Name: 차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 배우세요 인간 간세포 및 비실질 간세포 분리 기법을 동일 기증자 조직에서 고수율로 분리하는 방법입니다. 이 기술은 간 기능 연구와 독성 시험을 위한 체외 공배양 모델 개발에 활용됩니다.

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0315741 : 우리는 본 연구는 교육 및 연구 (BMBF) 프로젝트 가상 간의 독일 연방 교육부에 의해 지원되었다 그림 1의 생성에서의 지원 지아 리 리우에게 감사의 말씀을 전합니다.

참고 : 모든 세포가 기본 또는 보조 간 종양 부분 간 절제술 후 남아 절제된 비 종 양성 인간의 간 조직에서 분리 하였다. Universitätsmedizin 베를린 - 환자의 동의는 샤리 테의 윤리적 지침에 따라 얻었다. 재료 및 솔루션 1. 준비 <ol><li> 분리 과정 중에 박테리아 오염을 방지하기 위해 미리 모든 장비 및 재료 멸균. </li><li> 갓 제조 소화 용액 제외 간 조직 샘플 간세포 비 실질 간세포의 단리 공정 및 표 1 및 2에 따른 차 인간 간세포의 배양 관류에 필요한 용액을 준비 사용 전에. 모든 솔루션은 4 ° C에 저장할 수 있습니다 준비 후 4 주 이내에 사용할 것을 권장합니다. </li><li> 소독하다0.22 μm의 병 상단 필터를 사용하여 모든 솔루션을 제공합니다. </li></ol> 관류 장비 2. 준비 <ol><li> 도 1a에 도시 된 바와 같이 간 조직 샘플의 관류 및 소화 장치를 설정한다. </li><li> 관류 및 소화하는 동안 최적의 콜라게나 P 활동을 보장하기 위해 39 ° C의 물 목욕 온도를 조정합니다. </li></ol> 간 조직 샘플 3. 관류 및 소화 (1.5 시간) <ol><li> 절제 간 조직에서 그대로 Glisson의 캡슐과 조직 샘플을 선택합니다. 조직 샘플을 절단하는 경우, 좋은 가시 용기와 작은 절단면을 수득보십시오. 수송 및 관류 때까지 얼음에 간 조직 샘플을 처리하여 따뜻한 허혈 시간을 피하십시오. </li><li> 무균 조건 하에서 조직의 무게를 가지고 층류 공기 흐름에 페트리 접시에 간 조직 샘플을 배치합니다. 재로부터 무균 압축과 조직 샘플의 표면을 청소피를 maining 모든 정맥이 투과되었는지 확인하기 위해 1 배 관류-솔루션 I을 사용하여 정맥 세트를 세척합니다. </li><li> 일부 큰 혈관의 캐 뉼러의 올리브를 해결하기 위해 조직 접착제를 사용합니다. 간 조직 샘플의 크기 및 표면의 혈관의 수에 따라 3 내지 8 뉼러 설정 캐뉼라를 사용한다. 관류를 테스트하고 누출을 확인합니다. 조직 접착제 맑은 1 배 관류-솔루션 I를, 누출 모든 닫기 혈관,. </li><li> 그 구멍 필터 디스크 (그림 1A)의 흡인 여과기로 유관 간 조직 샘플을 놓습니다. </li><li> 7.5 ㎖ / 분으로 이용 캐 뉼러의 수 및 간 조직의 저항에 따라 14.6 ml / 분의 연동 펌프의 유량을 설정한다. 현재 그러나 느린 관류가되도록 유량 매번 조정한다. 전혈은 플러시하지만 20 분 이상까지 조직을 관류. 좋은 perfusi와 지역에 밝은 될 조직을 관찰에. 주 : 일부 경우에, 플라스틱 클램프와 캐 뉼러 중 하나를 고정 할 필요가있을 수도 있고, 관류 최적화 간 캡슐 대하여 주걱으로 부드럽게 눌러 영역의 내부 압력을 증가시키기 위해. 밝은 갈색 컬러에 밝은 노란색에 전체 색상 변경은 좋은 관류를 나타냅니다. </li><li> 콜라게나 제 P (표 1)를 포함 소화-솔루션으로 관류 액을 변경합니다. </li><li> 소화 단계의 설치 (그림 1A)를 재 배열. 따라서 최대 15 분 동안 그림 1B에 따라 소화 - 솔루션의 순환 흐름을 수행합니다. 주 : 간 조직 샘플을 충분히 분해 할 때 즉시 재관류 중단하는 것이 중요하다. 좋은 소화가 주걱으로 밀어 경우, 캡슐 변형의 유지 보수에 의해 평가로 조직 탄성의 흔적을 보여줍니다 때, 관찰 할 수있다. </li></ol> 간세포 4. 단열 (1 시간) <ol><li> 티오프 연동 펌프를 항아리와 유리 접시에 간 조직 샘플을 배치합니다. 차가운 얼음 스톱 솔루션 (표 1)과 조직 샘플의 외부를 헹군다. 간 조직 샘플에서 캐 뉼러를 제거합니다. 캐뉼라가 부착 된 영역의 중앙에 절개하여 간 조직 샘플을 열 메스를 사용한다. Glisson&#39;s 캡슐은 그대로 유지 치료를 유지합니다. </li><li> 조직 샘플의 내부를 씻어 후 차가운 얼음 스톱 솔루션을 통해 전체 조직 샘플을 커버합니다. 