Name: 앞으로 유전 접근은 마우스의 스트레스 저항성 유전자를 밝히기 위해서 - ES 세포에서 높은 처리량 화면 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 40 s
Description: 배우세요 마우스 ES 세포를 이용한 고처리량 스트레스 저항성 유전자 선별 방법으로 노화 및 수명 연구에 활용할 수 있는 유전자 기능을 규명합니다.

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우리는 piggyBac transposon과 piggyBac transposase의 선물에 대해 Wellcome Trust Sanger Institute에 감사드립니다. 이 작업은 콜로라도의 Butcher 보조금과 NIH R01 AG041801(W.S.C)의 지원을 받았습니다.

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저자는 공개할 것이 없습니다.

순방향 유전자 분석을 통해 특정 표현형을 담당하는 유전자에 대한 게놈을 편견 없이 조사할 수 있습니다. 이 방법은 새로운 유전자 기능을 밝히는 데 매우 강력합니다. 이는 하등 유기체에서는 널리 사용되었지만 쥐와 같은 포유류에서는 주로 인프라 및 물류와 관련된 비용이 매우 높기 때문에 사용되지 않았습니다. 여기에서 우리는 유전자 스크리닝 프로세스를 ES 세포 배양 플랫폼으로 옮겨 돌연변이 생성 및 돌연변이 식별의 효율성과 처리량을 크게 높였습니다. 
내성 돌연변이를 효과적으로 선택하려면 모든 야생형 세포가 사멸되도록 치사량의 스트레스 요인과 치료 기간을 설정해야 합니다. 선택의 엄격함이 높을수록 오탐 발생이 줄어듭니다. 섬유아세포 피더는 ES 세포보다 산화 스트레스에 대한 내성이 더 높습니다. 피더의 존재는 스트레스 요인에 의해 죽을 근처의 ES 세포를 구출할 것입니다. 따라서 스트레스 선택 중 피더를 생략하는 것은 효과적인 사멸을 위해 매우 중요했습니다. 피부 섬유...

