Name: 용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법에 의해 생체막 제작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 배우세요 용매 보조 지질 이중층 방법으로 고체 기판 위에 지지된 생체막을 제작하는 기술을. 형광 현미경과 석영 결정 미세저울을 활용하여 막의 유동성과 콜레스테롤 함량을 정량 분석하고, 약물 발굴 및 분자 진단 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 NJC에 국립 연구 재단 (NRF -NRFF2011-01과 NRF2015NRF-POC0001-19), 국립 의료 연구위원회 (NMRC / CBRG / / 2012 0005), 그리고 난양 기술 대학에서 지원을 인정하고자하는

친수성 고체 지지체에 지원되는 지질 이중층 1. 형성 <ol><li> 10 ㎎ / ㎖의 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 지질 스톡 용액을 제조 (DOPC) 1 ㎎ / ㎖의 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- N - (리사 민 로다 민 B 각 지질 분말을 용해시켜 술 포닐) (RH-PE)는 (적절히 이소프로판올 용액의 분석 질량 균형)을 미리 칭량. </li><li> 희석하고, 최종 농도 원하는 지질 혼합물을 제조하기 위해 이소프로판올 스톡 용액을 혼합한다. 형광 현미경 및 FRAP 실험, 0.5 중량 % RH-PE는 지질 혼합물을 포함한다. </li><li> 이 채워질 때까지 미세 유체 채널로 이소프로판올 지질 혼합물을 주입한다. </li><li> 약 10 분 동안 유리 표면에 지질 혼합물을 배양한다. </li><li> 서서히 매우 낮은 유속으로 연동 펌프를 사용하여 물 또는 완충액과 지질 용액을 대체(10 ~ 50 μL / 분). 또한, 반복 피펫에 의한 지질 혼합물을 교체합니다. </li><li> 잔류 이소프로판올을 제거하기 위해 과량의 완충액으로 철저하게 채널을 헹군다. </li></ol> 콜레스테롤이 풍부한 지원 막 2. 형성 참고 : 고체 표면 (SiO2를하면) 소포 융합을 지원하지만 콜레스테롤이 풍부한 소포는 높은 강성 (30) 굽힘 때문에 막 조성 (고 콜레스테롤) 소포 융합을 억제한다. <ol><li> 제 이소프로판올 각 분말을 용해시켜 10 ㎎ / ㎖의 DOPC 지질, 10 ㎎ / ㎖ 콜레스테롤, 1 ㎎ / ㎖ RH-PE를 함유하는 스톡 용액을 제조 하였다. </li><li> 반복 2.1 단계에서 제조 된 원액을 사용하여 1.2-1.6 단계를 반복합니다. </li></ol> 3. 막 유동성 분석 <ol><li> 10 분 동안 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) 용액 (1 %)의 유리 슬라이드를 담근다. </li><li> 탈 이온수로 철저하게 슬라이드를 세척하고 재치 린스시간 에탄올. </li><li> 불어 건조 질소의 부드러운 흐름을 사용하여 슬라이드를. </li><li> 산소 플라즈마 챔버에서 최대 무선 주파수 전력에서 30 초 동안 산소 플라즈마에 노출 슬라이드. </li><li> 밑 상업 미세 유체 챔버 (그림 1A)의 보호 필름 코팅 트위터를 사용하여 제거하고 챔버 (그림 1B)의 접착면에 유리 슬라이드를 연결합니다. </li><li> 챔버의 입구와 출구의 위치에 커넥터와 튜브를 조립하고 현미경 단계 (그림 