조직에서 세포를 분리 부드럽게 조직을 흔들어. </li><li> 세포 현탁액을 수집하고 50 ML의 플라스틱 튜브로 시선 깔때기 (가제 압축 늘어서 플라스틱 깔때기)를 통해 필터링합니다. 500 ml의 최종 부피가 소모 될 때까지 간 조직 샘플 더 스톱 용액을 첨가. </li><li> 50 XG, 5 분, 4 ℃에서 세포 현탁액을 원심 분리기. 나중에 비 실질 세포 분리를위한 뜨는을 수집합니다. PBS (그림 2와 세포 펠렛을 씻으십시오A). </li><li> 50 XG, 5 분, 4 ℃에서 다시 세포 현탁액을 원심 분리기. 상층 액을 수집하고 간세포 배양 배지에서 펠렛 (표 2, 그림 2B)를 다시 일시 중지합니다. </li><li> 트리 판 블루 염색을 이용하여 생성 된 세포 현탁액 중의 세포 수 및 생존력을 결정한다. 노이 바 우어 계산 실에서 산 자와 죽은 세포를 계산합니다. 아래의 공식을 사용 PHH의 세포 수, 생존 능력 및 수율을 계산합니다. 세포 현탁액 (ML)의 수율 (세포 계수) = 카운트 셀 X 희석 인자 X 부피는 10,000 X 수율 (간세포 / (g 간 조직 샘플)) = (세포 현탁액 (ML)의 수율 (간세포 / (ML 매체)) × 양) / (간 조직 샘플의 중량 (g)) 생존율 (%) = 100 % × (생균 수) / (전체 세포 수) </li></ol> 간세포 5. 정제 (1 시간) 참고 : 생존 경우 정제 단계가 좋습니다70 %보다 낮다. <ol><li> 얼음의 모든 단계를 수행합니다. 5 ㎖ 밀도 구배 용액의 밀도 구배 원심 분리는 15 mL의 PBS을 혼합하여 25 %의 농도 구배를 준비한다. </li><li> 양 층의 명확한 분리 (도 2C)을 확보하기 위해 25 %의 농도 구배 층의 상부에 조심스럽게 천천히 간세포 풍부한 세포 현탁액에서 총 50 미오 셀의 최대 넣는다. 1250 XG, 20 분, 브레이크없이 4 ° C (그림 2D)에서 원심 분리기 원심 분리기로 조심스럽게 튜브를 넣습니다. </li><li> 나머지 세포 현탁액 및 계면에있는 죽은 세포를 대기음. 지방 함량 하나에 따라 또한 밀도 구배-솔루션을 대기음 수 있습니다. 주 : PHH 낮은 지질 함량은 치밀한 펠릿 및 밀도 구배가 완전히 흡입 수를 형성한다. 높은 지질 함량 PHH 펠릿 위 밀도 구배 용액에 남아있을 수보다 확산 펠릿 생세포 많이 형성한다. </li><li>50 XG, 5 분, 4 ° C에서 다시 PBS와 원심 분리기와 간세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 펠릿 수영장, PBS로 다시 씻어 ​​간세포 배양 배지에서 정제 PHH 다시 일시 중지합니다. 단계 4.6에 설명 된대로 셀 계산을 수행합니다. </li></ol> 간세포의 6 재배 <ol><li> 예 래트 꼬리 콜라겐 (콜라겐 타입 I)를 들면, 세포 외 기질로 코팅함으로써 PHH의 시딩을위한 세포 배양 접시를 준비한다. 라잔 등에 의해 설립 된 프로토콜에 따라 쥐의 꼬리 콜라겐을 준비합니다. (17) </li><li> 쥐의 꼬리 콜라겐 원액 1을 희석 : (200)을 PBS에. 표면 전체가 포함 된 배양 접시에 전송 100 μL / ㎠ 쥐 꼬리 콜라겐 솔루션, 돌보는. 실온에서 20 분 동안 세포 배양 플라스틱 인큐베이션. 나머지 쥐의 꼬리 콜라겐 솔루션을 대기음. </li><li> 문화 dishe에 간세포 배양 배지에서 종자 15 × 104 간세포 / cm 2쥐의 꼬리 콜라겐으로 코팅 s의. 적어도 4 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2의 가습 된 배양기에서 세포를 배양. 4 시간 후, 간세포 부착하고 배지를 변경할 수있다. </li><li> 실험 설정에 따라 조사를 수행합니다. 48 시간의 배양 시간은 세포 분리 과정에서 복구 할 것을 권장한다. </li></ol> 비 실질 간 세포의 7 격리 (1.5 시간) <ol><li> 원심 분리기 (72) XG, 5 분, 4 ° C에서 수집 된 뜨는 (단계 4.5 및 4.6) 남은 적혈구와 간세포를 제거합니다. 상층 액을 수영장과 두 개의 세포 펠렛을 얻기 위해 두 번을 원심 분리기 : 300 XG, 5 분, HSC, LEC 부분적 KC 650 XG, 7 분, 나머지 KC의 침강 4 ° C의 침강 4 ° C를. </li><li> 풀 펠릿 모두 HBSS에서 그들을 다시는 일시 중지합니다. 