Name: 종양 특이 내피 세포의 분리 및 문화 확장 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 배우세요 종양 특이 내피 세포를 자기성 구슬 컬럼과 클로닝 링을 사용하여 분리하고 배양하는 방법을. 이 기술은 높은 순도와 생존율을 제공하여 종양 혈관 생성 연구에 활용됩니다.

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ACD는 미국 국립보건원(National Institute of Health, R01-CA177875)의 보조금으로 지원됩니다. LX는 UNC 채플힐에서 HHMI의 자금 지원을 받는 중개 의학 프로그램의 펠로우입니다. JVM은 UNC 채플힐의 통합 혈관 생물학 프로그램(Integrative Vascular Biology Program)의 T32 박사 전 펠로우십의 지원을 받습니다. 컨포칼 현미경 검사에 도움을 주신 Clayton Davis에게 감사드립니다.

다음 프로토콜은 채플 힐 노스 캐롤라이나 대학의 실험 동물 의학의 부에 의해 설립 된 지침에 따라 수행된다. 1. 시작하기 전에 다음 재료 및 시약 준비 <ol><li> 400 ml의 낮은 혈당 보충에 의해 EC 미디어를 준비 (1g / L의 D- 글루코스 또는 LG) 둘 베코의 수정 50 ml의 열 불 활성화 된 소 태아 혈청, 5 ml의 항생제 항진균제 50 ㎖ 뉴 - 세럼 IV, 독수리의 매체 (DMEM) 상업 키트에서 hFGF의, VEGF, hEGF, R3-IGF-1, 헤파린 구성 요소. </li><li> 500㎖의 FACS 완충액 (0.5 % BSA 및 PBS 2 mM의 EDTA)을 제조; 멸균 0.22 μm의 필터 컵을 통해 필터링합니다. </li><li> 소독 또는 보드를 해부 소독. </li><li> 해부 핀, 외과 가위, 및 dissectors을 소독. </li></ol> 2. EC 절연 (1 일 ~ 5 시간) <ol><li> 이산화탄소 또는 다른 방법과 호환 재치 마우스를 안락사H 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 정책. 참고 : 크기가 다양한 여러 유방 종양 (5 - 직경 15 mm의), 같은 C3-태그와 같은 단일 유전자 변형 마우스의 개발 TEC의 격리를 위해 그들 모두를 수확해야 할 수 있습니다. 하나의 EC 격리를위한 세 가지 1cm 3 종양 동소 마우스에 접목되어 종양, 수영장 두를 사용하는 경우. 여기서 우리는 데모로 유방 종양을 사용하지만, 프로토콜은 다른 유형의 종양에 대해 변형 될 수있다. </li><li> 분무 또는 75 % V / V 에탄올의 충분한 양의 마우스 복부 측면을 닦아 마우스를 소독. </li><li> 멸균 후드 나 클린 벤치에서 무균 기술을 사용하여 가위와 dissectors 일쌍로 종양을 절제. <ol><li> 스트레칭과 해부 보드에 마우스의 사지를 고정. 복막을 열지 않고 가위로 중간 선 복부 절개를합니다. 피부 종양이있는 유선으로 복막 사이에 옆으로 해부.복막을 열지 마십시오. </li><li> 소비세 만 종양 유선에서 조직, 일반 유선 마진을 떠나. 조심스럽게 피부와 근육 등 비 종양 조직을 손질하고, 얼음에 LG-DMEM 30 ml의를 포함하는 원뿔 튜브에 해부 종양을 배치합니다. </li></ol></li><li> 조직 문화 후드에 종양 샘플을 가져와; 2 회 - 멸균 LG-DMEM 1 조직을 씻는다. </li><li> 멸균 조직 문화 배양 접시에 원뿔 튜브에서 전송 종양, 접시에 LG-DMEM 2 ㎖를 추가하고, 조각으로 멸균 가위 &lt;5mm 말하다. </li><li> PBS에서, 디스 파제 1 ㎖를 (주 ​​= 행크의 균형 소금 솔루션에 2 mg을 / ㎖, HBSS를 이하) 콜라게나 제 5 mL를 추가 (재고 = HBSS에 2.5 U / ㎖) 및 데 옥시 리보 뉴 클레아 제 75 μL (주 = 1 ㎎ / ㎖ ) 페트리 접시에. 총 부피는 지금 ~ 10 ㎖이다. </li><li> (미리 설정된 해리 홍보 조직 dissociator 튜브에 페트리 접시에서 콜라겐 / 조직 믹스를 전송하고 두 번 60 초 동안 조직 dissociator에서 실행dissociator에 ogram : 실행 당 1,270 총 라운드). 