장수 스트레스 저항과 친밀한 관계를 가지고있다. 일반적으로, 수명이 긴 종들은 과산화수소, 파라콰트 (PQ), UV, 열, 중금속 1,2- 여러 스트레스쪽으로 저항을 증가 보여준다. 대조적으로, 스트레스 증가 감도 짧아 수명 및 / 또는 더 발생하기 쉬운 질환 표현형을 예측하는 경향이있다. 항산화 소기 경로가 긴 동물에게 스트레스 저항성을 부여하는데 중요한 역할을하는 것으로 추측하고있다. 그러나, 거의 예외없이, 다양한 항산화 제 효소 (예를 들면, SOD)의 조작과 형질 전환 동물의 다양한 연구가 산화제 소거 효소의 수준을 증가 시키면 수명 또는 건강 스팬 3을 증가시키지 않음을 나타낸다. 이러한 데이터는 지속적으로 수명이 긴 동물에서 관찰 된 스트레스 저항 특성이 아직 발견되는 다른 세포 경로에 의해 매개되는 것이 좋습니다. 우리는 편견 전달했다방법은 돌연변이 유전자에 배양 배아 줄기 (ES) 세포에서 스트레스 내성 표현형을 부여 할 수있는 유전자를 동정을 행 하였다. ES 세포는이 연구에서 두 가지 장점을 제공한다 : (1) 유전자 정교한 조작이 ES 세포의 게놈을 수정은 가능하다; 및 (2) 스크린으로부터 회수 스트레스 내성 ES 세포는 직접 수명 및 건강 범위를 측정하기 위해 전체 동물 연구에 신속한 변환을 허용 마우스 생산에 사용될 수있다. 이보고에서는, 대립 유전자가 BLM 테트라 사이클린 반응성 소자에 의해 제어 된 C9에 ES 세포주의 사용을 설명했다. 독시 싸이클린 (D​​OX)의 치료는 일시적으로 자매 염색 분체 교환의 증가 사고로 이어지는 BLM의 발현을 해제. 이 단기적으로는 BLM 노크 아웃 이질 집단 내에서 동형 접합 돌연변이의 생성을 허용 스트레스 저항 열성 돌연변이가 심사 과정에서 캡처 할 수 있도록. 우리또한 무작위 게놈에서 유전자 돌연변이 폴리 트랩 카세트 (PB-UPA)를 삽입 돌연변이로 피기 백 (PB) 트랜스포존의 사용을 설명했다. 폴리 트랩에 의해 유전자의 파괴와 세포 G418 내성이되었고, 유전자 트랩 돌연변이 (유전자 트랩 라이브러리)의 컬렉션을 만들고, 이후에 강한 스트레스했다 돌연변이 클론 상영 될 수 있도록 복구 할 수 있습니다. 선택으로부터 회수 스트레스 내성 클론 삽입의 수 (qPCR에)의 점에서, 분자의 기술에 의해 다소 빠르게 특성화 될 수 삽입 사이트 (splinkerette PCR), 파쇄 유전자 (BLAST)의 신원, 및 그 발현 량 ( RT-qPCR에). PB 삽입은 야생형 DNA 서열을 복원하고, 따라서 응력의 저항 손실을 테스트 할 클론의 MPB 트랜스의 일시적 발현으로 remobilized 될 수있다. 이들은 이전에 수행해야 돌연변이의 인과 관계를 확인하는 강력한 방법이다비싼 마우스 생산. 이전의 연구는 스트레스에 노출 된 세포가 만능의 4,5을 잃은 것으로 나타났다. 따라서,이 프로토콜에서, 스트레스로 처리되지 않는다 돌연변이 세포의 집합 복제, 보존 성공적인 마우스 생산에 중요하다. 우리 연구소는 모두 요청에 따라 다른 연구자가 사용할 수있는, C9 ES 세포 라인과 PB-UPA 벡터를 설계하고있다. 여기에보고 된 프로토콜은 스트레스 내성 클론 (그림 1B)를 분리하기 위해 복제 도금과 스트레스의 선택에 따라 PB-UPA (그림 1A)와 유전자 갇혀 ES 세포의 드 노보 라이브러리의 생성에 의해 시작됩니다. 우리는 파라콰트, 세포 내부의 강력한 활성 산소 발생기 선택을 보여 주었다. 사실상, 예를 들어 임의의 세포 독성 화합물 또는 독소, ER 스트레스 요인 (예, 및 쌥시 가르 긴 tunicamycin), 신경 세포의 산화제 (예를 들어, MPP +, 6- 히드 록시 도파민 및 로테 논), 열, 또는 무거운금속 (예를 들면, CD, SE는) 각각 내성 돌연변이 체에 대해 선택하는 방법에 적용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Vector</td></tr><tr><td>PB-UPA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mPBase</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mPBasePuro<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Tissue Culture</td></tr><tr><td>500-ml Stericup 필터</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>250-ml Stericup 필터</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>50ml Steriflip-GV 필터</td><td>EMD Millipore</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>KO DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>조직 배양 생물학제</td><td>104</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135-500</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential Amino Acids</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>메틸 바이올로겐 디클로라이드 ( 파라콰트)</td><td>시그마-알드리치</td><td>856177</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드 Hybri-MAX</td><td>시그마-알드리치</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMAX 0.1% 젤라틴</td><td>EMD Millipore</td><td>ES006B</td><td></td></tr><tr><td>DPBS/Modified</td><td>HyClone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>T25 플라스크</td><td>코닝</td><td>353108</td><td></td></tr><tr><td>T75 플라스크</td><td>Corning</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>100-mm&nbsp; 플레이트</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>150-mm&nbsp; 플레이트</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>96-well&nbsp;</td><td>플레이트 Corning</td><td>3585</td><td></td></tr><tr><td>96-well U-바닥 플레이트</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>24-well 플레이트</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>50ml 리저브&nbsp;</td><td>Corning</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>15-ml 튜브</td><td>VWR International, LLC</td><td>82050-276</td><td></td></tr><tr><td>주요 마우스 배아 섬유아세포</td><td>EMD Millipore</td><td>PMEF-NL</td><td></td></tr><tr><td>DR4 마우스 배아 섬유아세포</td><td>적용 StemCell</td><td>ASF-1001</td><td></td></tr><tr><td>미토마이신 C</td><td>피셔 생물시약&nbsp;</td><td></td><td></td>BP25312</tr><tr><td>Geneticin (G418)</td><td>Life Technologies</td><td>11811-023</td><td></td></tr><tr><td>독시사이클린</td><td>피셔 바이오 시약&nbsp;</td><td></td><td></td>BP26531</tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5702</td><td></td></tr><tr><td>TC10 cell counter</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Counting Slides (for TC10)</td><td>Bio-Rad</td><td>1450011</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Electroporation</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell</td><td>Bio-Rad</td><td>1652611</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Cuvettes (4&#160; mm 갭)</td><td>Bio-Rad</td><td>1652088</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Molecular Biology</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Eppendorf</td><td>Mastercylcer ep Gradient&nbsp; S</td><td></td></tr><tr><td>Puregene 코어 키트 B</td><td>Qiagen</td><td>158745</td><td></td></tr><tr><td>Topo-TA 복제 키트</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>450030</td><td></td></tr><tr><td>고용량 cDNA 합성 키트</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher BioReagents&nbsp;</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>100% 에탄올</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>이중 가공 조직 배양수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>Sau3A1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0169L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England BioLabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">96-well lysis buffer (Ramires-Solis et al. 1992)</ 강력한></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>피셔 바이오 시약&nbsp;</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5777</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Fisher BioReagents&nbsp;</td><td>BP1700</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Electrophoresis</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4469EDU</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose&nbsp;</td><td>GeneMate</td><td>E3120500</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드&nbsp;</td><td>피셔 바이오 시약&nbsp;</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>100 BP DNA 사다리</td><td>뉴잉글랜드 BioLabs</td><td>N3231S</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb DNA 사다리</td><td>뉴잉글랜드 BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>2-log DNA 사다리</td><td>뉴잉글랜드 BioLabs</td><td>N3200L</td><td></td></tr></tbody></table>