25 % 및 밀도 구배 centrif 믹싱 밀도 구배 용액 및 PBS에 의해 50 %의 농도 구배를 준비ugation (25 % 밀도 구배 용액 5 ml의 밀도 구배 용액을 15 ml의 PBS 50 % 밀도 구배 용액을 10 ml의 밀도 구배 용액 10 ㎖ PBS,도 2 참조). 50 % 밀도 구배 용액 층의 상부에 조심스럽게 25 % 밀도 구배 용액을 놓는다. </li><li> 양 층의 명확한 분리가 달성되는 방식으로 25 %의 밀도 구배 용액 층의 상부에 조심스럽게 천천히 NPC 현탁액을 넣어. </li><li> 원심 분리기 1800 XG, 20 분, 브레이크없이 4 ° C (그림 2.2)의 농도 구배에 세포 현탁액. </li><li> 대기음 사균과 최상층으로부터 세포 파편. 전인대는 25 %와 50 % 밀도 구배 층 (그림 2) 사이의 계면에 있습니다. HBSS와 원심 분리기와 상기 이중 원심 분리 단계 적용 세포 현탁액을 씻어 NPC를 수집한다 (단계 7.2.). </li></ol> 쿠퍼 세포의 분리 제 (준수분리 단계) (1 시간) <ol><li> 단계 4.6에 기재된 바와 같이 NPC 분획의 KC하는 세포 수를 수행한다. (현탁액 KC의 모양은 그림 (b) 참조). 원심 분리기 상기 이중 원심 분리 단계 (단계 7.2) 및 NPC 쿠퍼의 셀 시드 매체 (표 2)를 다시 일시 중지와 NPC의 일부. </li><li> 5 × 5 KC / ㎠의 밀도로 플라스틱 세포 배양 용기에 KC 함유 분획을 시드. 37 ° C에서 가습 인큐베이터에서 20 분 동안 KC 문화를 품어, 5 % CO 2. 기본 KC 단시간 (도 23) 내에서 세포 배양 플라스틱에 부착. </li><li> 주로 LEC와 HSC로 구성하지 부착 된 NPC를 포함하는 상층 액을 수집합니다. LEC 이후 분리를위한 상층 액을 풀 (섹션 9 참조) HSC는 (10 항 참조). HBSS로 부착 KC를 세척하고 37 ℃, 5 % CO에서 쿠퍼 세포 배양 배지 (표 2)에서 그들을 육성가습 인큐베이터에서 2. </li></ol> 내피 세포의 9 분리 (1.5 시간) <ol><li> 원심 분리기 300 XG, 5 분, 4 ° C에서 수집 된 뜨는 (단계 8.5.). PBS와 펠렛을 씻으십시오. 300 × g으로 5 분, 39 ° C를 성상 세포 / 내피 세포 분리 배지에서 세포를 다시 정지 단계 4.6에 기재된 바와 같이 나머지 모든 세포에 대한 세포 수를 수행 한 후 원심 분리. </li><li> immunolabeling의 MACS-KIT에서 솔루션을 차단 20 μL와 CD31 마이크로 비즈의 20 μl를 추가, 1 ml의 성상 세포 / 내피 세포 분리 배지에서 1 × 10 7 미오 셀을 다시 중단하고 4에서 15 분 동안 생성 된 현탁액을 품어 ° C 온도 (그림 2.4). </li><li> 자화 활성 세포 선별 시스템 MACS (그림 2.5)에 대한 제조자의 프로토콜에 설명 된대로 HSC에서 별도의 LEC. 자기 유지 CD31 양성 LEC을 용출 및 성상 C에서 그들을 중지엘 / 내피 세포 배양 배지 (표 2). </li><li> 단계 4.6에 설명 된대로 LEC에 대한 계산 셀을 수행합니다. 1.25 × 105 세포를 쥐 꼬리 콜라겐으로 코팅 된 세포 배양 용기에서 / ㎠의 밀도 시드 LEC (단계 6.1 참조). 가습 인큐베이터에서 37 ℃로, 5 % CO 2에서 세포 배양. </li></ol> 성상 세포 (10) 분리 (0.5 시간) <ol><li> 레이블이없는 HSC는 MACS 과정에서 분리 컬럼을 전달합니다. HSC 분율 (그림 2.5 단계 9.5 참조)를 수집합니다. 단계 4.6에 설명 된대로 셀 계산을 수행합니다. </li><li> 래트 꼬리 콜라겐으로 코팅 된 세포 배양 용기에 5 × 104 세포 / ㎠의 밀도로 시드 HSC는 성상 세포 / 내피 세포 배양 배지 (표 2)에서 (단계 6.1 참조), 37 ° C, 5 %을 육성 가습 인큐베이터에서 CO 2. </li></ol><img alt= &quot;표 1&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 53069 / 53069table1.jpg&quot;/&gt; 표 1 : 관류 및 격리 솔루션입니다. <img alt="표 2" src="/files/ftp_upload/53069/53069table2.jpg" /> 표 2 : 문화 절연 매체.