빛은 37 ° C에서 75 분 동안 진탕 기에서 진탕 배양한다. </li><li> 필터를 50 ㎖ 원뿔형 튜브 위에 100 ㎛ 세포 스트레이너를 통해서 조직을 분해. FACS 버퍼 5 ㎖와 린스 필터가 남아있는 세포를 씻어. 5 분 동안 280 XG에 스핀 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음. </li><li> 멸균 수 9 ml의 스톡 RBC 용해 완충액 (10 배)의 1 mL로 희석. 바로 10 용해 완충액 (1X)의 용액과 함께를 Lyse 적혈구는 280 x g에서 5 분간 스핀. 참고 : 약간의 피가 보이는 경우에는이 단계를 건너 뛸 수 있습니다. </li><li> FACS 완충액 10ml에 재현 탁. 트리 판 블루 10 μL와 세포 현탁액의 10 μl를 혼합하고, 혈구를 사용하여 살아있는 세포를 계산합니다. </li><li> ~ 10 7 세포 / 100 μL에서 세포를 재현 탁. 세포 현탁액 100 ㎕ 당 FcRγ 쇄 블록의 10 μl를 추가하고 10 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 따라 쥐 방지 마우스 PE - 복합 CD31 항체 추가. 때때로 15 분, 영화 튜브 - 표 1 (10) 얼음에 품어. </li><li> 5 분 동안 280 XG에 튜브와 스핀에 외과 버퍼의 10 ML을 추가합니다. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 FACS 버퍼의 5 ㎖로 다시 세포 펠렛을 씻는다. 원심 분리기는 세포 펠렛합니다. 방해 세포 펠렛없이 기음 뜨는. </li><li> . 표 2에 따라 외과 버퍼 및 안티 체육 마이크로 비드를 추가 (10) 얼음에 품어 - 15 분. 가끔 톡 관. </li><li> 5 분 동안 280 XG에 외과 버퍼와 스핀 샘플의 10 ML을 추가; 다시 FACS 완충액 원심 5 ㎖로 한번 세척 하였다. 방해 펠렛없이 대기음 뜨는. </li><li> FACS 버퍼 300 μL에 볼륨을 가져와. G X 280에 35 μm의 셀 스트레이너 덮인 관 5 분을 통해 스핀. 필요한 경우 2 튜브와 더 큰 볼륨을 사용합니다. </li><li> , 후드에서 자기 multistand 및 자기 열을 설정 분리기에 열을 연결하고 FACS 버퍼 2 ㎖로 열을 평형. </li><li> AspiratFACS 완충액 1 ㎖ - E 상등액 및 0.5에서 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 평형 자기 칼럼을 통해 세포 현탁액을 전달합니다. </li><li> FACS 버퍼 2 ㎖로 열 세 번 세척하고, 15 ML 튜브 (FT 분율)의 흐름을 통해 (FT)를 수집합니다. </li><li> 분리 떨어져 열을 가지고 또 다른 15 ML 튜브 (용출액 부분)에 외과 버퍼의 2 ㎖로 용출. 모든 세포는 열 떨어져 있습니다 보장하기 위해 플런저를 사용합니다. 마다 버퍼 외과의 2 mL로 용출을 두 번 더 반복합니다. </li><li> 5 분 동안 280 XG에서 용출액 스핀. </li><li> 상층 액을 제거하고 EC 미디어 10ml에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 마찬가지로 용출액 부분을 분할 (~ 6 ㎖) 10cm 젤라틴 코팅 요리에. 세 1cm 3 종양, 플레이트는 적어도 네 개의 플레이트에서 세포를 용출시켰다. 여러 판에 다른 농도 또는 플레이트가 용출 세포 (예. 0.5 ml의 1 ml의 1.5 ml의, 4 판에 용출액을 3 ml의 씨앗)을 보장하기 위하여t 적어도 하나의 플레이트는 띄엄 띄엄 용출 세포 시딩된다. (- 2.0 X 10 5 부착 된 세포 즉, 약 1.0) 첨부 된 세포의 생장이 ~ 1 %에서 다음날 있는지 확인합니다. 주 : EC 콜로니가 다른 세포 유형에 의해 오염되지 않고 형성 할 수 있도록 세포가 부족한 도금 될 필요가있다. </li><li> 한 10cm 접시에 플레이트 FT 분율은 세포가 O / N을 복구 할 수 있습니다. 다음날 컨 플루 언트 100 % - 플레이트 (80)가 있는지 확인합니다. (-80 ° C) 250 μL 세포 동결 cryotube 미디어 및 액체 질소에 보관 다음날 세포를 동결. 