앞으로 유전 접근은 마우스의 스트레스 저항성 유전자를 밝히기 위해서 - es 세포에서 높은 처리량 화면

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

쥐의 표현형 기반 유전자 스크리닝은 유전자 기능을 밝히는 강력한 기술이지만 종종 매우 높은 비용으로 인해 그 잠재력을 심각하게 제한합니다. 여기에서는 마우스 배아 줄기(ES) 세포를 대리 세포로 사용하여 관심 표현형을 스크리닝한 다음 이러한 세포를 숙주 배아에 도입하여 표현형을 가진 살아있는 마우스로 발달하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 (1) 포유류 세포의 유전자 스크리닝을 위한 비용 효율적이고 처리량이 많은 플랫폼을 제공합니다. (2) 돌연변이된 유전자를 확인하고 인과 관계를 확인하는 빠른 방법; (3) 전체 동물 연구를 위해 이러한 선택된 ES 세포에서 직접 마우스 돌연변이를 개발하기 위한 지름길. 우리는 저항성 돌연변이를 선택하고 산화 스트레스 저항성을 부여하는 돌연변이를 식별하기 위해 파라콰트(PQ)를 사용하는 것을 입증했습니다. 다른 스트레스 요인 또는 세포 독성 화합물을 사용하여 저항성 돌연변이를 스크리닝하여 다양한 세포 스트레스 저항성의 새로운 유전적 결정 요인을 밝힐 수도 있습니다.

전형적인 돌연변이 유발 실험에서는 트랜 PB-UPA 및 MPB의 트랜스와 3 × 10 7 ES 세포의 전체로 구성되어있다. 두 독립적 인 실험에서 생성 된 유전자 포획 ES 세포의 숫자는 표 1에 요약되어있다. 유전자의 포집 효율은 약 0.04 %이다. 결합 된 유전자 트랩 라이브러리는 22,400 독립적 인 돌연변이 마우스 게놈에 대한 전체 범위 (23,000 코딩 유전자)를 포함한다. 과도한 따르면 반복 돌연변이 유발을 통해 더욱 돌연변이를 생성 및 / 또는 공정을 스케일링함으로써 달성 될 수있다. 유전자 트랩 무작위 돌연변이 라이브러리를 포함하기 때문에, 스트레스 내성 표현형을 갖는 돌연변이의 수를 예측하는 것은 불가능하다. PQ 저항에 대한 두 개의 독립적 선택은 수행되었다; 22440 독립적 인 유전자 트랩 돌연변이의 결합 심사는 PQ에 휴대 저항 (0.08 %) (표 1) 부여 (17)...

스트레스 저항은 장수의 특징 중 하나이며 유 전적으로 규율하는 것으로 알려져있다. 여기, 우리는 장수 연구에 마우스 모델을 개발하기 위해있는 배아 줄기 세포에 스트레스 저항을 부여 돌연변이 선별 편견 높은 처리량 방법을 개발했다.