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</ol>

저자는 경쟁하는 이해관계가 없음을 선언합니다.

게시 된 프로토콜은 동시에 인간의 간 조직의 동일한 샘플에서 높은 품질과 순도, 순수 PHH 및 NPC, 즉 KC, HSC와 LEC를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 간세포 아이솔레이션 다루는 문헌의 대부분은 인간 조직 수행 그 세포 집단 18-20 및 분리 절차들 중 하나 (21) (당국이 외. 검토) 희소 커버. 인간의 간을 동물 조직 (예를 들면, 쥐의 간) 설립 방법의 적응력 동물과 인간의 세포 집단 사이의 셀 속성에서 몇 가지 차이점을 밝혔다. 다른 간세포 집단을 덮는 간 세포 분리 방법의 확립은 실질 비 실질 세포 분리를 조합하여 인해 최적의 결과를 위해 요구되는 소화 시간차에 중요한 단계 인 것으로 나타났다. 이 도전에 직면 우리는 다른 기술을 결합 간 세포 격리 프로토콜을 개발하고 적응우리 PHH 분리 프로토콜 10 SE. 용액 II를 함유하는 콜라게나 제 P로 10 %...

인간의 간 조직은 매우 복잡하고 여러 개의 셀 엔티티 실질 세포 및 비 실질 세포 (NPC)로 구성된다. 실질 간 세포는 간세포와 담관을 포함한다. 간세포는 전체 간세포의 60 ~ 70 %를 차지하며 대사성 간 기능의 대부분을 차지하고, 예를 들면, 담즙산 및 인자 합성, 생물 전환 및 에너지 대사 2,3- 보완. 작은 NPC 분획 총 간세포 30-40 %로 구성한다. NPC는 서로 다른 세포 집단, 즉 쿠퍼 세포 (KC), 간 내피 세포 (LEC)와 간 성상 세포 (HSC)를 포함한다. 이 이종의 세포 분획 간의 생리적 과정에서 중요한 역할을한다. 또한, NPC는 예를 들어, 약물 - 유도 간 손상 (딜리)뿐만 아니라 만성 간 손상, 간경화 4 급성 간 손상을 중재에 참여한다. 최근, H잃어버린 간 세포는 간 질환에 점점 더 중요한 연구 및 약물 검사, 약물 개발 및 새로운 생화학 적 경로의 식별 개발되고있다. 시험관 테스트를 위해 PHH의 단일 재배는 여전히 &quot;황금 표준&quot;으로 간주됩니다 5. 현재 동형 간 모델의 주요 제한은 수일 내에 4 탈분화 및 간세포의 기능의 상실이다. 3 차원 (3D) 배양 기술의 확립이 제한 4,6- 보상 될 수 있다는 것을 보여 주었다. 그러나, 현대 3D 배양 기술 액션 7 모두 간독성 모드를 표시 할 수 없다. 기존의 체외 모델에서 누락 NPC 인구는 생체 내 상황이 차이에 대한 가능한 이유로 설명합니다. 또한 pathophy의 다른 간세포 집단의 세포 간 통신 생리적 항상성에서 중심 역할을하는 것으로 밝혀졌다siologic 8을 처리합니다. 따라서 과학주의는 NPC 및 세포 - 세포 상호 작용에 점점 더 초점을 맞추고있다. 공동 문화 및 조직 설계 시스템에서 그들의 목적 사용 가능한 생체 내 상황에 가까운 있습니다 체외 간 모델 8,9의 높은 수요에 대한 해결책이 될 수 있습니다. 현재의 주요 과제는 PHH 및 NPC의 명확하게 정의 부분을 포함하는 표준화 된 인간 간 공동 배양 모델의 개발이다. 결과적으로, 매우 이종의 간 세포 분리 기술이 필요하고 그 순수한 세포 집단을 얻기 위해 최적화 될 필요가있다. PHH 격리를위한 표준화 된 프로토콜 10 존재하지만, 인간의 NPC의 표준화 분리는 아직 개발 중입니다. 대부분의 출판 NPC 분리 프로토콜은 비 - 인간 세포 11,12 실험에 기초한다. 불과 몇 간행물은 인간의 NPC의 분리 과정을 설명하고 대부분은 커버단일 세포의 분리 방법은 11 ~ 16을 입력합니다. 세포 분리 무력화 된 전지의 가장 중요한 특성은 크기, 밀도, 부착 거동 및 표면 단백질을 발현한다. 이러한 특성을 바탕으로 우리는 실험 생물학 및 의학 1 년 이전에 출판 된 PHH, KC, LEC와 HSC를 분리하는 간단한 프로토콜을 개발했다. 때문에이 기술의 광범위한 관심이 문서의 목적은보다 용이하게 재생 기술을 허용하는 비디오를 포함하는 간 세포 분리 방법에 대한 상세한 프로토콜을 제공하는 것이다. 이 프로토콜은 또한 수율과 생존의 평가뿐만 아니라 특정 immunostainings를 사용하여 식별 및 순도 평가를위한 품질 관리 방법을 포함한다.