주 : FT 분획 나중 단계에서 및 / 또는 절연 EC 클론 EC 유전자 발현 분석을위한 음성 대조구로 종양 세포 분리를 위해 사용될 수있다. </li><li> 3 일 - 매 2 미디어를 변경합니다. 10 일 - 식민지 7 후 형성하기 시작합니다. 작은 EC의 식민지가 빠르면 접시의 바닥에 미세 팁 마커와 식민지 일 3. 표시로 식별 할 수 있습니다. </li><li> 비 특정 C를 쳤어요멸균을 200㎕ pippet 팁이 식별 된 콜로니 주변의 ELL. </li></ol> 3. 식민지 선택하여 복제의 반지 <ol><li> 3 일 - 매 2 미디어를 변경합니다. 7 일 - EC 순도는 약 5에서 LDL (DII-AC-LDL) 또한 확인할 수 있습니다. 10 ml의 EC 매체 당 LDL의 50 μl를 추가하고 3 부화 - 형광 현미경으로 세포를 확인하기 전에 4 시간. 참고 : 여러 LDL + EC 클론이 7 일 ~에서 관찰 할 수있다. </li><li> 크기가 5 ㎜ - 그들은 3의 직경에 도달하면 EC의 식민지를 수확 시작합니다. (최상의 결과를 위해 작은 LDL + 세포로 포장되어 큰 식민지를 선택합니다.) </li><li> 복제 반지, 프리 코트 0.5 % 젤라틴으로 몇 6 웰 플레이트와 EC를 수확하기 전에. 대기음 젤라틴, 각 웰에 EC 미디어 2 ㎖를 추가하고, 필요할 때까지 인큐베이터에서 접시를 유지한다. </li><li> 다른 세포 유형이 클로닝 링 내에 포획되지 않는다 확인 콜로니의 에지에 비 EC 긁어. </li><li> 사용위상차 현미경 (10X 대물 또는 4X)를 배양 접시의 바닥에 미세한 팁 마커의 개요 EC 콜로니를 포함한 영역. </li><li> PBS 10 mL로 판을 씻고 흡입 할 때 판에 PBS의 매우 얇은 층을 둡니다. (중요 : 소량 (~ 0.5 ㎖) PBS의 복제 링 절차를 수행하는 동안 살아있는 세포를 유지하는 것입니다 또한, 조직 접착제는 접착 물을 필요로한다.) </li><li> 적절한 크기의 복제 링을 선택합니다. 반지를 데리러 해부 포셉 한 쌍을 사용하여 10 μL 피펫 팁으로 균등하게 복제 링에 조직 접착제의 작은 금액을 적용합니다. 참고 : 복제 반지에 조직 접착제 (작은 반지 ~ 0.2 μl를) 최소한의 양을 사용하고 있는지 조직 접착제가 좋은 밀봉을 보장하기 위해 바닥면 주위에 균일하게 확산되어 있는지 확인합니다. 과도한 조직 접착제는 열을 생성하고 세포를 죽일 수있다 필름을 형성한다. </li><li> EC 식민지를 통해 복제 링을 놓습니다. 부드럽게 리 접착제하기 위해 복제 링을 아래로 눌러접시에 겨. 식민지가 반지를 접착하기 전에 건조되지 않도록해야합니다. </li><li> 즉시 복제 링에 효소 세포 분리 솔루션의 25 μl를 피펫과 ~ 1 분을 품어 또는 세포를 느슨하게 부착 될 때까지. </li><li> 미리 예열 EC 미디어를 포함하는 6 웰 플레이트 잘 하나에 복제 링 드롭 현명한에 피펫 세포. (중요 : 세포를 분산 할 수있는 판 흔들지 마십시오; EC 꽉 클러스터에서 성장하는 것을 선호합니다.) 50 복제 반지를 세척 - 가능한 한 많은 세포를 수집하기 위해 100 μL EC 미디어와 같은 6 자에 모든 세척을 전송 . </li><li> 10cm 접시에 일부 식민지 수확하기에 너무 작은 경우, 식민지 더 며칠 동안 성장하자, 10 ml의 신선한 미디어를 추가, 다시 복제 링 절차를 반복합니다. </li><li> 10cm 조직 배양 접시에 그들을 확장하기 전에, 6 웰 플레이트의 3 우물에 세포를 100 % 합류 및 전송 - 80까지 6 웰 플레이트에서 수확 식민지를 성장. 오염 물질의 세포를 긁어. 반복필요한 경우 - 복제 링 절차의 또 다른 라운드 (3.10 3.5 단계). 확장 할 때 - (70 % ~ 60) 상대적으로 합류 세포를 유지합니다. EC는 너무 부족한 도금 경우 성장을 중지 할 수 있습니다. </li><li> 등 외과, 염색, PCR에 의해 EC의 특징은 DIL-AC-LDL이 형광 및 외과 용 PE 또는 다른 형광 항체를 방해 할 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

