차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

이 방법은 간학 및 독성학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있으며, 새로운 인비트로(in vitro) 공동 배양 및 조직 공학 간 모델 개발의 기회를 제공합니다. 이 새로운 기술의 장점은 동일한 기증자의 동일한 작은 간 조직 조각으로부터 모든 간 세포군을 분리할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면, 멸균 조건에서 갓 적출한 간 조직의 무게를 측정하고 간 조직 샘플을 층류 작업대(laminar airflow hood) 안에 놓으십시오.

그다음 조직 샘플 표면에서 혈액을 닦아냅니다. 이어서 1X perfusion solution one을 사용하여 캐뉼라를 세척합니다. 조직 접착제를 사용하여 캐뉼라의 올리브 부분을 더 큰 혈관에 고정합니다.

그 다음, 관류 상태를 테스트하고 캐뉼라의 누출 여부를 확인하십시오. 이어서, 투명한 1X 관류액이 새어 나오는 모든 혈관을 조직 접착제로 폐쇄하십시오. 그 후, 캐뉼라가 삽입된 간 조직 샘플을 뷔히너 깔때기에 넣으십시오.

그 다음, 사용된 캐뉼라의 수와 간 조직의 저항에 따라 연동 펌프의 유량을 분당 7.5에서 14.6 mL 사이로 설정합니다. 전혈이 모두 씻겨 나갈 때까지 최소 20분에서 최대 30분 동안 조직을 관류합니다. 경우에 따라 관류를 최적화하기 위해 플라스틱 클램프로 캐뉼라 중 하나를 집거나, 스패튤라로 간 캡슐을 부드럽게 눌러 특정 부위의 내부 압력을 높여야 할 수도 있습니다.

갈색빛 붉은색에서 연갈색 또는 연노란색으로 완전히 색이 변하면 관류가 잘 이루어진 것임을 나타냅니다. 이후 관류액을 collagenase P가 포함된 소화 용액으로 교체하십시오. 그런 다음 소화 단계를 위해 장치 구성을 재조정합니다. 이어서 소화 용액을 최대 15분 동안 순환시키십시오.

주기적으로 관류를 중단하고 소화 정도를 확인하십시오. 간 조직 샘플이 충분히 소화되면 즉시 소화액 관류를 중단하는 것이 필수적입니다. 준비가 되면 장치에서 간을 꺼내 유리 접시에 담으십시오.

조직 샘플의 외부를 얼음처럼 차가운 Stop Solution으로 헹굽니다. 간 조직 샘플에서 캐뉼라를 제거합니다. 그 다음, 캐뉼라가 부착되었던 부위의 중앙을 메스로 절개하여 간 조직 샘플을 열되, 글리슨 캡슐(Glisson's capsule)이 손상되지 않도록 주의하십시오.

조직 샘플 내부를 헹군 다음, 조직 샘플 전체를 Stop Solution으로 덮습니다. 다음으로, 세포가 방출될 수 있도록 조직을 부드럽게 흔들어 줍니다. 그런 다음 세포 현탁액을 수집하여 거즈 깔때기를 통해 10개의 50-milliliter 플라스틱 튜브에 여과합니다.

최종 부피가 500 milliliters가 될 때까지 간 조직 샘플에 Stop Solution을 더 추가하십시오. 그 후, 세포 현탁액을 원심분리하여 나중에 NPC 분리를 위해 상층액을 수집하고, 세포 펠릿을 250-milliliters 플라스틱 튜브에 모으십시오. 이어서, PBS로 세포 펠릿을 세척하십시오.

이를 위해 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 상층액을 수집하고 펠릿을 모은 뒤, 간세포 배양 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 그 다음, Trypan blue 염색법을 사용하여 얻어진 세포 현탁액의 세포 수와 생존율을 측정합니다.