<table><tbody><tr><td>General Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PIPETBOY</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2-incubator</td><td>바인더</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamin Air</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 Varifuge 3.0R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소변 비커</td><td>Sarstedt</td><td>2041101</td><td></td></tr><tr><td>퍼퓨저 주사기 50ml</td><td>B.Braun</td><td>12F0482022</td><td></td></tr><tr><td>병 상단 필터</td><td>Nalgene</td><td>1058787</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50ml 폴리프로필렌 원추형 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml 폴리 프로필렌 원뿔 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트</td><td>BD Biosciences</td><td>533047</td><td>24 웰</td></tr><tr><td>혈청 학적 피펫</td><td>BD Biosciences</td><td>357525, 357551, 357543</td><td>25 ml, 10 ml, 5 ml</td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>SARSTEDT</td><td>0220 / 2278014, 0005 / 2242011, 0817 / 2222011</td><td>100 &micro; l, 200 &마이크로; l, 1,000 &마이크로; l</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>카탈로그 번호</td><td>Comments<</td></tr><tr><td>strong>Isolation Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>water bath</td><td>Lauda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Carl Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>순환 온도 조절기</td><td>Lauda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>Schott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미세 저울</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스탠드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; chner 깔때기</td><td>Haldenwanger</td><td></td><td></td></tr> 올리<tr><td>브 팁</td><td></td><td></td><td></td>이있는</tr><tr><td>플라스틱 깔때기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>실리콘 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr> 캐뉼라 <tr><td>유리 접시</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>깃털</td><td>12068760</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 계산 챔버</td><td>시신경 노동</td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 리프터</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>외과 드레이프</td><td>Charit&eacute; 대학교&auml; tsmedizin 베를린</td><td>A2013027</td><td></td></tr><tr><td>압축</td><td>Fuhrmann</td><td>40013331</td><td></td></tr><tr><td>멸균 수술 장갑</td><td>Gammex PF</td><td>1203441104</td><td></td></tr><tr><td>조직 접착제</td><td>B. Braun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>유리병</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 P</td><td>Roche</td><td>13349524</td><td></td></tr><tr><td>Percoll 분리 솔루션</td><td>Biochrom</td><td>L6145</td><td>밀도 1.124 g / ml</td></tr><tr><td>행크 ' s BSS</td><td>PAA</td><td>H00911-3938</td><td></td></tr><tr><td>둘베코 s PBS</td><td>PAA</td><td>H15 - 002</td><td>without Mg/Ca</td></tr><tr><td>Ampuwa</td><td>Plastipur&nbsp;</td><td>13CKP151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>머크</td><td>1,064,041,000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>머크</td><td>49,361,000</td><td></td></tr><tr><td>헤페스 복어&nbsp;</td><td>Roth</td><td>133196836</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Media Equipment&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAA</td><td>E15-005</td><td>저포도당(1g/L)(L-글루타민 제외)</td></tr><tr><td>HEPES 완충 용액 1&nbsp; M</td><td>GIBCO</td><td>1135546</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>GIBCO</td><td>25030-024</td><td>200mM</td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>GIBCO</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15 - 039</td><td>L-글루타민</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>없음 GIBCO</td><td>1137663</td><td>100mM</td></tr><tr><td>트리판 블루 솔루션</td><td>: 시그마 - 알드리치</td><td>T8154</td><td>0.4 %</td></tr> <tr><td>윌리엄 ' s E&nbsp; &nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>32551-020</td><td></td></tr><tr><td>with GlutaMAX&trade;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>시그마-알드리치</td><td>03780-50G</td><td></td></tr><tr><td>포테코르틴</td><td>머크</td><td>49367</td><td>8 mg/2 ml</td></tr><tr><td>인간-인슐린</td><td>릴리</td><td>HI0210</td><td>100 IE/ml</td></tr><tr><td>N-아세틸 시스테인</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청(FCS)</td><td>PAA</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</strong</td></tr><tr><td>>면역염색용 장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD 68</td><td>R& D Systems, 미국</td><td></td><td>단클론</td></tr><tr><td>CK 19</td><td>산타 크루즈</td><td>D2309</td><td>다클론</td></tr><tr><td>CK18</td><td>산타 크루즈</td><td>K2105</td><td>단클론</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>산타 크루즈</td><td></td><td>단클론</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>시그마 알드리치</td><td></td><td>단클론</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마 알드리치</td><td>23.472-9</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG1-PE</td><td>산타 크루즈</td><td>C0712</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG-FITC</td><td>산타 크루즈</td><td>L0412</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>J.T.Baker</td><td>1104509006</td><td></td></tr><tr><td>포름 알데히드 4 %</td> <td>Herbeta Arzneimittel</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>시그마 Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