1C)에 미세 유체 채널을 배치합니다. </li><li> 미세 유체 채널의 형광 표지 된 지원 지질 이중층 형성 [바람직한 지질 조성물을 사용하여 반복 스텝 (1) (예, 0.5 ㎎ / ㎖ DOPC) 0.5 중량 % RH-PE 유기 용매를 포함]. </li><li> 이미지를 캡처하기 위해 60X 기름 침지 목표 (NA 1.49)와 이중층 평면을 찾습니다. </li><li> 두 사전 표백제 이미지를 가지고, 다음 (30) 사진 - 표백1, 532 nm의, 100 mW의 레이저 빔으로 넓은 원형의 자리를 해요. 그 강도가 안정 될 때까지 photobleaching에 전에 레이저를 따뜻하게. photobleaching에 바로 후 표백 지점에서 형광 강도의 복구를 수행하기 위해 2 분 동안 1 초마다 일련의 이미지를 캡쳐. </li></ol> 4. 콜레스테롤 정량 분석 <ol><li> 산소 플라즈마 챔버에서 최대 무선 주파수 전력에서 30 초 동안 산소 플라즈마에 실리콘 이산화물 코팅 된 석영 결정 센서 칩을 노출. 챔버로부터 칩을 분리하고 즉시 측정 챔버에 칩을 마운트. </li><li> 실험 전에 먼저 적정 부착을 보장하기 위해 공중에 센서 칩의 주파수 및 분산을 획득. <ol><li> 상업 Q 감지 E1 또는 E4 QCM-D 악기를 들어, Q-소프트 소프트웨어 프로그램을 실행하고 &quot;취득&quot;버튼을 클릭 &quot;설정 측정&quot;을 선택합니다. </li><li> 표시되는 새 창에서, 3, 5, 7을 확인, 9, 11, 13 배음 다음 찾기 및 공명 스펙트럼을 확인하기 위해 실행을 클릭합니다. (24)에서 온도를 설정 기음. 하나 또는 그 이상의 공진 주파수가 예상 된 값과 일치하지 않는 경우, 칩 탑재를 확인하고 합의에 도달 할 때까지이 과정을 다시 수행한다. </li></ol></li><li> 연동 펌프를 시작하고, 100 μL / 분의 유속으로 상기 측정 챔버 내에 완충액 (10 mM 트리스, 150 mM의 염화나트륨, pH를 7.5)를 흐른다. </li><li> 소프트웨어 프로그램에서 &quot;취득&quot;버튼을 클릭 공진 주파수와 에너지 소비 신호를 기록하기 위해 &quot;다시 측정&quot;을 선택합니다. 안정된 기준은 주파수와 소비 변화에 대해 얻을 때까지이 단계를 반복합니다. 참고, 시간의 함수로서 기록 될 수있는 추가 주파수 및 소산 교대있을 것이다 이하 단계는. </li><li> 10 분 동안 (지질 제외) 이소프로판올을 주입한다. </li><li> DOPC에서 지질 / 콜레스테롤 혼합물을 주입10 분간 이소프로판올에 0.5 ㎎ / ㎖의 총 지질 농도와 원하는 몰비. </li><li> 100 μL / 분의 유속으로 20 분 동안 버퍼를 주입. </li><li> 버퍼 (레이트 100 μL / 분으로 흐름) 주파수 신호가 안정된 값에 도달 할 때까지 준비 1mM의 메틸 - β - 시클로 덱스트린 (MβCD)의 용액을 주입한다. </li><li> MβCD 처리 공정에 의해 야기되는 상대적으로 양의 주파수 변화를 측정하고 [ΔM = 사우어 브레이 식을 이용하여 질량 값 Δf에 CHO 및 Δf에 DOPC 값을 변환하여 콜레스테롤 및 DOPC 지질의 질량을 계산 - (C / N) × ΔF, 여기서 C = 17.7 NG / cm 2, N : 상음]. </li><li> 고려 DOPC 지질 (786.1 g / mol) 및 콜레스테롤 (386.6 g / 몰)의 분자량을 가지고, SLB 콜레스테롤의 몰분율을 계산한다. </li></ol>