비실질 간세포를 분리하기 위해, 수집한 상층액을 원심분리하여 남아있는 적혈구와 간세포를 제거합니다. 상층액을 수집하고 두 번 원심분리하여 HCS, LEC, 일부 KC 및 나머지 KC를 침강시키기 위한 세포 펠릿을 얻습니다. 다음으로, 펠릿을 HBSS에 재현탁합니다. 그 후, 밀도 구배 원심분리를 위해 밀도 구배 용액과 PBS를 혼합하여 25% 및 50% 밀도 구배를 준비합니다.

25% 밀도 구배 용액을 50% 밀도 구배 용액 층 위에 조심스럽게 얹습니다. 이어서, 두 층이 명확하게 분리될 수 있도록 NPC 현탁액을 25% 밀도 구배 용액 층 위에 조심스럽고 천천히 올립니다. 밀도 구배가 형성된 세포 현탁액을 감속 없이 원심 분리합니다.

NPC는 25%와 50% 밀도 구배 층 사이의 계면에 위치합니다. 최상층에서 사멸 세포와 세포 파편을 흡입하여 제거하고 계면을 조심스럽게 수집하십시오. 이중 원심분리 후, KC 및 MPC 분획에 대해 세포 수를 측정하십시오.

그 다음, 앞서 설명한 이중 원심분리 단계로 NPC 분획을 원심분리하고 NPC를 Kupffer 세포 시딩 배지에 재현탁합니다. KC가 포함된 분획을 플라스틱 세포 배양 용기에 cm²당 5×10⁵ KC의 밀도로 시딩합니다. KC 배양물을 37°C, 5% CO2 조건의 습윤 인큐베이터에서 20분 동안 배양합니다.

1차 KC는 짧은 시간 내에 세포 배양 플라스틱에 부착되어야 합니다. 그 다음, 주로 LEC와 HSC로 구성된 비부착 NPC가 포함된 상층액을 수집하십시오. LEC와 HSC를 분리하기 위해, 먼저 상층액을 원심분리하십시오.

그런 다음, 펠릿을 PBS로 세척합니다. 두 번째 원심분리 후, 세포를 stellate cell endothelial cell separation medium에 다시 현탁하고 남은 모든 세포의 세포 수를 측정합니다. 다음으로, 10 million cells를 1 mL의 stellate cell endothelial cell separation medium에 다시 현탁합니다.

그 다음, MAX 키트의 블로킹 용액 20 µL와 면역 표지를 위한 CD31 microbeads 20 µL를 첨가하고, 결과물을 4 °C에서 15분 동안 배양합니다. 이어서, magnetically activated cell sorting system max의 제조사 프로토콜에 따라 HSC로부터 LEC를 분리하고 HSC 분획을 수집합니다. 자기적으로 유지된 CD31 양성 LEC를 용출하여 stellate cell endothelial cell culture medium에 현탁합니다.

여기에서 이 이미지들은 위상차 현미경 관찰 시 분리 공정 직후의 서로 다른 분리된 간 세포 집단들을 보여줍니다. 이 이미지 세트는 24시간 동안 배양한 후의 분리 및 배양된 세포들을 나타냅니다. 여기서는 서로 다른 세포 분획의 면역형광 기반 특성 분석 결과가 제시됩니다.

PHH는 분리 24시간 후 간세포 마커인 CK18에 대해 양성 신호를 보였고, KC는 분리 24시간 후 마커 CD68에 대해 양성을 보였으며, LEC는 분리 72시간 후 vimentin에 대해 양성 신호를 보였고, HSC는 분리 72시간 후 GFAP에 대해 양성을 보였습니다. 이 절차를 수행할 때, 성공적인 분리는 간 조직 샘플의 최적 소화 여부에 달려 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 이 절차의 핵심 단계인 소화 과정의 조절 방법과 밀도 구배 분리 수행 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 기술의 개발 이후, 의료 연구 분야의 연구자들은 새롭게 생성된 in vitro 세포 배양 및 조직 공학 간 모델을 통해 간 기능과 질병을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.