실질 간세포 옆에, 간은 비 실질 세포 (NPC) 즉 쿠퍼 세포 (KC), 간 내피 세포 (LEC)와 간 성상 세포 (HSC)로 구성되어 있습니다. 차 인간 간세포 (PHH)의 두 차원 (2D) 문화는 여전히 약물 대사 및 간독성의 시험관 테스트를위한 &quot;골드 표준&quot;으로 간주됩니다. 그것은 PHH의 2 차원 단일 문화는 탈분화 및 기능의 상실을 앓고 것으로 잘 알려져있다. 최근이 간 NPC 간 (병리) 생리학의 중심 역할과 PHH 기능의 유지 보수를 재생 것으로 나타났다. 현재의 연구는 2 차원 단일 재배의 한계를 극복하기 위해 3D- 공동 배양 모델에 의해 생체 내 조직 구조의 복원에 초점을 맞추고있다. 이전에, 우리는 인간 간 세포를 분리하는 방법을 발간 실험 생물학 및 의학 1 세포 배양 물에서의 사용을위한 이들 세포의 적합성을 연구 하였다. 이 테의 폭 넓은 관심을 바탕으로이 문서의 목적을 chnique하는이 기술을 쉽게 재생 허용하는 비디오를 포함하는 간 세포 분리 방법에 대한 상세한 프로토콜을 제공하는 것이다. 인간 간세포는 두 단계 EGTA / 콜라게나 제 P 관류 기술에 의해 수술 개입 인간의 간 조직 샘플로부터 분리 하였다. PHH 50 x g에서 초기 원심 NPC로부터 분리 하였다. 밀도 구배 원심 분리 단계 사균의 제거를 위해 사용 하였다. 개인 간 세포 집단은 특정 세포 성 및 세포 선별 방법을 사용하여 농축 된 NPC 분획으로부터 분리 하였다. PHH 격리 옆에 우리는 더 재배 KC, LEC와 HSC를 분리 할 수​​ 있었다. 함께, 제시된 프로토콜은 한 기증자의 조직 샘플에서 높은 품질과 수량에 PHH 및 NPC의 분리를 할 수 있습니다. 정제 간 세포 집단에 대한 접근은 인간의 리 같은 생체의 생성을 허용 할 수 있습니다버전 모델.

준수의 특성과 맥의 사용과 결합 정리 절차로 밀도 기울기 원심 분리를 이용하여 실질이 아닌 실질 부분에 분리는 성공 PHH 및 NPC 분리로 연결됩니다. PHH 및 NPC는 높은 품질과 수량에 고립 될 수있다. (1) 간 관류 및 소화 용 장비의 대표 설정을 보여줍니다. 프로테아제 단백질 분해 활성을 감소시키는 대가로 콜라게나 제 P 활성 안정화 용액 II - 10 % FCS 관류를 함유하는 콜라게나 제 P로 하였다. NPC 분리에 필요한 결과 이​​상 소화 시대 PHH의 생존 능력에 부정적인 영향없이 적용 할 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53069/53069fig1.jpg" /> 그림 1.</st...

동일한 공여자로부터 인간 간세포와 비실질 간 세포를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 다양한 간 세포 유형은 기능적 간 모델 및 조직 공학의 기초를 구축합니다. 이 새로운 방법은 높은 수율과 생존력으로 간 세포를 분리하는 것을 목표로 합니다.