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</ol>

저자는 공개할 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.

이 작업에서, 용제 - 교환 프로토콜은 고체 지지체에 배양 알코올 (이소프로판올, 에탄올 또는 n- 프로판올)에있는 지질로 표시 한 후 알코올 시리즈를 구동하기 위해 수성 완충액으로 점차 대체 위상 천이 결국 라멜라 상 지질 이중층 (24)의 제조. 이 방법은 소포 융합 방법에 난치성 인 금,은 등의 표면에 담지 된 지질 이중층의 제조를 가능하게하는 것이 도시되어있다. 최적의 지질 농도 범위 (0,1 - 0,5 ㎎ / ㎖)는 지금까지 시험 표준 실험에서 완전한 포맷 이중층 형성을 위해 결정되었다. 이중층의 0.1 ㎎ / ㎖, 이산 미세한 패치 아래 지질 농도로 형성했다. 한편, 0.1 ㎎ / ㎖ 이상의 농도에서 및보다 낮은 0.5 ㎎ / ㎖, 완전하고 균일 이중층이 형성된다. 이 범위보다 지질 농도, 유체 이중층 여전히 검증기로 형성 하였다FRAP 분석하여 에드 그러나, 형광 현미경은 이중층 위에 추가적인 지질 구조의 존재를 드러낸다. QCM-D 분석에 의해 결정되는 바와 같이 현저하게, 이러한 추가 지질 구조체의 형태는 배양 단계 동안 사용 된 알코올에 의존. 에탄올의 경우, 상대적으로 높은 F Δ와 Δ D 변화는 흡착 층 소포 얻어 QCM-D 서명을 닮은. 이소프로판올 또는 n- 프로판올 대신 사용한 경우 Δ D가 상당히 높았다, Δ의 F는, 이중층 (-30 Hz에서 -40 사이의 최종 Δ F)에 대한 기대 값보다 약간 높았다. 이러한 QCM-D 응답은 (어떤 경우에는 형광 현미경으로 보이는)을 막 표면으로부터 외측으로 돌출되어 연장 된 지질 구조체 (예를 들어, 웜 형상 미셀)을 위해 예상된다. 용매의 환율은 ESPEC, 중요 할 수있는 또 다른 중요한 변수이다낮은 지질 농도 (예, 0.1 ㎎ / ㎖)을 사용하는 경우 ially. 낮은 지질 농도의 빠른 용매 교환은 불완전 이중층의 형성으로 이어질 수 있습니다. 본 논문에서는 QCM-D 측정치 (Q 감지 E4 측정 챔버), 약 100 μL / 분의 유동 속도를 위해 사용되는 표준 측정 챔버 내에, 높은 재현성 완전한 이중층 형성에 적합 하였다. 다른 형상 및 부피 유동 세포, 최적의 유량은 변할 수 있고, 본 명세서에서 제안 된 실험적 단계에 기초하여 결정되어야한다. 소포 융합 난치성이다 표면에 담지 된 지질 이중층을 형성 할뿐만 아니라, SALB시켜 복합 조성물 지원 막의 제조의 문을 열고, 파열 수 지질 소포에 대한 필요성을 회피하는 데 사용될 수있다. 예시 조성물로서, 콜레스테롤의 높은 비율과 지질의 혼합물을 조사 하였다. 콜레스테롤 mamm의 중요한 구성 요소알랸 세포막, 및 분획 (적혈구, 예), 막 지질 조성의 45 ~ 50 몰 %에 접근 할 수있다. 따라서, 인간 세포막을 나타내는 지질 이중층 심지어 간단한 모델은 콜레스테롤을 포함한다. 소포 융합은 10-15 %의 콜레스테롤을 함유하는 유체의 지질 이중층을 제조하는데 사용될 수 있지만 36 (QCM-D의 측정에 의해 정량으로, 57 몰 % 이하), SALB 방법은 콜레스테롤이 높은 분획을 함유하는 유체의 지질 이중층의 형성을 가능하게한다. 콜레스테롤의 수준이 더 (63 몰 % 이하) 승온 그러나, 스트라이프 형상 영역 (37)을 관찰 하였다. 공존 도메인은 공기 - 물 계면에서 콜레스테롤 / 인지질 단층의 상태도에서 β 영역에서 관찰되는 연상 액체였다. 전체적으로 SALB 방법은 내가 특히, 지원되는 지질 이중층을 형성하는 간단하고 효율적인 방식으로 도시되어있다종래 소포 융합 방법의 범위를 벗어나는 경우, N. 지금까지 QCM-D 기술과 형광 현미경 주로 SALB 법에 의해 형성된지지 지질 이중층을 특성화하기 위해 사용되었다. 기대, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) (38), 원자력 현미경 (AFM) (39, 40)를 포함하여 표면 성 분석 측정 기법의 넓은 범위가, 적외선 분광기 (41)를 푸리에 변환, X 선 (42) 및 중성자 반사율 43 수 상기 특성화 및 단순 및 복합 이중층 구성 SALB 방법에 의해 제조 연구하는 데 사용할. 이 새로운 기능은 간단하고 강력한 실험 프로토콜을 이용하여 인공 세포막을 탐색 할 수 있습니다 과학자의 더 많은 수의 문을 엽니 다.