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때문에 순수 차 TEC의 문화, 인간 제대 정맥 EC (HUVEC) 13 상업적으로 이용 가능한 EC 라인 또는 기본 EC와 시험관 연구에서 많은 대체 TEC를 얻기에 어려움. 그러나, 정상 조직에서 이러한 EC의 인구는 정상적인 대응에서 크게 차이가 TEC에 대한 프록시 역할을 할 수있다. 예를 들어, TEC는 생체 내에서 표현형 및 기능적 이상이며, 이러한 이상 중 일부는 체외 14-18에서 전송 가능한 수있다. TEC는 비정상적인 성장, 이동성 및 분화 능력을 가지고 용기 같은 구조 16,19,20를 형성하는 CD31 + 종양 세포를 병합 할 수 있습니다. 배양 TEC 또는 레이저 캡처 마이크로 해부 종양 혈관을 사용하여 연구는 유전자 발현, 세포 유전 학적 및 후생 유전 학적 프로파일 12,18,21-23 정상 EC에서 해당 TEC의 일탈을 증명하고있다. 과거를 통해 종양 혈...

내피 세포 (EC)는 고형 종양의 개발 과정에서 필수적이다. 보급과 먼 부위에서 전이의 파종에 휴면 종양에서 혈관 신생 스위치의 시작에서, EC는 종양 성장 1을 유지하기 위해 혈액, 산소를 공급 도관과 영양분을 형성한다. 최근에 제안 된 바와 같이, EC는 관류 독립 펑션이 암 줄기 세포 및 다른 종양 간질 세포 2-5의 성장을 지원하는 틈새를 형성한다. 따라서, 높은 종양 특이 체외 문화에 대한 EC (TEC)는 종양 혈관 신생 및 종양 세포와 혼선을 매개하는 새로운 분자 메커니즘을 밝혀됩니다 루틴 기능 연구를 허용 정제. EC는 기원 6의 조직에 따라 고도의 전문이다. 때문에 다른 종양 유형의 이질적인 성격과 종양 미세 환경에, TEC는 또한 종양 특이 전문화 O를 반영하는 고유의 기능이 표시 될 수 있습니다혈관 F. 예를 들어, 다른 유형의 종양 또는 7,8의 성적으로부터 격리 TEC에서 유전자 발현 서명에 현저한 변화가 존재한다. 그러나, TEC 비-EC,​​ 특히 종양 관련 섬유 아 세포와 종양 세포의 빈번한 공동 정화는 게놈 전체의 발현 분석을 혼동 할 수 있습니다. 이러한 원치 않는 세포 유형은 TEC 배양 시험관 팽창 장기에 의존 연구에서 특히 문제가된다. 여기에 설명이 지속적으로 종양과 다른 조직에서 순수한 EC 문화를 생산하는 고품질의 방법이다. EC의 분수와 공동 정제 비 EC의 제거의 면역 자기 열 농축에 따라, 추가 복제 링 단계 9를 사용하는 순수한 EC 식민지를 촬영합니다. 각 콜로니 비 EC 오염의 발생없이 여러 통로 용 배양에서 확장 될 수있다. 이 방법은 엔도의 연구를위한 이상적인 단일 분리 과정에서 다중 EC 클론을 수득상피 이질성. ZsGreen이 리터 / S / L 기자 마우스 문화 10 ZsGreen이 형광을 유지 &quot;운명 매핑&quot;과 지워지지 표시된 EC를 생성하기위한 유용한 도구입니다 : 또한, Cdh5 CRE는 것을 알 수있다. 프로토콜에 약간의 조정으로,이 방법은 다른 유형의 종양 또는 정상 조직에 적용 할 수 있어야합니다.