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

이 방법은 간학 및 독성학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있으며, 새로운 인비트로(in vitro) 공동 배양 및 조직 공학 간 모델 개발의 기회를 제공합니다. 이 새로운 기술의 장점은 동일한 기증자의 동일한 작은 간 조직 조각으로부터 모든 간 세포군을 분리할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면, 멸균 조건에서 갓 적출한 간 조직의 무게를 측정하고 간 조직 샘플을 층류 작업대(laminar airflow hood) 안에 놓으십시오.그다음 조직 샘플 표면에서 혈액을 닦아냅니다. 이어서 1X perfusion solution one을 사용하여 캐뉼라를 세척합니다. 조직 접착제를 사용하여 캐뉼라의 올리브 부분을 더 큰 혈관에 고정합니다.그 다음, 관류 상태를 테스트하고 캐뉼라의 누출 여부를 확인하십시오. 이어서, 투명한 1X 관류액이 새어 나오는 모든 혈관을 조직 접착제로 폐쇄하십시오. 그 후, 캐뉼라가 삽입된 간 조직 샘플을 뷔히너 깔때기에 넣으십시오.그 다음, 사용된 캐뉼라의 수와 간 조직의 저항에 따라 연동 펌프의 유량을 분당 7.5에서 14.6 mL 사이로 설정합니다. 전혈이 모두 씻겨 나갈 때까지 최소 20분에서 최대 30분 동안 조직을 관류합니다. 경우에 따라 관류를 최적화하기 위해 플라스틱 클램프로 캐뉼라 중 하나를 집거나, 스패튤라로 간 캡슐을 부드럽게 눌러 특정 부위의 내부 압력을 높여야 할 수도 있습니다.갈색빛 붉은색에서 연갈색 또는 연노란색으로 완전히 색이 변하면 관류가 잘 이루어진 것임을 나타냅니다. 이후 관류액을 collagenase P가 포함된 소화 용액으로 교체하십시오. 그런 다음 소화 단계를 위해 장치 구성을 재조정합니다. 이어서 소화 용액을 최대 15분 동안 순환시키십시오.주기적으로 관류를 중단하고 소화 정도를 확인하십시오. 간 조직 샘플이 충분히 소화되면 즉시 소화액 관류를 중단하는 것이 필수적입니다. 준비가 되면 장치에서 간을 꺼내 유리 접시에 담으십시오.조직 샘플의 외부를 얼음처럼 차가운 Stop Solution으로 헹굽니다. 간 조직 샘플에서 캐뉼라를 제거합니다. 그 다음, 캐뉼라가 부착되었던 부위의 중앙을 메스로 절개하여 간 조직 샘플을 열되, 글리슨 캡슐(Glisson's capsule)이 손상되지 않도록 주의하십시오.조직 샘플 내부를 헹군 다음, 조직 샘플 전체를 Stop Solution으로 덮습니다. 다음으로, 세포가 방출될 수 있도록 조직을 부드럽게 흔들어 줍니다. 그런 다음 세포 현탁액을 수집하여 거즈 깔때기를 통해 10개의 50-milliliter 플라스틱 튜브에 여과합니다.최종 부피가 500 milliliters가 될 때까지 간 조직 샘플에 Stop Solution을 더 추가하십시오. 그 후, 세포 현탁액을 원심분리하여 나중에 NPC 분리를 위해 상층액을 수집하고, 세포 펠릿을 250-milliliters 플라스틱 튜브에 모으십시오. 이어서, PBS로 세포 펠릿을 세척하십시오.이를 위해 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 상층액을 수집하고 펠릿을 모은 뒤, 간세포 배양 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 그 다음, Trypan blue 염색법을 사용하여 얻어진 세포 현탁액의 세포 수와 생존율을 측정합니다.비실질 간세포를 분리하기 위해, 수집한 상층액을 원심분리하여 남아있는 적혈구와 간세포를 제거합니다. 상층액을 수집하고 두 번 원심분리하여 HCS, LEC, 일부 KC 및 나머지 KC를 침강시키기 위한 세포 펠릿을 얻습니다. 다음으로, 펠릿을 HBSS에 재현탁합니다. 그 후, 밀도 구배 원심분리를 위해 밀도 구배 용액과 PBS를 혼합하여 25% 및 50% 밀도 구배를 준비합니다.25% 밀도 구배 용액을 50% 밀도 구배 용액 층 위에 조심스럽게 얹습니다. 이어서, 두 층이 명확하게 분리될 수 있도록 NPC 현탁액을 25% 밀도 구배 용액 층 위에 조심스럽고 천천히 올립니다. 밀도 구배가 형성된 세포 현탁액을 감속 없이 원심 분리합니다.NPC는 25%와 50% 밀도 구배 층 사이의 계면에 위치합니다. 최상층에서 사멸 세포와 세포 파편을 흡입하여 제거하고 계면을 조심스럽게 수집하십시오. 이중 원심분리 후, KC 및 MPC 분획에 대해 세포 수를 측정하십시오.그 다음, 앞서 설명한 이중 원심분리 단계로 NPC 분획을 원심분리하고 NPC를 Kupffer 세포 시딩 배지에 재현탁합니다. KC가 포함된 분획을 플라스틱 세포 배양 용기에 cm²당 5×10⁵ KC의 밀도로 시딩합니다. KC 배양물을 37°C, 5% CO2 조건의 습윤 인큐베이터에서 20분 동안 배양합니다.1차 KC는 짧은 시간 내에 세포 배양 플라스틱에 부착되어야 합니다. 그 다음, 주로 LEC와 HSC로 구성된 비부착 NPC가 포함된 상층액을 수집하십시오. LEC와 HSC를 분리하기 위해, 먼저 상층액을 원심분리하십시오.그런 다음, 펠릿을 PBS로 세척합니다. 두 번째 원심분리 후, 세포를 stellate cell endothelial cell separation medium에 다시 현탁하고 남은 모든 세포의 세포 수를 측정합니다. 다음으로, 10 million cells를 1 mL의 stellate cell endothelial cell separation medium에 다시 현탁합니다.그 다음, MAX 키트의 블로킹 용액 20 µL와 면역 표지를 위한 CD31 microbeads 20 µL를 첨가하고, 결과물을 4 °C에서 15분 동안 배양합니다. 이어서, magnetically activated cell sorting system max의 제조사 프로토콜에 따라 HSC로부터 LEC를 분리하고 HSC 분획을 수집합니다. 자기적으로 유지된 CD31 양성 LEC를 용출하여 stellate cell endothelial cell culture medium에 현탁합니다.여기에서 이 이미지들은 위상차 현미경 관찰 시 분리 공정 직후의 서로 다른 분리된 간 세포 집단들을 보여줍니다. 이 이미지 세트는 24시간 동안 배양한 후의 분리 및 배양된 세포들을 나타냅니다. 여기서는 서로 다른 세포 분획의 면역형광 기반 특성 분석 결과가 제시됩니다.PHH는 분리 24시간 후 간세포 마커인 CK18에 대해 양성 신호를 보였고, KC는 분리 24시간 후 마커 CD68에 대해 양성을 보였으며, LEC는 분리 72시간 후 vimentin에 대해 양성 신호를 보였고, HSC는 분리 72시간 후 GFAP에 대해 양성을 보였습니다. 이 절차를 수행할 때, 성공적인 분리는 간 조직 샘플의 최적 소화 여부에 달려 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 이 절차의 핵심 단계인 소화 과정의 조절 방법과 밀도 구배 분리 수행 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 기술의 개발 이후, 의료 연구 분야의 연구자들은 새롭게 생성된 in vitro 세포 배양 및 조직 공학 간 모델을 통해 간 기능과 질병을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.