고체지지 지질 이중층 1 (SLB)은 이러한 이중층 두께, 이차원 확산 지질 및 막 - 관련 생체 분자를 호스팅 할 수있는 능력으로 생체막의 기본 특성을 보존 다목적 플랫폼이다. 자연적인 세포막의 복잡성이 간단한 플랫폼 (3), 바이러스 및 바이러스 유사 입자는 4,5- 결합을 결합 등 뗏목 형성 2 단백질로서 세포막 관련 프로세스의 시험 관내 연구를위한 효율적인 플랫폼으로서 기능하는 것으로 나타났다 및 셀 (6) 신호. 고체 지지체에 근접하여 형성된, SLB 플랫폼은 전반사 현미경 (TIRF), 수정 진동자 마이크로 밸런스 방산 (QCM-D), 및 임피던스 분광법으로 표면 성 측정 기술의 범위와 호환된다. 몇몇 방법은 기포를 포함 SLB 수의 다른 유형을 생성하기 위해 개발되어왔다서브 마이크론 크기의 지질 명소에 대한 붕괴 7 딥 - 펜 나노 리소그래피 (8), 스핀 코팅 이중층 스택과 랭 뮤어 - 블로 젯 (LB) (10) 및 풀 스패닝, 하나의 지질 이중층 코팅 소포 융합 (VF) 11 9. VF 방법은 연속 지질 이중층을 형성하도록 고체 지지체 이후 자발 파열과 융합 소형 단일 층 소포 흡착 이루어져있다. 그러나, 생리 학적 조건 하에서 자발적 소포 파괴는 주로 이산화 규소, 유리, 운모 등의 실리콘계 재료로 한정된다. 또한, 소포 파열은 콜레스테롤 또는 음으로 하전 된 지질의 높은 분획을 함유하는 것과 같은 복잡한 지질 조성물의 소포에 대해 자발적으로 발생하지 않는다. 시스템에 따라, 소포 파열은 또한 온도 12 용액의 pH를 13, 14 및 염분, 삼투압 충격 (15)와 같은 실험 조건을 조정하여 유도 될 수있다 </s압력 (16), 또는 칼슘과 같은 가의 이온 첨가 닫&gt; 또는 (17). 대안 적으로, 막 - 활성 AH 펩티드의 범위에 소포 파열 이중층 형성 선도 흡착 소체 층을 불안정하게하기 위해 도입 될 수있다 18-22면. 또한, 성공적인 이중층 형성 시간과 특정 막 조성물을 달성하기 어려울 수있다 소형 단일 층 소포 잘 조절 집단의 제조를 필요로한다. 따라서, 최적의 경우에 높은 효율에도 불구하고 (예를 들면, 소체 (23)의 동결 - 해동 광범위한 전처리 후), 소포 융합의 일반적인 애플리케이션은 적절한 기판과 막 조성물의 범위에 의해서만 한정된다. 용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법 24-28 지질 소포를 필요로하지 않는 다른 제조 기술이다. 이 방법은 증착 O에 기초SLB 형성을 유발하기 위해 수성 완충액이 용매의 점진적인 교환 하였다 수혼 화성 유기 용매의 존재하에 고형 표면 상 F 지질 분자. 용매 교환 단계, 지질, 유기 용매의 삼원 혼합물, 및 물 중에 벌크 용액 라멜라 상 구조 형성 및 고체 기판에 SLB 리드 물 분율 증가와 직렬 위상 천이를 겪는다. 중요한 것은,이 자기 ​​조립 행은 일반적으로 흡착 SLB 소체의 변환을위한 제한 단계이다 소포 파열에 대한 요구를 무시. 프로토콜은 이산화 규소, 산화 알루미늄, 크롬, 인듐 주석 산화물, 및 금을 포함하여 다양한 표면에 적용될 수있다. 본 논문에서는 첨부 영상에서 SALB 및 소포 융합 방법에 의해 지질 침착의 비교를 제시한다. 특히, 실험적인 매개 변수의 영향을 포함한 지질 농도, 유량 및 SALB 방법에 의해 형성된 이중층의 품질에 수혼 화성 유기 용매의 선택은, 논의된다. 제작 SLB 수의 분석 특성화 (FRAP) 기법 photobleaching에 후 QCM-D, 형광 현미경, 형광 회복에 의해 수행된다. QCM-D 모니터링 켈러와 Kasemo (29)에 의해 수행 된 선구적인 작업부터, 광범위하게 정량적으로 이중층 형성을 조사하기 위해 사용 된, 표면에 민감한 질량 측정 기술이다. 형광 현미경은 막 균일 성 검사뿐만 아니라 멤브레인 도메인의 시각화를 허용한다. FRAP 기술은 유체 막의 필수 속성 인 SLB, 지질 분자의 측방 이동을 결정하는 표준 도구이다. 본 연구의 첫 번째 부분은 실리콘 이산화물과 금에 이중층을 형성하도록 시도인가 SALB의 QCM-D 분석과 소포 융합 방법을 포함한다. 두 번째 부분에서는,준비 및 SALB 법 콜레스테롤 농도 범위를 함유하는지지 막의 특성이 입증되고, 결과는 소포 융합 방법에 의해 수득 된 것과 비교한다.

