기를 측정하십시오.

다음으로, 멸균된 펜을 사용하여 2x1 cm 크기의 타원형 생검 부위를 표시하고, 1~6배의 확장률을 목표로 합니다. 그런 다음, 메스로 표시된 조직을 절제하고, 멸균 조건 하에서 방광 생검 검체를 DMEM에 넣습니다. 피부 생검 검체를 채취하려면, 더마톰(dermatome)을 사용하여 0.3 mm 두께의 부분 층 검체를 채취합니다.

그런 다음, 조직을 DMEM에 넣고 상처 부위를 드레싱으로 덮습니다. 다음으로, 방광 생검 조직을 DMEM으로 두 번 세척하고, 점막이 위를 향하도록 하여 멸균된 해부 플레이트로 조직을 옮깁니다. 해부 핀을 사용하여 검체의 한쪽 면을 플레이트에 고정하고, 미세 가위와 포셉을 사용하여 점막 조직을 배뇨근으로부터 분리합니다.

그 다음, 점막 위에 다지기 도구를 놓고 조직의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝까지 수직 및 수평으로 움직여 0.8 by 0.8 millimeter 크기의 다져진 조직 조각을 얻습니다. 이때 다지기 도구를 조직 위에서 움직이는 동안 조직을 눌러줘야 함에 유의하십시오. 플라스틱 압축 콜라겐 자가이식편을 준비하려면, 먼저 배지가 진한 노란색에서 분홍색으로 변할 때까지 collagen type I이 보충된 10X DMEM에 일반 수산화나트륨을 한 방울씩 첨가합니다.

pH가 7.4에서 8 사이임을 확인한 후, DMEM 2 mL를 용액에 조심스럽게 섞습니다. 그런 다음, 약 2 mL의 콜라겐을 20x30x10 mm 강철 직사각형 몰드의 웰에 분주하고 10분 동안 배양합니다. 콜라겐이 굳으면, 젤화된 콜라겐 위에 적정 부피의 PCL 생체 재료를 얹고 그 위에 남은 6 mL의 콜라겐을 붓습니다.

몰드를 인큐베이터에 넣고 20분 동안 더 배양합니다. 그다음, 멸균된 표면 위에 거즈 패드를 두껍게 쌓습니다. 그 위에 400 micron 두께의 스테인리스 스틸 메쉬를 올리고, 이어서 110 micron 두께의 나일론 메쉬 시트를 덮습니다.

콜라겐 겔을 나일론 메쉬 위로 조심스럽게 옮기고 직사각형 강철 몰드를 주의해서 제거합니다. 잘게 다진 조직을 콜라겐 위로 옮깁니다. 이때 1:6의 확장 비율을 목표로 합니다.

그 다음, 콜라겐 겔과 조직 위에 새로운 나일론 메쉬 층을 얹고, 나일론 메쉬 위에 두 번째 스틸 메쉬를 올린 후, 최소 120 g 무게의 로딩 플레이트를 배치합니다. 5분 후, 자가이식물에서 무게추, 스틸 메쉬 및 나일론을 제거합니다. 자가이식물의 인비트로(in vitro) 배양을 위해서는, 먼저 얇아진 구조체를 12웰 플레이트에 들어갈 수 있을 만큼 작은 조각으로 자릅니다.

그 다음, 각 웰에 각질세포 배지 1 mL를 첨가하고 조직을 3~6주 동안 배양합니다. 잘게 다진 방광 점막 자가이식편을 돼지 방광에 이식하려면, DMEM으로 이식편을 적십니다. 그 후, 미세한 연속 단사 봉합사를 사용하여 구성물을 건강한 조직에 이식합니다.

유치 도뇨관을 통해 방광에 식염수를 채워 이식편의 수밀성을 확인합니다. 잘게 다진 피부 표피가 포함된 자가이식편을 전층 피부 상처에 이식하려면, DMEM으로 이식편을 적십니다. 그런 다음 자가이식편의 모서리와 중앙 부분에 단속 봉합을 사용하여 구조물을 피부 전층 상처 바닥에 부착합니다.

마지막으로, 상처 부위를 플라스틱 드레싱으로 덮어 습윤 상태를 유지합니다. 다져진 피부 자가이식 이미지에서 관찰되는 바와 같이, 복합 바이오그라프트는 파지, 봉합 및 외과적 조작을 견딜 수 있습니다. 인 비트로(in vitro) 배양 중 서로 다른 시점에서 실시한 면역조직화학 분석 결과, 세포가 증식하고 이동하며 세포 표현형의 전형적인 미세구조를 가진 연속적인 상피로 재구성됨을 알 수 있습니다.

예를 들어, 2주 차에 피부 자가이식편 표면의 세포층은 두께가 약 2층입니다. 오른쪽의 방광 상피는 동일한 배양 기간 후 약 8층의 두께를 나타냅니다. 5~6주 후에는 잘게 다진 피부 상피와 잘게 다진 방광 점막 자가이식편 모두에서 연속적인 상피층의 두께가 약 8~10층이 됩니다.

인비트로(in vitro) 조직 확장과 비교하여, 이 방법은 속도가 빠르고 노동력이 덜 소요되며 정교한 실험실 자원이 필요하지 않습니다. 또한, 모든 부품이 FDA 승인을 받았으므로 표준 수술 환경에서 사용이 가능합니다. 이 절차를 수행할 때는 겔, 생체 이식물 및 자가 조직을 멸균 상태에서 준비하는 것이 중요합니다.

이 절차와 더불어 세포의 in vitro 배양과 같은 다른 방법들을 수행함으로써 세포 증식 및 분화에 관한 추가적인 질문들에 답할 수 있습니다. 이 기술이 발전되면 재생 의학 분야의 연구자들에게 새로운 길을 열어줄 수 있을 것입니다. 이러한 수단을 통해 자가 조직 공학 이식편으로 피부나 비뇨기 계통의 심각한 기형을 치료할 수 있을 것입니다.