protocol-for-isolation-primary-human-hepatocytes-corresponding-major

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

기본 hepatocytes는 생리학 관련 실험 시스템의 생화학, 분자, 그리고 신진 대사 기능을 평가하는 유용한 도구를 제공합니다. 우리는 지속적으로 to1.0 × 10 백업 실행 가능한 hepatocytes를 생성 원위치 간 재관류에 쥐에 대한 신뢰할 수있는 프로토콜을...

쥐 간장 세포의 분리 및 차 문화

인간 간세포의 분리를위한 수정 된 두 단계의 콜라게나 제 관류 절차가 설명되어 있습니다. 이 방법은 다른 포유 동물의 간장에 적용될 수있다. 고립 된 간세포는 그 같은 간 재생, 약동학 및 독성 등의 분야에서 과학 연구에 적합한 모델을 만들고, 높은 수율과 생존에서 사용할 수 있습니다.

2 단계 콜라게나 제 관류 절차에 의한 인간의 간세포의 분리

간 손상은 이종 세포 인구를 나타내는 전구 세포의 확장을 동반한다. 이 세포 구획의 소설 분류는 여러 부분 집합의 구별이 가능합니다. 여기에 설명 된 방법은 추가 분석 및 분석에 사용될 수있는 다양한 서브 세트의 고순도 분리 계측법 흐름을 도시한다.

분리 및 소설 표면 마커 조합에 의해 확인 된 간 전구 부분 집합의 농축

여기, 우리는 건강 하 고 기능적인 기본 마우스 hepatocytes의 격리에 대 한 프로토콜을 제시. 비 방사성 라벨 기판 간 초기 단백질 합성을 탐지 하기 위한 지침에에서 에너지 대사 항상성의 맥락에서 단백질 합성을 기본 메커니즘을 이해할 수 있도록 제공 되었다.

비 방사성 L-azidohomoalanine 라벨 방법에 의해 초기 단백질 합성 분석에 대 한 기본 마우스 Hepatocytes의 절연

이 프로토콜의 목표는 B 형 간염 바이러스와 3 차원 "간-온-어-칩" 감염 실험을 수행 하는 단계별 가이드를 제공 하는입니다.

기본 Hepatocytes 및 B 형 간염 바이러스 감염에 대 한 Kupffer 세포의 "간-온-어-칩" 문화

원발성 간세포는 시험관 내에서 간 반응과 신진 대사를 연구하는 데 유용한 도구입니다. 상업적으로 이용가능한 시약을 이용하여, 마우스 원발성 간세포 단리를 위한 개선된 시간- 및 노동-효율적인 프로토콜이 개발되었다.

마우스 원발성 간세포 분리를 위한 개선된 시간 및 노동력 효율적인 프로토콜

이 프로토콜은 특수 정맥 내 카테터, 표준화 된 멸균 일회용 튜브, 실시간 모니터링으로 보완 된 온도 제어 및 분리 된 일차 쥐 간세포의 생존력, 수율 및 기능의 일관성을 향상시키기 위해 두 단계 콜라게나제 관류 절차를위한 경보 시스템의 사용을 자세히 설명합니다.

다중 파라미터 관류 조절을 통한 원발성 쥐 간세포의 분리

지질이 함유된 간세포는 간 재생에 내재되어 있지만 일반적으로 밀도 구배 원심분리 시 손실됩니다. 여기에서 우리는 지방성 간세포를 유지하는 최적화된 세포 분리 프로토콜을 제시하여 마우스에서 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 대표적인 집단을 생성합니다.

생쥐의 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 분리

여기에서 우리는 정상 상태 말초 혈액에서 분리된 단핵 세포를 사용하여 인간 자가 간 스페로이드를 생성하는 비유전적 방법을 제시합니다.

간 질환 연구를 위한 말초 혈액의 인간 간 스페로이드

이 프로토콜은 쥐 모델에서 최적화된 2단계 콜라겐분해효소 간 관류 기술을 제시하고 3D 오가노이드의 시험관 장기 배양을 위해 분리된 간세포의 사용을 보여줍니다.

쥐의 간 관류 및 일차 간세포 분리: 최첨단 3D 오가노이드 배양에 중요한 오래된 절차

배우세요 인간 간세포 및 비실질 간세포 분리 기법을 동일 기증자 조직에서 고수율로 분리하는 방법입니다. 이 기술은 간 기능 연구와 독성 시험을 위한 체외 공배양 모델 개발에 활용됩니다.

차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

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