<table><tbody><tr><td>QCM-D 이산화규소 코팅 기판</td><td>QSense AB,&nbsp; </td><td></td><td></td>스웨덴</tr><tr><td>QCM-D 금 코팅 기판</td><td>QSense AB,&nbsp; </td><td></td><td></td>스웨덴</tr><tr><td>Q-Sense E4 모듈</td><td>QSense AB,&nbsp; </td><td></td><td></td>스웨덴</tr><tr><td>플라즈마 클리너, PDC-32G</td><td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td><td>PDC-001 (115V)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)</td><td>Avanti 극성 지질</td>: <td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-<>N-(리사민 로다민 B 설포닐), (암모늄염), (Rh-PE)</td><td>Avanti 극성 지질</td>, <td>810150P</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>, Avanti 극성 지질</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>메틸-&베타;-사이클로덱스트린</td><td>시그마&nbsp;</td><td>C4555</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>시그마&nbsp;</td><td></td><td></td>673773</tr><tr><td>에탄올</td><td>시그마&nbsp;</td><td></td><td></td>459844</tr><tr><td>n-프로판올</td><td>시그마&nbsp;</td><td></td><td></td>279544</tr><tr><td>스티커 슬라이드 I 0.1 Luer</td><td>IBIDI</td><td>81128</td><td></td></tr><tr><td>수 팔꿈치 1/8 "</td><td>Cole-Parmer</td><td>30505-70</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 튜빙 1.6&#160; mm ID</td><td>IBIDI</td><td>10842</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립 번호 1.5H, 25mm x 75mm</td><td>IBIDI</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Reglo Digital M2-2/12 연동 펌프</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데실 설페이트</td><td>시그마&nbsp;</td><td>71725</td><td></td></tr></tbody></table>

용매를 이용한 지질 이중층 (salb) 방법에 의해 생체막 제작

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

세포막을 모방하기 위해,지지 지질 이중층 (SLB)는 고체 기판에 biofunctionality 생체 적합성을 부여하면서 막 - 관련 프로세스의 체외 조사 가능 매력적인 플랫폼이다. 인지질 소포체의 자발적 흡착 및 파열 SLB 수를 형성하는 가장 일반적으로 사용되는 방법이다. 그러나, 생리 학적 조건 하에서, 소포 융합 (VF)는 지질 조성물 및 고체 지지체의 서브 세트로 제한된다. 여기서는 소체를 필요로하지 않는다 SLB 수를 형성하기 위해서 용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 형성 방법이라고 한 단계 반응 절차를 설명한다. SALB 방법은 SLB 형성을 유발하기 위해 수혼 화성 유기 용매 (예 : 이소프로판올) 및 수성 완충 용액으로 교환 후속 용매의 존재하에 고형 표면에 지질 분자의 침착을 포함한다. 연속 용매 교환 단계의 적용을 가능하게모니터링 이중층 형성 및 표면 성 바이오 센서의 넓은 범위를 사용하여 후속의 변경에 적합한 관류 구성 방법. SALB 방법은 소포 융합되는 난치성 포함한 친수성 ​​고체 표면의 광범위한 SLB 수를 제조 할 수있다. 또한, 소포 융합 방법을 사용하여 제조 할 수없는 지질 조성물로 이루어지는 SLB 수의 제조를 가능하게한다. 여기서, 우리는 두 가지 예시 친수성 ​​표면, 이산화 규소 및 골드 SALB 종래 소포 융합 방법으로 얻어진 결과를 비교. SALB 방법을 통해 제조 된 고품질의 이중층의 제조를위한 실험 조건을 최적화하기 위해, 성막 공정에서의 유기 용제의 종류, 용매 교환의 속도 및 지질 농도를 포함하는 다양한 파라미터의 효과가 해결 정보와 함께 논의 . 콜레스테롤이 높은 분획을 함유하는지지 막의 형성도이다 귀신막 구성의 광범위한 SALB 기술의 기술 능력을 강조 SALB 방법으로 보이는 것.