<table><tbody><tr><td>항생제-항진균제&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 Bullet Kit&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC4176</td><td>모든 구성 요소가 사용되지 않음</td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (Hyclone)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>56 &deg에서 열 비활성화; C 30분</td></tr><tr><td>동안 Nu-Serum IV</td><td>Corning</td><td>CB-51004</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBBS)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>FACS buffer&nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.22μ를 통해 필터링된 PBS에서 0.5% BSA 및 2mM EDTA; M 필터</td></tr><tr><td>75% V/V 에탄올 소독</td><td></td><td></td><td></td>용</tr><tr><td>Anti-PE 마이크로비즈&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA) 분획 V, 7.5%</td><td>Gibco</td><td>15260-37</td><td></td></tr><tr><td>세포 동결 매체 (Bambanker)</td><td>Wako Chemicals</td><td>302-14681</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 유형 II&nbsp; &nbsp;</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004176</td> HBSS Deoxyribonuclease I (DNase)<td>에서 원료 농도 2 mg/ml 제조</td></tr><tr><td>Worthington</td> <td>Biochemical</td><td>LS002004</td> PBS Dil-Ac-LDL Biomedical Technologies BT-902 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M, pH 8.0</td><td>Cellgro</td><td>46-034-CL</td><td></td></tr><tr><td>효소 세포 분리 용액 (Accutase)</td><td>에서 원료 농도 1 mg/ml 제조Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴, 물에 2%, 조직 배양 등급</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393-100ML</td><td>PBS에 희석하여 0.5% 젤라틴 용액</td></tr><tr><td>만들기 Mouse FcR 차단 시약&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>중성 프로테아제 (Dispase)</td> <td>Worthington Biochemical</td><td>LS02104</td><td>HBSS</td></tr><tr><td>PE-rat 안티 마우스 CD31 항체</td><td>BD Pharmingen 553373</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RBC 용해 완충액 (BD Pharm Lyse)</td> <td>BD Pharmingen</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>멸균 물</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0.4 %&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>10 mm 조직 배양 접시</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml 원뿔형 튜브 (sterile)</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tubes (sterile)&nbsp;</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-well 조직 배양 플레이트</td>, <td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue-dissociator tubes(gentleMACS), C 튜브)&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>세포 분리기&nbsp; (미디맥스)</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기 100 &mu; 엠&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>클로닝 링 (다양한 크기)</td><td>Bel-Art Products</td><td>378470000</td><td></td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 보드</td><td></td><td></td><td>사용 전에 75% v/v 에탄올로 살균 또는 소독하십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>펑크와 가위를</td><td></td><td></td> 해부하기 <td>전에 소독하십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>해부 핀 2"</td><td></td><td></td><td>사용 전에 살균하십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>35 &mu를 가진 FACS 관; m 필터 캡</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>필터 컵 (Stericup, 0.22 &mu; m)</td> <td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>미세 팁 마커</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈구 측정기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS 열</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>마그네틱 멀티 스탠드</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>조직 접착제 (Vetbond)</td> <td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>원심 분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>또는 15 ml 및 50 ml 원뿔형 튜브 원심분리를 위한 유사한 용량의 원심분리기</td></tr><tr><td>조직 배양 후드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>조직 해리기 (gentleMACS)</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td>조직 해리에 사용되는 프리셋 프로그램 "m_impTumor_01"</td></tr>;<tr><td>액체 질소 냉동고</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microplate 또는 Rotary shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>위상 대비 광 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