앞으로 유전 접근은 마우스의 스트레스 저항성 유전자를 밝히기 위해서 - ES 세포에서 높은 처리량 화면

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

이 방법의 전반적인 목표는 스트레스 내성 돌연변이 배아줄기세포를 효율적으로 선택하고, 관련 유전자를 신속하게 식별하며, 실행 가능한 마우스 모델을 비용 효율적으로 생성하는 것입니다. 이 방법은 노화 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 되며, 이를 통해 스트레스 내성 및 포유류의 건강 수명과 수명 연장에 관여하는 유전자를 식별할 수 있습니다. 따라서 이 기술의 한 가지 장점은 대리 모델로서의 배아줄기세포 스크리닝을 통해 새로운 돌연변이를 비용 효율적으로 선택하고 표현형 마우스 모델을 생성할 수 있다는 점입니다.ES 세포 배양을 시작하려면, 먼저 ES 세포 배양의 피더 세포(feeder cells)로 사용할 mitomycin C 활성화 일차 생쥐 배아 섬유아세포(primary mouse embryonic fibroblasts, P MFS) 한 바이알을 37 °C 항온수조에서 해동합니다. 세포를 5 mL의 ES 세포 배양액으로 옮긴 후 100 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거하고 세포를 30 mL의 ES 세포 배양액에 재현탁합니다.세포를 두 개의 100 millimeter 플레이트와 두 개의 T 25 플라스크에 분주합니다. 세포를 37 °C 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 다음으로, C nine ES 세포 한 바이알을 37 °C 항온수조에서 해동합니다.세포를 5 mL의 ES 세포 배지로 옮기고 튜브를 100 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거하고 세포를 5 mL의 ES 세포 배지로 재부유시킵니다. 그런 다음 공급세포(feeder cells)가 포함된 T 25 플라스크 중 하나에 세포를 분주합니다.37°C 및 5% CO2 조건에서 배양합니다. 배지는 매일 교체합니다. 이틀 후, ES 세포의 합류도가 약 80%가 되면 계대 배양을 수행합니다.이 세포들을 5 mL의 PBS로 한 번 세척하고 0.25% trypsin EDTA 2.5 mL를 첨가하여 37 °C에서 10분 동안 배양합니다. 이제 ES 세포 배지 2.5 mL를 넣고 피펫으로 15회 상하로 섞어 세포 덩어리를 분리합니다. 세포를 15 mL 원심분리관으로 옮기고 100 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 흡입하여 제거하고 세포 펠렛을 4 mL의 ES 세포 배지에 재부유시킵니다. 그런 다음, 9 mL의 ES 세포 배지가 들어 있는 두 개의 100 mm 플레이트에 세포를 각각 1 mL씩 옮깁

forward-genetic-approach-to-uncover-stress-resistance-genes-mice-high

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리의 단백질 표현 및 현지화의 postembryonic 규제를 식별할 수 sensitized 방법을...

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

우리는 신속하게 식별하고 마우스 배아 줄기 세포 유지 및 자기 갱신을 조절 유전자를 특성화하기 위해 형광 기자 분석을 설명합니다.

마우스 배아 줄기 세포 유지 보수 및 자체 갱신을 조절 유전자를 공부하는 Oct4GiP 리포터 분석

마우스 oocytes의 microinjection는 일반적인 transgenesis ( 즉, transgenes의 무작위 통합) 및 CRISPR 매개 유전자 타겟팅 모두에 일반적으로 사용됩니다. 이 프로토콜은 품질 관리 및 유전자 타이핑 전략에 중점을두고 마이크로 인젝션의 최신 개발 상황을 검토합니다.

난 모세포의 미세 주입을 통한 유전자 조작 마우스의 생성

이 프로토콜 기능 S. cerevisiae에 단백질 기반 상속에 대 한 화면을 높은 처리량 방법을 설명 합니다.

S. cerevisiae 에 단백질 기반 상속에 대 한 높은 처리량 검열

여기서, 우리는 선충 C. 예쁜꼬마선충에서 세포 단백질 독성 스트레스 반응을 형광 전사 기의 활성화를 측정하고 생리적 스트레스에 대한 감수성을 측정하여 특성화한다.

C. Elegans의 생리적 스트레스 반응 측정

샤페론-샤페론과 샤페론 기판 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 온화한 돌연변이와 결합된 RNA 간섭을 사용하여 Caenorhabditis elegans에 있는 합성 상호 작용 스크린을 능력을 발휘하고 chaperones의 과잉 발현및 유기체 수준에서 조직 특정 단백질 기능 장애를 감시합니다.

조직별 샤페론 상호 작용을 위해 검사하기 위해 Caenorhabditis elegans를 사용

읽기 아웃으로 Ca2 + 고도에 따라 앞으로 유전 화면은 식물에서 칼슘 의존 신호 경로에 관련된 유전 구성 요소의 식별에 이르게.

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유도만능줄기세포(iPSC), 일차 피질 뉴런 및 성상세포에서 유래한 뉴런으로 구성된 공동 배양 시스템을 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 공동 배양 시스템을 통해 새로운 iPSC 유래 뉴런과 채널로돕신-2를 발현하는 기존 피질 뉴런 사이의 시냅스 접촉 및 회로 형성을 감지할 수 있습니다.

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

배우세요 마우스 ES 세포를 이용한 고처리량 스트레스 저항성 유전자 선별 방법으로 노화 및 수명 연구에 활용할 수 있는 유전자 기능을 규명합니다.

앞으로 유전 접근은 마우스의 스트레스 저항성 유전자를 밝히기 위해서 - ES 세포에서 높은 처리량 화면

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