우리는 지질 소포를 사용하지 않고 고체 기판 상에지지 지질 이중층을 형성하는 실험 프로토콜을 제시한다. 우리는 다양한 생물학적 응용을위한 콜레스테롤이 풍부한 도메인과 지질 이산화 규소 및 골드 이중층뿐만 아니라지지 막을 형성하는 하나의 단계 방법을 보여준다.

용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법에 의해 생체막 제작

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

본 절차의 전반적인 목표는 용매 보조 지질 이중층법을 통해 지지막을 제작하는 것입니다. 이 방법은 지질과 막 단백질의 기본 특성을 이해하는 것과 같이 막 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 신약 개발 및 분자 진단과 같은 응용 분야를 가능하게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 기존 방법으로는 불가능한 경우가 많은 여러 층의 지지 지질을 층별로 제작할 수 있다는 점입니다.본 절차는 사용법이 간단하며 최소한의 시료 준비만을 필요로 합니다. 이 기술은 막단백질과 같은 중요한 약물 표적을 연구할 수 있게 하므로, 치료 및 진단 분야까지 그 영향이 확대됩니다. 또한, 이 방법은 재료 과학 응용을 위한 생체 적합성 기판을 제작하는 데에도 사용될 수 있습니다.우리는 기존의 막 제작 방법의 어려움에 대해 논의하던 중, 우리 연구실의 대학원생들이 이 절차를 쉽게 배울 수 있도록 하는 방법을 고안하게 되었습니다. 먼저 lipid powder를 isopropanol 용액에 녹여 10 mg/mL 농도의 DOPC lipid 스톡 용액을 준비합니다. 그다음, rhodamine으로 라벨링된 DOPE lipid powder를 Isopropanol 용액에 녹여 1 mg/mL 농도의 lipid 스톡 용액을 제조합니다.형광, 현미경 관찰 및 광퇴색 후 형광 회복(FRAP) 실험에 필요한 최종 농도로 지질 혼합물을 준비하기 위해 Isopropanol에 있는 스톡 용액을 희석하고 혼합합니다. 이때 지질 혼합물에 0.5 weight percent의 R domine 표지 DOPE가 포함되어야 합니다. Isopropanol에 녹인 지질 혼합물을 미세유체 채널이 가득 찰 때까지 주입합니다. 지질 혼합물을 유리 표면 위에서 약 10분 동안 배양합니다.염 교환은 매우 낮은 유속에서 수행해야 하며, 그렇지 않으면 이중층의 품질이 낮아집니다. 연동 펌프를 사용하여 매우 낮은 유속으로 지질 용액을 물 또는 완충 용액으로 서서히 교체하십시오. 그런 다음, 콜레스테롤이 풍부한 지지 막을 형성하기 위해 과량의 완충액으로 채널을 충분히 헹구어 잔류 이소프로판올을 제거하십시오.먼저 각 분말을 이소프로판올에 녹인 다음, 이전과 동일한 프로토콜을 반복하여 막 유동성 분석을 수행함으로써 DOPC, 지질 콜레스테롤 및 rho domine, DOPE 지질이 포함된 스톡 용액을 준비합니다. 먼저 유리 슬라이드를 1% sodium ESAL sulfate 용액에 10분 동안 담급니다. 그런 다음 슬라이드를 탈이온수로 충분히 세척하고 에탄올로 헹굽니다.완만한 질소 기류를 이용하여 슬라이드를 건조시킵니다. 그런 다음 산소 플라스마 챔버 내에서 최대 무선 주파수 출력으로 30초 동안 슬라이드를 산소 플라스마에 노출시킵니다. 이어서 핀셋을 사용하여 바닥이 없는 상용 미세유체 챔버의 보호 필름 코팅을 제거하고, 유리 슬라이드를 챔버의 접착면 위에 부착합니다.커넥터와 튜빙을 챔버의 입구 및 출구 위치에 조립하고, 미세유체 채널을 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 앞서 수행한 것과 동일하게 0.5 중량 퍼센트의 rho domine이 포함된 표지된 DOPE Lipid 무기 용매를 포함하여 원하는 지질 조성을 사용하여 미세유체 채널 내에 형광 표지된 지지 지질 이중층을 형성합니다. 