종양 특이 내피 세포의 분리 및 문화 확장

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

갓 절연 종양 특이 내피 세포 (TEC)는 종양 혈관 신생의 분자 메커니즘을 탐구 및 암에 대한 새로운 혈관 신생 억제제를 개발하기위한 시험 관내 모델로서 기능 할 수있다. 그러나 쥐의 내피 세포 (EC)의 체외 확장에 장기적으로 인해 비 EC와 표현형 문화 드리프트 (내피 - 투 - 중간 엽 전환) 및 오염에 도전한다. 이것은 쉽게 문화의 공동 정제 섬유 아 세포 또는 종양 세포에 의해 outcompeted된다 TEC 특히 사실이다. 여기서, 콜로니를 선택하여 시험 관내 확장에 결합 면역 자기 농축 활용 고음질 분리 방법이 설명된다. 이 접근법은 기질 또는 종양 세포를 오염 완전히 무료 EC 순수한 분획을 생성한다. 또한 그 혈통 추적 Cdh5의 CRE 주심 : 프로토콜 사용의 ZsGreen 리터 / S / L 기자 마우스는, 여기에 기술, 세포를 확인하는 유용한 도구입니다이 마우스에서 분리 된 EC의 식민지로 순도는 문화의 내구성과 화려한 ZsGreen이 형광을 보여줍니다.

EC는 대부분의 성인 조직 (11)의 전체 세포 인구의 작은 부분을 나타냅니다. 그것은 완전히 세포 외 기질 (ECM) 및 결합 조직에서 EC의 최대 방출을 보장 단일 세포 현탁액으로 수확 된 조직을 소화하는 것이 중요하다. 우리의 경험에 의하면, CD31 매개 면역 자기 선택은 풍부한하지만 순수한 EC의 분수를 제공하며, 따라서, 또 다른 중요한 단계는 클로닝 링 (도 1)를 사용하여 EC 콜로니의 공동 정제 EC와 비 선택 / 팽창의 물리적 제거이다. 예를 들어, EC를 CD31 농축 때하는 것이 더 식민지 선택, 비 EC 빠르게 증식과 DIL-AC-LDL +와 DII-AC-LDL에 의해 계시 된 순수 EC 문화를 생산, EC과 혼합하지 않고 도금했다 - 인구 (그림 2A) . 컬럼 용출액은 낮은 밀도로 플레이 팅 하였다 그러나, EC 콜로니 SC 제거함으로써 상대적으로 적은 비 주변 EC와 성장피펫 팁 ...