다음으로, 60 x 오일 침수 렌즈를 사용하여 이중층 평면의 위치를 찾습니다. 이미지를 캡처하기 위해, 우선 광퇴색 전의 프리블리치(preble) 이미지 두 장을 촬영합니다.레이저 강도가 안정될 때까지 예열합니다. 그 다음 532 nanometer 100 milliwatt 레이저 빔을 사용하여 30 micron 너비의 원형 지점을 광탈색합니다. 광탈색 직후에콜레스테롤 정량을 수행하기 위해 탈색 지점의 회복 및 형광 강도를 추적할 수 있도록 2분 동안 1초마다 일련의 이미지를 캡처합니다. 먼저, 산소 플라즈마 챔버 내에서 최대 무선 주파수 전력으로 30초 동안 이산화규소 코팅 석영 결정 센서 칩을 산소 플라즈마에 노출시킵니다. 챔버에서 칩을 꺼내 즉시 측정 챔버에 장착합니다. 본 실험에서는 Q Sense E4A 4채널 석영 결정 마이크로 밸런스가 사용되었습니다.적절한 장착을 보장하기 위해 센서와 공기의 주파수 및 소산 인자를 측정합니다. 이를 위해 qof 소프트웨어 프로그램을 실행합니다. acquisition을 클릭하고 새 창에서 setup measurement를 선택한 다음, 3 5 7 9 11 및 13 배음을 확인합니다.그런 다음 find 및 run을 클릭합니다. 공명 스펙트럼을 확인하려면 온도를 24 °C로 설정하십시오. 적절한 장착이 완료되면, 연동 펌프를 가동하여 측정 챔버로 완충 용액을 100 µL/min의 유속으로 흘려보내고, 소프트웨어 프로그램에서 acquisition을 클릭한 후 restart measurement를 선택하여 공명 주파수와 에너지 소산 신호를 기록합니다.주파수 및 소산 변화에 대해 안정적인 기저선이 얻어질 때까지 이 단계를 반복하십시오. 지질이 포함되지 않은 isopropanol을 10분 동안 주입하십시오.이어서 원하는 몰비의 DOPC 지질 및 콜레스테롤 혼합액(이소프로판올 내 총 지질 농도 0.5 mg/mL)을 10분 동안 주입합니다. 다음으로, 100 µL/min의 유량으로 버퍼를 20분 동안 주입합니다. 그 후, 주파수 신호가 안정된 값에 도달할 때까지 버퍼로 조제한 1 mM methyl beta cyclodextrin 용액을 주입합니다.메틸 베타 사이클로덱스트린 처리 단계로 인해 발생하는 상대적 양의 주파수 이동을 측정하고, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 콜레스테롤과 DOPC 지질의 질량을 계산하십시오. 그런 다음 DOPC 지질과 콜레스테롤의 분자량을 고려하여 지지 지질 이중층 내 콜레스테롤의 몰 분율을 계산하십시오. 여기에는 SAL 방법을 통해 유리 표면 위에 형성된, 0.5 중량 퍼센트의 루민으로 표지된 DOPE 지질을 포함하는 DOPC 지질 이중층의 대표적인 형광 현미경 이미지가 제시되어 있습니다.광퇴색 후 형광 회복 실험 결과, 형광이 거의 완전히 회복되어 지질 이중층의 측면 유동성이 있음이 나타났습니다. 여기에서는 지지 이중층 형성에 따른 주파수 및 소산 변화의 대표적인 QCMD 곡선을 보여줍니다. SAL 방법을 사용하여 최종 공진 주파수 변화와 소산 변화를 달성하였으며, 이는 평면 이중층이 성공적으로 형성되었음을 나타냅니다.본 기술은 적절하게 수행될 경우 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 용매 보조 지질 이중층법(solvent assisted lipid bilayer method)을 이용한 지지 바이오 막 제작 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도할 때, 실험 전에 신선한 지질 용액을 준비하고, 사용자의 실험 설정에 따라 용매 교환 속도를 최적화하는 것이 중요하다는 점을 유념하십시오. 본 절차 이후에는 막 도메인 형성 등 추가적인 질문을 해결하기 위해 원자간력 현미경(Atomic force microscopy)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