우리는 유전자 조작 마우스 모델에서 원발성 종양 특이적 내피 세포를 분리하고 배양하는 신뢰할 수 있는 방법을 보고합니다.

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

본 실험 절차의 전체적인 목표는 자기 컬럼과 클로닝 링을 사용하여 종양 내피 세포를 분리하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마우스에서 적출한 종양 조직을 소화시켜 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 두 번째 단계는 자기 비드 컬럼을 사용하여 내피 세포 집단을 농축하는 것입니다.다음으로, 클로닝 링 방법을 사용하여 혈관 내피세포 콜로니를 배양하고 선택합니다. 마지막 단계는 선택된 혈관 내피세포 콜로니를 확장하고 특성을 분석하는 것입니다. 최종적으로, 특정 혈관 내피세포 마커를 이용한 면역형광 현미경 관찰을 통해 클론 집단의 순도를 확인합니다.이 기술의 기존 방식(예: FACS sorting) 대비 주요 장점은 세포에 가해지는 자극이 더 적다는 것이며, 이를 통해 생존 가능한 혈관 내피 세포를 더 많이 회수하고 이후 콜로니 확장을 더 용이하게 할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 종양 내 혈관 내피 세포의 기능 장애가 종양 진행에 어떻게 기여하는지와 같이 종양 혈관 신생 분야의 핵심 질문들에 대한 해답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 어려움을 겪을 수 있는데, 혈관 내피 세포가 종양 미세환경의 다른 세포 유형들에 의해 빈번하게 오염되기 때문입니다. 따라서 안락사 후 배양액에서 이러한 오염 세포들을 신속하게 제거하는 세심한 주의가 필요합니다.마우스를 클린벤치로 옮기고 75% v/v 에탄올을 충분히 분사하여 복측을 소독합니다. 그다음, 적절한 무균 조작법을 사용하여 해부판 위에 마우스의 사지를 고정합니다. 복막이 손상되지 않도록 주의하며 복막을 열지 않은 상태에서 복측 중앙 절개를 실시합니다.종양이 위치한 MA 선(gland)을 향해 피부와 복막 사이를 외측으로 절개합니다. 피부와 근육을 포함한 비종양 조직을 조심스럽게 다듬어, 기억 선(memory glands)에서 종양 조직만을 절제합니다. 종양 해리를 시작하기 위해, 절제한 종양을 30 milliliters의 저포도당 DMEM(low glucose DMEM, modified eagles medium)이 들어 있는 원추형 튜브에 넣습니다.멸균된 L-G-D-M-E-M이 담긴 조직을 조직 배양 접시로 옮기고 L-G-D-M-E-M으로 1~2회 세척합니다. 세척 후, L-G-D-M-E-M 2 mL를 첨가하고 멸균 가위로 종양을 잘게 다집니다. 다져진 종양에 collagenase 5 mL, disc pace 1 mL, deoxy rib

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)은 혈관 항상성 및 수리를 공부하는 유망 도구입니다.

분리 및 성인 인간 내피 콜로니 형성 전구 세포의 대규모 확장

여기, 우리는 murine 폐동맥 내피 세포의 격리와 문화 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 정비사 및 효소 폐 조직 분리뿐만 아니라 안티 - PECAM - 1과 대부분 microvascular 원산지 순수한 내피 세포 인구를 생산 자성 비즈에 복합 백신 ICAM - 2 항체를 사용하여 2 단계 정화 과정으로 구성됩니다.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

간단한 방법은 관련 상피 세포에서 조직 섬유아 세포의 효과를 분석하는 설명되어 있습니다. 이 방법과 3 차원 조직 배양의 결합 차원에서 고립 후 세포의 분석을 용이하게하실 수 있습니다. 기술은 종양 세포에서 종양 - 관련 기질의 효과를 체계적으로 연구를 허용, 악성 잠재력을 변화의 세포에 적용됩니다.