biomembrane-fabrication-solvent-assisted-lipid-bilayer-salb

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오에서는 전반사 형광 현미경을 사용하여 유리로 지지된 지질 이중층의 체외에서 셉틴 조직을 조사하는 절차를 보여줍니다.

Planar Supported Lipid Bilayer Assay: 생물학적 막 모방체에 대한 셉틴 어셈블리를 조사하기 위한 현미경 기반 체외 기술

이 비디오는 지질 이중층으로 코팅된 미세구에서 셉틴 단백질 어셈블리를 연구하는 기술을 설명합니다. 이 기술은 곡면에 있는 단백질의 곡률 의존적 어셈블리를 이해하는 데 도움이 됩니다.

Spherical Supported Lipid Bilayer Assay: 마이크로스피어에서 Septin 어셈블리를 관찰하는 기술

지원되는 지질 이중층과 천연 막 입자는 세포막의 특성을 근사 할 수 있고 분석 다양한 전략에 통합 될 편리한 시스템이다. 여기에서 우리는 지원 지질 이중층 코팅 된 SiO2로 비즈, 인지질 막 소포 또는 천연 입자로 구성된 마이크로 어레이를 제조하는 방법을 보여준다.

스퀴지 기반의 조립 방법과 생체막 마이크로 어레이의 형성

단백질 기능화 평면 유리 지지 지질 이중층의 준비, 내 단백질 이동성 측정 및 단백질 밀도 측정이 여기에 나와 있습니다. 노이즈를 줄인 내부 전반사(Total Internal Reflection) 현미경을 구축하기 위한 로드맵이 요약되어 있으며, 이를 통해 높은 시공간 해상도로 단일 이중층 상주 형광 색소를 시각화할 수 있습니다.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

우리는 보유, 수송 지질 이중층 형성 시스템을 보여준다. 냉동 막 전구체는 상온 상태로 전환하면 지질 이중층 막을 80 % 성공률 1 시간 내에 형성 될 수있다. 이 시스템은 이온 채널과 관련된 힘드는 과정과 전문​​ 지식을 줄일 수 있습니다.

폴리 디메틸 실록산 박막을 사용하여 자동화 지질 이중층 제막

우리는 유체 지질 이중층에 둘러싸여 나노 단백질 패치 유리를 기능화하는 프로토콜을 제시한다. 이 기판은 첨단 광학 현미경과 호환 및 세포 부착 및 이동 연구를위한 플랫폼 역할을 할 것으로 예상된다.

지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열

미토콘드리아 융합은 미토콘드리아 역학의 근본적인 중요한 정동성 반응입니다. 여기에 설명된 시험관 내 재통합 시스템은 막 테더링, 도킹, 혈전 및 모공 개방을 해결할 수 있는 미토콘드리아 내막 융합을 연구한다. 세포막 시스템을 탐구하는 이 접근의 다양성은 토론됩니다.

미토콘드리아 멤브레인 역학 을 재구성하기위한 모델 멤브레인 플랫폼

이 프로토콜은 유니 지질 및 다중 지질 소포, 지원지질 이중층 및 일시 중단 된 지질 이중 층을 모방 하는 세포의 형성을 설명 합니다. 이러한 체외 모델은 다양한 지질 유형을 통합하도록 조정할 수 있으며 다양한 분자 및 거대 분자 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

무세포 재구성은 세포 골격 어셈블리를 이해하는 핵심 도구였으며, 지난 십 년 동안의 연구는 최소한의 시스템에서 셉틴 역학을 연구하는 접근법을 확립했습니다. 여기에 제시된 것은 서로 다른 막 맥락에서 셉틴 어셈블리를 관찰하는 세 가지 보완적인 방법입니다 : 평면 이중층, 구형 지지대 및 막대 지지대.

생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성

여기에서는 단일 분자 전반사 형광(smTIRF) 현미경을 사용하여 인공 군집 지질 막에서 단일 분자의 결합, 이동성 및 조립을 수행하고 분석하는 프로토콜이 제시됩니다.

단일 분자 확산 및 폴리머가 밀집된 지질 막에서의 조립

이 글은 고체 지지 지질 이중층에서 단일 단백질 추적용 샘플을 만드는 방법에 대해 상세히 설명합니다. 또한 단일 분자 감도와 빠른 프레임 속도를 가진 단순한 형광 현미경을 설명해 줍니다. 마지막으로, 단일 단백질 궤적을 추출하는 절차를 개괄합니다.

형광현미경을 이용한 지질 이중층 내 단일 단백질 추적

배우세요 용매 보조 지질 이중층 방법으로 고체 기판 위에 지지된 생체막을 제작하는 기술을. 형광 현미경과 석영 결정 미세저울을 활용하여 막의 유동성과 콜레스테롤 함량을 정량 분석하고, 약물 발굴 및 분자 진단 연구에 활용할 수 있습니다.

용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법에 의해 생체막 제작

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