세 가지 차원 혼합 셀 회전 타원체 공동 문화에서 Mammary 상피 세포의 분리

테스트 시스템으로 인간의 3D 종양 조직을 만들 수있는 방법이 설명되어 있습니다. 이러한 기술은 decellularized 생물 혈관을 비계 (BioVaSc), 인간의 기본 세포와 흐름 생물 반응기의 동적 조건에서뿐만 아니라 정적에서 배양 할 수있는 종양 세포 라인을 기반으로합니다.

인간의 3 차원의 조직 공학<em&gt; 시험관</em&gt; 종양 테스트 시스템

기본 세포 배양은 특히 특정 발달 단계에서 유전자 변형 마우스 배아에서 세포의 특정 인구를 분석하기위한 유용한 기술이다. 여기서, 배아 심실는 해부와 해리, 항체가 결합 된 구슬 인식하고 자세한 분석을 위해 내피 세포를 분리한다.

배아 심실 내피 세포의 분리

이 비디오 10-12 일 이내에 배아 전뇌에서 내피 세포의 순수 문화의 준비를위한 간단하고 신뢰할 수있는 전략을 설명하고 뇌 혈관의 여러 측면에 초점을 맞춘 연구를 위해 도움이 될 것입니다.

배아 전뇌에서 내피 세포의 분리 및 문화

종양 개시 세포(TIC)는 재발성이 높고 치명적인 질병인 난소암 치료를 위한 실행 가능한 치료 표적이 될 수 있습니다. 우리는 이 고도의 종양 형성 세포 집단을 풍부하게 하는 배양 조건에 대한 프로토콜을 제시합니다.

난소 암 종양 시작 세포의 생체 농축에

이 프로토콜의 목표는 내 피 뿌리 탯 줄 혈액에서 세포를 분리. 조직 설계 만드는 혈관 및 심장 밸브 구성 및 응용 프로그램의 일부는 biomarker로 심혈 관 위험, 허 혈 성 질환 치료 환자를 식별 하는 데 이러한 세포를 사용 하 여 포함 됩니다.

인간 탯 줄 혈액에서 내 피 조상 세포의 고립

종양 내 피 세포는 종양 microenvironment의 중요 한 결정 요인 및 질병의 과정. 여기, 인간 대 장 암 및 마약 테스트 및 병 인 연구에 사용 될 일반 콜론에서 순수 하 고 가능한 내 피 세포의 고립에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

정상적인 대 장 암과 대 장 암-향상 된 프로토콜에서 인간의 내 피 세포의 고립

우리는 정맥 기형의 뮤린 xenograft 모형을 생성하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 본 모델은 하이퍼 활성화 TIE2 및/또는 PIK3CA 유전자 돌연변이를 포함하는 환자 유래 내피 세포의 피하 주입을 기반으로 한다. Xenograft 병변은 VM 환자 조직의 조직 병리학적 특징을 밀접하게 재구성합니다.

정맥 기형에 대한 환자 유래 제노이식 모델

신생아 쥐 뇌 조직에서 뇌 미세혈관 내피세포(BMECs)를 분리하고 1차 배양하여 생리적 및 병리학적 조건에서 혈액-뇌장벽 기능을 연구할 수 있는 견고한 시험관 내 모델을 생성하는 프로토콜을 제시합니다.

마우스 뇌 미세혈관 내피세포의 분리 및 배양

배우세요 종양 특이 내피 세포를 자기성 구슬 컬럼과 클로닝 링을 사용하여 분리하고 배양하는 방법을. 이 기술은 높은 순도와 생존율을 제공하여 종양 혈관 생성 연구에 활용됩니다.

종양 특이 내피 세포의 분리 및 문화 확장

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